이 연구의 전반적인 목적은 공동 배양에 있는 M1 대식세포 4T1 마우스 유방 암종 세포에 있는 phagocytic 활동의 시간 경과 2D 화상 진찰을 얻는 것입니다. 생명 세포 공동 배양 모델은 형광 및 차동 간섭 대비 현미경 검사법의 조합을 사용하여 확립 및 관찰되었다. 대식세포에 의한 식세포 활성의 평가는 이미지였습니다.이미징 소프트웨어를 사용하여 배양을 테스트하기 전에 다중 포인트 타임 랩스 비디오를 두 배로 늘렸습니다.
우리가 대식세포의 행동과 암세포를 가진 그것의 phagocytic 활동의 호닝의 필요 그리고 이득을 충족시키기 위하여 대략 실시한 문제. 구체적으로 연구에서 는 마우스 유방 암종입니다. 이 연구의 첫 번째 부분은 4T1 마우스 유방 암종 세포및 RAW 2647 마우스 대식세포의 살아있는 세포 공동 배양 모델로 시작됩니다.
41 마우스 유방 암종 세포와 RAW 2647 마우스 대식세포를 배양하여 실험을 시작합니다. 첫째, 4T1 및 RAW 2647 세포의 유리병을 해동한다. 15밀 원물 튜브에서 해동 된 세포를 10 mm로 희석시하십시오.
다음으로, 세포 펠릿을 얻기 위해 5 분 동안 660 g 힘으로 세포를 원심 분리합니다. 조심스럽게 미디어를 흡인하고, 완전한 매체의 8 밀에서 세포를 다시 중단하고 조직 배양 플라스크로 세포를 전송합니다. 37도에서 이산화탄소 5%로 세포를 배양합니다.
신봉 조건에서 배양의 1 주일 후, 매일 플라스크를 모니터링하고 필요에 따라 atmil 완전 매체와 보충. 다음 단계는 M1 편광 RAW 2647 대식세포의 면역 염색과 함께 계속됩니다. 이 단계는 M1 대식세포의 완전한 편광을 보장하는 것입니다.
RAW 2647의 합류가 70~80%에 이르면서 문화 매체를 폐기하고 PBS를 통해 두 번 부드럽게 헹구고 있습니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 부착 세포를 부드럽게 빼내고 50밀 원추형 튜브로 이송하여 수집을 위해 대식세포를 준비합니다. 혈류계를 사용하여 세포를 카운트하고 나머지 용액을 앉아 밀도에 추가하여 접시당 100, 000 세포의 밀도로 정지된 세포를 준비한다.
대식세포 현탁액 2mill을 두 개의 이미징 접시에 넣습니다. 세포 준수를 허용하기 위해 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 2~3시간 동안 세포를 배양합니다. 밀 LPS당 100nilligram과 밀 인터페론 감마 당 20 nilligram을 10 %의 FBS로 보충한 완전한 매체에 추가하여 M1 편광 매체를 준비하십시오.
이전에 배양한 대식세포에서 상복부 배양을 버리고 PBS를 사용하여 접시에 단층물을 두 번 조심스럽게 씻으십시오. 일치하는 접시 중 하나에 M1 편광 매체 의 2 밀을 추가하고 듀라 세포가 M1 대식세포 finnatype에 주입 할 수 있습니다. 면역 염색하기 전에, 4%의 파라포름알데히드의 2mill을 사용하여 RAW 및 M1 대식세포 세포를 고치고 실온에서 50분 동안 배양하십시오.
상체를 제거하고 PBS를 사용하여 세포 단층을 3 번 이상 세척하십시오. PBS에서 50mm 암모늄 염화암모늄 2밀로 담금질하고 실온에서 50분 동안 배양합니다. PBS에서 0.3% 트리톤 X-100을 실온에서 50분 동안 사용하는 퍼메아빌리즈.
PBS 실온에서 30분 동안 10% FBS를 사용하는 차단 단계. PBS에서 안티 iNOS 항체가 FITC를 컨쥬게이징하고 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 1 %의 FBS를 결합한 배양. 알루미늄 호일로 덮어 어두운 상태에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 DAPI 1 밀을 이미징 요리에 배양하십시오.
PBS를 사용하여 세포를 3회 이상 세척하고 DMEM 1mill을 일치하는 요리에 추가하고 형광 화상 진찰을 준비하십시오. 다음 단계는 4T1 마우스 유방 암종 세포의 파종으로 진행됩니다. 4T1 세포의 합류가 70~80%에 이르면 배양 매체를 폐기하고 PBS를 사용하면 두 번 부드럽게 헹구는 다.
미리 따뜻해지는 트립신 1mill을 추가하여 세포를 분리하고 섭씨 37도에서 최대 20분 동안 배양합니다. 세포가 부착 해제된 것처럼 나타나면 부착되지 않은 세포를 15mill 원문 튜브로 이송합니다. 그리고 본 튜브를 비활성화하기 위해 미리 따뜻워진 전체 매체 2 밀을 추가합니다.
세포 펠릿을 얻기 위해 5 분 동안 600 g 힘에서 원심분리기. 10밀 프리런 샘플링 DMEM 배지에서 상체를 제거하고 펠릿을 다시 중단한다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 100, 000 세포를 밀 DMEM으로 사용하여 계산합니다.
TC치료로 이들을 이미징으로. 다음 단계는 CFSE 염색을 사용하여 살아있는 4T1 마우스 유방 암종 세포를 표지하는 것입니다. 먼저, 이전에 4T1 세포로 시드된 이미징 접시에서 기존 미디어를 제거한다.
CFSE 염색 솔루션을 1mill PBS에 희석하여 5 개의 맥크말 (macrmal)을 동의합니다. CFSE 염색 용액 1mill을 이미징 접시에 추가하여 실온에서 20분 또는 어둠 속에서 섭씨 37도에 세포를 배양합니다. 세포에 DMEM과 스테인링 솔루션을 추가하고 5분 동안 시드를 허용합니다.
다음 단계는 4T1과 RAW2647 마우스 대식세포 및 공동 배양을 종자하는 것입니다. 4T1 세포의 CFSE 레벨링 후, PBS를 사용하여 이미징 접시를 두 번 씻으라. 4T1 이미징 접시에 대식세포 현탁액의 씨앗 2 밀.
다음 단계는 RAW 4627 대식세포를 M1 finnatype으로 편광하는 것입니다. M1 편광 매체 2mill을 상상 접시에 넣고 RAW 세포가 M1 대식세포 핀나타입에 주입되도록 합니다. 연구의 두 번째 부분은 M1 대식세포 phagocyted 4T1 세포의 시간 경과 평가입니다.
다음 단계는 살아있는 세포 비디오 현미경 phagocytosis 평가를 포함합니다. 첫째, 현미경을 켭다. 섭씨 37도에 온도를 설정합니다.
그리고 5%의 이산화탄소 가스. 공동 배양 세포를 스테이지 중앙에 배치하고 상단 챔버에 부드럽게 나사를 놓습니다. 조이스틱을 사용하여 캡처할 다른 위치를 선택하여 스테이지를 전동합니다.
라이브 셀 이미징을 수행하는 동안 고려해야 할 많은 요인이 있습니다. 꽤 작은 비디오를 얻으려면. 이미징 노출, 시간 측정 및 초점 보정 을 자동화해야 합니다.
동영상이 과도하게 노출되고 잘못된 시간 간격이 있고 초점이 바우지 않은 경우 비디오를 사용할 수 없게 됩니다. 이러한 요소 중 하나가 감지되면 실험반복을 수행해야 합니다. 그림 하나는 녹색에 안티 iNOS로 회전 면역 형광을 보여줍니다.
파란색의 핵 마커 DAPI. 그리고 대부분의 이미지의 향상된 버전. 영화 1은 M1 대식세포와 4T1을 이해하는 대표적인 라이브 셀 영화입니다.
CFSE는 대부분의 유방 암종 세포가 플로레스센트와 IC 현미경 검사법의 다중 채널 취득을 사용하여 포착된 공동 배양을 염색했습니다. 영화 2 라이브 셀 비디오 현미경 은 하나의 부부 접시에 멀티 포인트에서 영화. 유도된 M1 대식세포에 의한 4T1의 식증을 나타내는.
이미지는 13시간 동안 50분 간격으로 캡처되었습니다. 영화 3 라이브 셀 비디오 현미경 영화, M1 대식세포에 의해 4T1의 phagocytosis의 깊이 시각화를 보여주기 위해 선택된 단일 좌표점의. 적색 화살표는 M1 대식세포에 보여, 노란색 원은 4T1 세포의 숫자가 4T1 세포의 불소와 고프맨을 담금질 것을 보여줍니다.
M1 대식세포 이동-학은 4T1 마우스 메모리 암종으로 설명되어 상피 형태학을 가지고 있다. 대식세포는 세포 대 세포 접촉을 확립하기 위해 4T1 세포를 추가하기 위해 이동하는 것을 볼 수 있다. 그런 다음 M1 대식세포당 4T1 세포의 섭취가 뒤따릅니다.
이 비디오를 시청 한 후 당신은 라이브 셀 비디오 현미경 실험을 수행하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다;4T1 마우스 유방 암종과 RAW 2647 메라드 대식세포. 또한 phagocytosis 에세이를 수행하기 위해 두 세포 유형의 야간 공동 배양에 설정할 수 있어야합니다. LPS 및 인터페론 감마 대식세포와 4T1의 공동 경작자가 어떻게 이해해야하는지에 대해서도 이해해야합니다.
