الهدف العام لهذه الدراسة هو الحصول على التصوير 2D الفاصل الزمني للنشاط الفكتوري في الخلايا سرطانية M1 الضامة 4T1 ماوس في الثقافات المشتركة. تم إنشاء خلايا الحياة نموذج الثقافات المشتركة ولوحظ باستخدام مزيج من المجهر التفاضلي التفاضلي والتداخل التفاضلي. وكان تقييم نشاط البلعوم من قبل الضامة الصورة؛ وذلك باستخدام برامج التصوير لمضاعفة الفيديو الفاصل الزمني نقطة متعددة، قبل أن atesting الحضانة لدينا.
المسألة التي أجريناها على وشك تلبية احتياجات وفوائد شحذ في سلوك الضامة ونشاطها البلعوم مع الخلايا السرطانية. على وجه التحديد في الدراسة هو سرطان الماوس ماماري. يبدأ الجزء الأول من هذه الدراسة مع الخلايا الحية نموذج الثقافة المشتركة من خلايا سرطان الماوس 4T1 وخام 2647 الماوس الضامة.
تبدأ التجربة عن طريق زراعة 41 الماوس سرطان الخلايا الثديية وخام 2647 الضامة الماوس. أولاً، ذاب قارورة من خلايا 4T1 و RAW 2647. تمييع الخلايا المذابة في 10 ملليمتر في أنبوب مخروطي 15 مطحنة.
المقبل, الطرد المركزي الخلايا في قوة 660 ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. pirate بعناية وسائل الإعلام، وإعادة تعليق الخلايا في 8 مطحنة من وسائل الإعلام كاملة ونقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون.
بعد أسبوع واحد من زراعة تحت شروط الامتثال، ورصد قارورة يوميا وتكملة مع وسائل الإعلام atmil كاملة حسب الحاجة. تستمر الخطوة التالية مع الكبت المناعي للخامات الخام 2647 المستقطبة M1. هذه الخطوة هي لضمان استقطاب كامل من الضامة M1.
كما وصل التقاء RAW 2647 70 إلى 80 في المئة تجاهل وسائل الإعلام الثقافة وشطف بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني. إعداد الضامة لجمعها عن طريق إزاحة بلطف الخلايا الملتصقة باستخدام شطاف الخلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مطحنة. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتات وإعداد خلية معلقة بكثافة 100,000 خلية لكل طبق عن طريق إضافة الحل المتبقي إلى كثافة الجلوس.
الجلوس 2 مطحنة من تعليق الضامة في اثنين من أطباق التصوير. احتضان الخلايا 2-3 ساعات في 37 درجة مئوية مع 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون للسماح بانضمام الخلية. إعداد M1 الاستقطاب وسائل الإعلام عن طريق إضافة 100 nilligram لكل مطحنة LPS و 20 nilligram لكل مطحنة انترفيرون غاما في المتوسطة كاملة تكمل مع 10 في المئة FBS.
تجاهل الثقافات عظمى من الضامة المحتضنة من قبل وغسل بعناية monolayers في الطبق مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مطحنة من وسائط الاستقطاب M1 في واحدة من الأطباق مطابقة والسماح لخلايا دورا لضخ في M1 الضامة فينايب. قبل المناعة، وإصلاح خلايا الضامة RAW وM1 باستخدام 2 مطحنة من 4 في المئة شبهformaldehyde واحتضان لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إزالة مفحم وغسل الخلايا monolayer باستخدام برنامج تلفزيوني، على الأقل ثلاث مرات. إخماد مع 2 مطحنة من 50 ملليمتر كلوريد الأمونيوم في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Permeabilize باستخدام 0.3 في المئة تريتون X- 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
منع خطوة باستخدام 10 في المئة FBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة المضادة iNOS مترافق فيت في برنامج تلفزيوني واحد في المئة FBS بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. احتضان 1 مطحنة من DAPI في أطباق التصوير لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية في حالة مظلمة من خلال تغطية مع رقائق الألومنيوم.
غسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني على الأقل 3 مرات وإضافة 1 مطحنة من DMEM في أطباق مطابقة وجاهزة للتصوير الفلورسنت. الخطوة التالية المضي قدما مع البذر من 4T1 الماوس الخلايا سرطانية ماماري. كما التقاء الخلايا 4T1 تصل إلى 70 إلى 80 في المئة تجاهل وسائل الإعلام الثقافة وشطف لطيف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
إضافة 1 مطحنة من التربسين قبل الدافئة إلى إزالة ربط الخلايا والاحتضان لمدة تصل إلى 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بمجرد أن تظهر الخلايا دي المرفقة، نقل الخلايا دي المرفقة إلى أنبوب مخروطي 15 مطحنة. وإضافة 2 مطحنة من ما قبل الدافئة المتوسطة كاملة لactivate أنبوب ينظر.
الطرد المركزي في قوة 600 ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه في 10 طاحونة قبل أخذ العينات DMEM المتوسطة. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت والبذور 100، 000 الخلايا في مطحنة DMEM.
في تصوير هذه مع TC المعالجة. الخطوة التالية هي وضع العلامات المعيشة 4T1 الماوس سرطان الخلايا الثديية باستخدام تلطيخ CFSE. أولاً، قم بإزالة الوسائط الموجودة من طبق التصوير الذي كان قد سبق أن كان مُنبتًا في خلايا 4T1.
إعداد حل تلطيخ CFSE عن طريق تخفيف تلطيخ CFSE في 1 مطحنة PBS لجعل 5 macrmal خارج العمل الموافقة. إضافة 1 مطحنة من حل تلطيخ CFSE في طبق التصوير لاحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية في الظلام. إضافة على قدم المساواة من DMEM إلى الخلايا بالإضافة إلى حل تلطيخ والسماح للبذية لمدة 5 دقائق.
الخطوة التالية هي أن تُبذر ماوس RAW2647 و ثقافةً مُتشاركة مع 4T1. بعد تسوية CFSE من الخلايا 4T1، وغسل طبق التصوير مرتين، وذلك باستخدام برنامج تلفزيوني. البذور 2 مطحنة من تعليق الضامة في 4T1 طبق التصوير.
الخطوة التالية هي استقطاب 4627 الخام الضامة في النمط الفنلندي M1. إضافة 2 مطحنة من وسائط الاستقطاب M1 في طبق تخيل والسماح للخلايا RAW لضخ في M1 الفينايب الضامة. الجزء الثاني من الدراسة هو تقييم الفاصل الزمني للخلايا 4T1 الضامة M1.
وتشمل الخطوة التالية تقييم البلمائي المجهري للفيديو الحي. أولاً، قم بتشغيل المجهر. إعداد درجة الحرارة في 37 درجة مئوية.
و 5 في المئة غاز ثاني أكسيد الكربون. ضع خلايا الثقافة المشتركة في وسط المسرح وبرغي بلطف على الغرفة العلوية. استخدام عصا التحكم لالسيارات المرحلة عن طريق اختيار موقف مختلف ليتم التقاطها.
هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها أثناء إجراء التصوير بالخلايا الحية. للحصول على فيديو صغير جدا. وهو يتطلب تحسين التعرض للتصوير وقياس الوقت وأيضا أتمتة تصحيح التركيز.
في حالة عرض الفيديو ، فإن الفاصل الزمني غير الصحيح ، وكذلك خارج التركيز ، سيكلف الفيديو أن يكون غير قابل للاستخدام. وينبغي تكرار التجربة إذا تم الكشف عن أحد هذه العوامل. يظهر الشكل الأول الفلورات المناعية التي تتحول مع مضادات iNOS باللون الأخضر.
العلامة النووية DAPI باللون الأزرق. والإصدارات المحسنة من معظم الصور. فيلم 1 هو ممثل فيلم الخلية الحية لفهم الضامة M1 و4T1.
لطخت CFSE معظم الخلايا سرطان الثدي المشتركة الثقافات التي تم التقاطها باستخدام اقتناء متعدد القنوات من الفلورسنت والمجهر IC. فيلم 2 يعيش خلية الفيديو أفلام المجهر من متعدد النقاط في طبق الزوجية واحد. إظهار البلعوم من 4T1 بواسطة الضامة M1 المستحثة.
تم التقاط الصور على فترات 50 دقيقة لمدة 13 ساعة. فيلم 3 يعيش خلية الفيديو المجهري الفيلم، من نقطة إحداثي واحد اختيار لإظهار في عمق التصور من البلعوم 4T1 من قبل الضامة M1. الأسهم الحمراء يظهر إلى الضامة M1، دائرة صفراء تبين أن عددا من الخلايا 4T1 إخماد الفلورين و goffman من خلايا 4T1.
M1 الضامة التحرك علم وصف كما porocytoplasm كانت كما 4T1 سرطان الذاكرة الماوس لديها مورفولوجيا ظهارة. يمكن رؤية الضامة تتحرك لإضافة خلايا 4T1 لتأسيس اتصال خلية إلى خلايا. ثم يتبعه امتصاص خلايا 4T1 لكل الضامة M1.
بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد حول كيفية تنفيذ تجربة المجهر الفيديو حية الخلية؛ مع سرطان ماوس 4T1 mammary و RAW 2647 ماكروفات ميد. يجب عليك أيضا أن تكون قادرا على إعداد أكثر من ليلة الثقافات المشتركة لكلا النوعين الخلية لأداء مقال البلعميات. يجب أن نفهم أيضا على كيفية co-cultuers من 4T1 مع LPS و الضامة إنترفيرون غاما.
