이 방법은 잠재적인 세포질 타우 오염을 제외하면서 핵 구획에서 타우의 직접적인 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 세포 유형과 다른 세포 조건하에서 타우의 핵 기능에 대한 연구에 광범위하게 적용 가능하다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 지아코모 시아노, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다.
빈 대조군 벡터로 전염되는 5개의 SH-SY5Y 인간 신경아세포종 세포세포를 4회 10회 도금하여 시작하여, 태그가 없는 타우로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NLS로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NES에 4회 10회, 타우-NES에 잘 감염되는 5개의 세포에 4회 10회 를 감염한다. 도금 다음 날, 별도로 400 나노그램의 DNA와 양이온 지질의 적절한 양을 우물 당 250 마이크로리터의 1개의 튜브로 배양합니다. 실온에서 5분 후 각 벡터를 1부의 양이온 지질과 결합하고 실온에서 20분 동안 DNA 지질 복합체를 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 37섭씨에서 하룻밤 배양을 위한 적절한 DNA 지질 복합 용액과 함께 각각 2밀리리터의 신선한 완전한 배양 배지와 트랜스펙트의 2밀리리터로 각각 의 수퍼네티츠를 대체한다. 다음 날, 슈퍼네티츠를 신선한 분화 매체로 대체하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 위해, PBS와 각각 잘 각 우물에서 전염 및 분화 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 4 분 동안 잘 당 0.1 %의 500 마이크로 리터로 세포를 배양한다.
세포가 분리되면, 완전한 매체의 동등한 부피로 반응을 멈추고 각 우물에서 각 우물에서 원심분리를 위한 개별 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 수퍼네이션을 조심스럽게 제거한 후, 두 번째 원심분리를 위해 튜브당 PBS의 1밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 슈퍼네티츠를 다시 제거한다. 총 단백질 추출물의 경우, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 용해 완충제의 50~100마이크로리터에서 30분 동안 펠릿을 얼음에 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리기 추출물을 16, 000배 g에서 15분간, 임의의 표준 정량화 분석으로 단백질 농도를 정량화한다. 그런 다음 각 단백질 샘플 20 마이크로그램을 4X Laemmli 버퍼 5개마이크로리터와 총 20마이크로리터에 혼합하고 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 끓입니다. 세포 전분획의 경우, 계산을 위해 전체 배지에서 세포를 다시 중단하고 샘플당 6개의 세포로 10번 아래로 회전합니다.
세포균 분획을 격리하려면 펠릿을 100 마이크로리터의 얼음 차가운 세포질 추출 버퍼에 10분 동안 부드러운 혼합으로 섭씨 4도의 프로테아제 억제제로 보충합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 미리 차가운 튜브로 슈퍼 네이션을 전송합니다. 프로테아제 억제제로 보충된 100마이크로리터의 얼음 냉막 추출 버퍼를 펠릿에 넣고 4°C에서 부드러운 믹싱을 10분간 배양합니다.
그런 다음 4섭씨 에서 5분 동안 펠릿을 원심분리하고 3, 000배 g로 펠릿을 수집하고 수퍼네티츠를 새로운 튜브로 수집합니다. 수용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제로 보충된 50마이크로리터를 펠릿에 넣고 30분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다.
불용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제, 염화칼슘 및 미세 코칼 뉴클레아제로 보충된 50개의 핵 추출 버퍼를 소용돌이가 있는 펠릿에 추가합니다. 피질 및 원심분리 전에 섭씨 37도에서 5분간 샘플을 배양합니다. 그런 다음 초월체를 수집합니다.
사이토셀레탈 분획을 수집하려면, 피질이 있는 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 시토스켈레탈 추출 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 잠복 후 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다. SDS-PAGE 분석을 위해, 수집된 각 세포극 분수 샘플의 20 마이크로리터에 4X Laemmli 버퍼의 7개의 마이크로리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 100도에서 샘플을 끓입니다.
인큐베이션이 끝나면 샘플을 아크릴아미드 젤에 적재하고 120볼트의 일정한 전압으로 전기포전을 수행합니다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 90분 동안 250밀리암페어로 옮킵니다. Ponceau 염색 용액에서 5분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기포고증과 성공적인 블로팅을 확인합니다.
인큐베이션이 끝나면, 백그라운드가 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구고 셰이커에서 10분 동안 Tween 20으로 보충된 트리스 버퍼링 식염수로 연속 세척하여 얼룩을 제거합니다. 다음으로, 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 20을 세척당 5분간 세 번 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액을 차단하여 멤브레인을 배양합니다. 마지막 세척 후, 4섭씨에서 밤새 차단용에 대한 관심의 1차 항체와 멤브레인을 혼성화하고 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 5분 동안 3개의 세척으로 한다.
마지막 세척 후, 적절한 고추냉이 과록시다제 공액으로 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 차단한 이차 항체로 혼합한 후 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 세척당 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 감지하고 ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화. 망막산과 뇌 유래 신경영양인이 없는 경우, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태학을 가정하고 세포 덩어리를 형성한다.
예상대로, 망막산으로 5 일 치료 후, 덩어리가 풀림과 세포가 확산. 뇌 유래 신경 영양인을 가진 처리의 3 추가 일 후에, 세포는 분지 중성염의 네트워크를 통해 균일하게 분포되고 상호 연결된 나타납니다. 타우-NLS 또는 타우-NES 경질 후, 타우 아세포 지역화는 항타우 항체를 가진 면역 형광에 의해 검출될 수 있다.
배혈의 효율에 따라, 세포는 타우-NLS 트랜스페션 후 DAPI 신호와 병합되는 강력한 핵 염색 또는 타우-NES 후 빈 핵과 세포질 얼룩을 표시한다. 웨스턴 블롯 분석은 세포골격 분획 내의 액틴의 농축, 세포질 및 세포골격 분획 내의 튜룰린, 핵 분획 내의 H2B를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 총 추출물에서 핵 구획 및 vesicular 조미료 수송기 1발 내에서 태그가 지정되고 태그되지 않은 타우의 발현을 확인합니다.
실제로 용해성 핵과 세포질 분획에서 타우의 비율은 타우-NES가 감소하는 동안 수용성 핵 분획에서 타우-NLS가 매우 풍부하다는 사실을 강조합니다. 또한 타우-NLS는 세포질 분획에 대하여 크로마틴 결합 분획이 풍부해지며 타우-NES는 감소한다. 각 샘플의 분획에 사용되는 세포의 수를 주의 깊게 확인하고 적절한 분획에서 하우스 키핑 유전자의 농축을 확인해야합니다.
이 비디오를 시청한 후 셀룰러 구획을 분리하고 핵에서 타우의 기능적 역할을 평가할 수 있어야 합니다.
