우리의 프로토콜은 세포와 조직 사이 작은 분자 화학 통신을 지도할 수 있고, 우리는 난소암 전이에 있는 작은 분자를 탐구하기 위하여 이것을 구체적으로 적용했습니다. 우리의 기술의 주요 장점은 2D에서 세포와 조직의 공간 무결성을 유지하면서 레이블이없는 방식으로 작은 분자를 측정하는 능력입니다. 이 기술은 우리가 표적으로 하지 않은 방식으로 난소암 전이에 있는 작은 분자의 기여를 심문하는 것을 허용했습니다.
이것은 이전에 간과된 새로운 치료 표적 및 통로를 공개할 수 있었습니다. 이 방법론은 아가로즈에서 재배될 수 있는 그밖 암 및 공간 성분이 결과 세포 표현형에 중요할 지도 모르다 그밖 질병으로 쉽게 확장될 수 있었습니다. 모든 세포와 성분이 손에 있고 건조 공정에 대한 인내심이 이 프로토콜에 필수적입니다.
급하게 탈수 단계는 종종 품질이 좋지 않은 질량 분석 데이터로 이어질 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 이러한 agar에 조직 이나 미생물을 사용 하는 일반적인 이미징 질량 분광 실험에서 크게 탈피로, 우리의 샘플 준비 및 건조 단계를 이해에 도움이 됩니다. 시작하려면, 뜨거운 접시에 섭씨 70도에서 아가로즈를 액화.
ITO 처리 슬라이드 위에 8웰 디바이저를 놓습니다. 표준 트립신 치료를 통해 15밀리리터 원뿔관, 원심분리기에서 MOE 세포를 수집하고 150 마이크로리터당 50, 000 세포의 농도를 얻기 위해 DMEM 미디어를 1회 추가하여 최종 밀도의 2배에 달한다. 분할되지 않은 동문화의 경우, 집게를 사용하여 4개의 우물의 중앙에 난소 절박을 추가하십시오.
도금 직전에 200 마이크로리터의 세포 현탁액과 200 마이크로리터를 개별 2밀리리터 튜브에 결합합니다. 파이펫팅 중에 기포를 피하십시오. 즉시, 각 우물에 세포 아가로즈 혼합물의 300 마이크로 리터를 추가하고, 우물 사이에 누출또는 혼합을 보장하기 위해 분배에 연속 부드러운 하방 압력을 적용합니다.
기포가 없고 난소가 우물 중앙에 남아 있는지 확인하십시오. 파이펫 아가로즈가 난소를 방해하는 경우 파이펫 팁을 사용하여 아가로즈가 식기 전에 중앙에 부드럽게 사용하십시오. 그런 다음 가습 된 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 슬라이드를 배양하십시오.
분할 된 공동 문화의 경우 얇고 매끄러운 플라스틱에서 분리를 잘라냅니다. 멸균, 일회용 미디어 분지의 측면이 사용됩니다. 우물의 저혈압에 꼭 맞을 만큼 충분히 넓게 자른다.
ITO 처리 슬라이드 위에 8웰 디바이저를 놓고 플라스틱 칸막이를 대각선으로 우물에 삽입합니다. 이전에 수행된 세포 배양을 준비하고, 세포 현탁액 100 마이크로리터와 액화 아가로즈 100마이크로리터를 2밀리리터 튜브에 결합한다. 즉시, 분배기의 한쪽에 세포 아가로즈 혼합물의 150 마이크로리터를 플레이트하면서 디바이더에 하향 압력을 유지합니다.
아가로즈가 식히고 약 1분 동안 굳게 유지한 다음 디바이더를 제거합니다. 집게를 사용하여 난소가 우물의 빈 반쪽의 중앙에 절전을 배치합니다. 난소 위에 세포 아가로즈 혼합물 150 마이크로리터를 추가합니다.
가습 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 슬라이드를 배양합니다. 4 일 후, 아가로즈 플러그에서 챔버 분배를 제거합니다. 평평한 주걱으로 아가로즈의 측면을 챔버에서 분리하고 챔버를 부드럽게 위로 당깁니다.
아가로즈 플러그가 이동되면 부드럽게 재배치하여 서로 만지지 않도록 합니다. 슬라이드를 섭씨 37도 오븐에 약 4시간 동안 넣고 매시간 90도 회전하여 샘플 전체의 열 분포를 보장합니다. 슬라이드는 완전히 건조해야합니다.
그렇지 않으면 MALDI-TOF 질량 분광계의 고진공 환경에서 시료의 폭발을 초래할 수 있다. 슬라이드를 건조하고 진행 상황을 모니터링하는 것이 높은 공간 해상도와 고품질 질량 스펙트럼을 달성하는 가장 중요한 단계입니다. 박리 또는 과도한 주름이 발생하는 경우 질량 분석 데이터를 수집하는 것이 좋습니다.
행렬 분무기에 설정된 매개 변수를 사용하여 슬라이드에 행렬 솔루션을 적용합니다. 인 레드를 교정역으로 사용하려면 슬라이드의 선명한 지점에 인레드 마이크로리터 1개를 추가합니다. 펩티드 혼합물을 교정제로 사용하려면 파라필름의 매트릭스와 일대일 비율로 혼합하여 이온화를 돕고 0.5~1마이크로리터를 슬라이드에 반점한다.
대량 분광법 데이터 수집을 이미징하기 전에 교정이 건조할 때까지 기다립니다. 슬라이드의 각 모서리에 영구 마커를 사용하여 X를 그리고 1200 dpi의 카메라 또는 스캐너를 사용하여 광학 이미지를 그립니다. 이 실험에서는 최적의 건조 된 ITO 슬라이드를 보장하기 위해 오븐에서 슬라이드를 주의 깊게 모니터링하는 것이 필수적이며, 이로 인해 아가로즈 표면에서 주름이 거의 없는 평평한 건조 시료가 발생합니다.
이 그림은 피해야 할 주름을 보여줍니다. 주름은 약간 높이에 영향을 미치므로 이미징 질량 분석 신호의 질량 정확도에 영향을 줄 수 있습니다. 약간의 주름은 데이터의 품질에 영향을 미치지 않습니다.
최적으로 위치한 조직은 가능한 한 중심에 가깝어야합니다. 사용 된 조직은 IMS 데이터의 수집이 가장자리 효과로 오염되지 않도록 분할된 경우 분할되지 않았거나 반 삼각형의 중심에 있어야합니다. 심하게 배치 된 조직은 이미지화 될 때 가장자리 효과에서 거짓 질량 신호를 초래할 수 있습니다.
건조 된 슬라이드 이미지는 MALDI-TOF 질량 분광계를 이미지하는 영역을 가르치는 데 사용됩니다. 난소 조직 의 주위에 작은 지구는 50 마이크로미터에서 IMS를 위해 선택되었습니다. m-over-z 신호의 대표적인 이미지는 분할되지 않은 공동 문화뿐만 아니라 분할 챔버 설정에 대해 서도 표시됩니다.
기억해야 할 가장 중요한 점은 결과 데이터가 샘플 준비만큼만 좋다는 것입니다. 건조 공정에 특별한 주의를 기울이십시오. 가장 흥미로운 측면은 침략 해석 또는 식민지 화 소과 같은 다른 실험을 사용하여 이 방법으로 발견 된 작은 분자를 검증하여 효과적인 농도에 알리고 인간 생물학으로 변환하는 것입니다.
우리는 이것이 난소암의 1 차적인 메타신사에 있는 프로세스를 더 잘 이해해서 난소암을 위한 잠재적인 치료 표적의 새로운 통로를 발견하기 위하여 문을 열 것이라는 점을 기대합니다.
