지질 방울 생물학에 대한 연구는 정화의 어려움에 의해 방해되고있다. 또한, 세포 지질 플럭스를 연구하려면 여러 세포기관의 동시 정화가 필요하며 현재 간단한 프로토콜을 사용할 수 없습니다. 이 기술의 주요 장점은 지질 방울 정제에 더 접근 할 수 있도록하는 것입니다.
우리는 동시에 하나의 샘플에서 지질 방울, 폐증 망상 및 리소좀을 분리하기 위해 시판 가능한 키트를 수정했습니다. 간 지질 방울 축적은 진보적 인 간 질환에 비만과 알코올 환자를 걸리기 쉽게. 이것은 불활성 저장 구획에서 역동적인 생물학적으로 중요한 세포기관으로 지질 방울의 보기를 옮겼습니다.
시작하려면 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 후면 전방 축에서 안락사 마우스의 복부의 피부와 근육 층을 절단하여 간을 노출시하십시오. 내장에 간을 연결 하는 인대를 잘라. 집게를 사용하여 창자를 간에서 뒤쪽으로 끌어당깁니다.
횡격막에 간을 연결하는 인대를 잘라. 그런 다음 간과 등간 흉곽 사이를 잘라 내고 앞쪽에서 후방으로 이동하여 간이 해방될 때까지 절단합니다. 감기 1x PBS10밀리리터로 차가운 5센티미터 페트리 접시에 간을 옮기고, 감기 10밀리리터의 10밀리리터에서 4°C에서 5분간 흔들기 플랫폼에서 간을 두 번 씻습니다.
마지막 세척 후, 1x PBS를 부어, 접시 내에서 3 ~ 5 밀리미터 조각으로 간 을 주사위 크기 10 멸균 수술 블레이드를 사용합니다. 그런 다음, 4섭씨에서 5분간 10밀리리터의 감기 1x PBS로 다진 간을 두 번 씻는다. 1x PBS를 데치고, 다진 간 조각을 차가운 45밀리리터 Dounce 균질화제로 옮겨 모든 조각이 바닥에 있는지 확인합니다.
차가운 1x IE 버퍼 7밀리리터를 추가합니다. 유봉을 위아래로 20번 이동하여 얼음에 균질화하여 각 스트로크 동안 유봉이 균질화의 바닥으로 이동하도록 합니다. 차가운 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 균모를 옮긴다.
차가운 1x IE 버퍼의 1밀리리터로 균질화제를 헹구고 나머지 균질화에 추가합니다. 핵을 제거하기 위해, 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 1, 000 배 g에서 대용량 원심분리기에서 동형포를 원심분리합니다. LD 손실을 방지하기 위해 15 밀리리터 튜브 의 상단에 수집 된 지질이 다시 중단되었는지 확인하십시오.
튜브 바닥에 핵 펠릿이 방해받지 않도록 하고, 지질 함유 후 핵 수퍼나탄을 신선한 차가운 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮춥시다. 나중에 순도 분석을 위해 얼음에 차가운 1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 핵 후 상체의 100 마이크로 리터 알리쿼트. 미토콘드리아를 제거하기 위해 핵 후 상신전지 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000배의 냉장 된 고속 원심분리기에서 원심분리합니다.
튜브 상단에 모인 지질이 LD 손실을 방지하기 위해 다시 중단되었는지 확인하고 미토콘드리아 후 상류체를 13 밀리리터 초센심분리기 튜브로 옮기십시오. 미토콘드리아 후 상체의 100 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 얼음에 차가운 1.7밀리리터 미세원심분리기 튜브로 전달하여 나중에 순도 분석을 한다. 초원심분리기 튜브를 미토콘드리아 후 상퍼로 차가운 1x IE 버퍼로 가장자리에 채우고 초원심 분리 중에 붕괴되는 것을 방지합니다.
샘플을 균형, 다음 초원심 분리기에서 원심 분리기 100, 000 시간 g에 60 섭씨에서 60 분. LD 층을 제거하려면 튜브를 45도 각도로 기울이고 유리 파이펫으로 흡입합니다. 펠릿을 차가운 1.7 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮김한 후 순도 분석을 위해 지질 층 하에서 ER 후 퍼네티드 100마이크로리터를 수집한다.
모든 세포 파편을 펠렛하기 위해, 섭씨 4도에서 5 분 동안 최고 속도로 미세 원심 분리기에서 원심분리기. 그런 다음, LD 층을 다시 중단하는 데 도움이 손으로 튜브를 부드럽게 따뜻하게하고, 새로운 1.7 밀리리터 미세 센실리후체 튜브로 지질 층을 포함한 상체를 전송합니다. 펠릿이 더 이상 보이지 않게 될 때까지 튜브를 2~3회 따뜻하게 하면서 이러한 세척 단계를 반복합니다.
그런 다음 펠릿이없는 LD 수퍼나탄을 세척하려면 1.5 밀리리터의 최종 볼륨에 1x PBS를 추가하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 최고 속도로 미세 원심 분리기에 원심 분리기를 넣습니다. 유리 파이펫을 사용하여 지질 층을 방해하지 않고 지질 층 아래에있는 1 x PBS의 1 밀리리터를 제거하십시오. 1x PBS가 탁도 없이 시각적으로 투명할 때까지 LD 세척을 4~5회 반복합니다.
그런 다음 유리 파이펫을 사용하여 지질 층 아래의 모든 1x PBS를 제거하고 다운스트림 분석을 위해 생성된 순수 LD 분획을 사용합니다. 대표적인 20x 형광 및 브라이트필드 LD 이미지가 ER 키트 LD 절연 및 자당 LD 격리 방법 모두에서 촬영되었을 때, 그들은 유사한 수준의 미립자 물질을 밝혀 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 유사한 순수성을 시사합니다. 정제에 이어, LD 트리글리세라이드 및 단백질 수준은 색소측정을 사용하여 측정되었고, 데이터는 간 체중으로 정상화되었고, 시작 물질이 정상화될 때, LD 트리글리세라이드 및 단백질 수율은 ER 키트 및 자당 방법을 사용하여 유사했다.
LD 직경은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화되었으며, ER 키트 LD 절연 및 자당 LD 절연이 유사한 크기의 LD를 산출한 것을 보여 주었다. LD 순도를 평가하기 위해, 샘플은 면역 blotting에 의해 분석되었다, ER 키트 LD 절연 및 자당 그라데이션 프로토콜모두에서 파생 된 LD가 모두 동일한 순도를 가지고 있음을 보여. PLIN2, LD 마커, ER 키트 LD 절연 PER 및 자당의 PNS를 제외한 모든 샘플에서 검출되었다.
면역 blot를 사용하여 ER 분획의 순도 분석은 LD 마커 PLIN2의 자유롭지만 ER SEC61A 단백질의 중요한 수준을 가졌다는 것을 보여줍니다. 리소솜 농축 키트를 이용한 리소좀의 추가 정화 후 리소솜 분획의 순도도 도 평가되었다. 디스커버리는 현재 프로토콜의 가장 유용한 응용 프로그램입니다.
우리는 정제 된 세포기관에서 지질학을 수행하고, 리포톡신은 알코올 성 간 질환의 지질 방울에서 특히 증가하는 것으로 나타났다.
