脂質滴生物学の研究は、精製の難しさによって妨げられてきた。さらに、細胞の脂質フラックスを研究するには、複数のオルガネラを同時に精製する必要があり、現在は簡単なプロトコルはありませんでした。この技術の主な利点は、脂質滴の精製をよりアクセスしやすくすることです。
市販のキットを改変し、脂質滴、小胞体、リソソームを単一の試料から同時に分離しました。肝脂質液滴蓄積は、進行性肝疾患に肥満およびアルコール患者を素因とする。これは、脂質液滴の見解を不活性貯蔵区画から動的に生物学的に重要な小器官に移した。
まず、無菌鉗子と解剖はさみを使用して、後方前軸上の安楽死マウスの腹部の皮膚および筋肉層を切断し、肝臓を露出させる。肝臓と腸をつなぐ靭帯を切る。鉗子を使用して、肝臓から後部に向かって腸を引き離す。
肝臓と横隔膜をつなぐ靭帯を切る。次いで、肝臓と胸部の間を切り取り、前部から後部に移り、肝臓が遊離するまで行う。肝臓を10ミリリットルの冷たい1x PBSで冷たい5センチメートルのペトリ皿に移し、10ミリリットルの冷たい1x PBSのロッキングプラットフォームで肝臓を摂氏4度で5分間洗います。
最後の洗浄の後、1x PBSを注ぎ、サイズ10の無菌外科ブレードを使用して、肝臓を皿の中の3〜5ミリメートルにサイコロ化します。その後、10ミリリットルの冷たい1x PBSで2回、摂氏4度で5分間洗浄します。1x PBSをデカントし、ダイスした肝臓片を冷たい45ミリリットルのDounceホモジナイザーに移し、すべての部分が底部に収まっていることを確認する。
7 ミリリットルのコールド 1x IE バッファーを追加します。害虫を上下に20回動かして氷の上で均質化し、各ストローク中に害虫がホモジナイザーの底に行くことを確認します。ホモゲネートを冷たい15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
1ミリリットルの冷たい1x IEバッファーでホモジナイザーをリンスし、ホモジネートの残りの部分に加えます。核を除去するために、ホモゲネートを摂氏4度で10分間1,000倍の高容量遠心分離機で遠心分離する。LD損失を防ぐために、15ミリリットルチューブの上部に集まった脂質が再懸濁されることを確認してください。
チューブの底部の核ペレットが乱れないように、脂質含有核内の核内上清を新鮮な冷たい50ミリリットル遠心管に移す。核上清の100マイクロリットルのアリコートを氷上の冷たい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、後で純度分析を行います。ミトコンドリアを除去するために、冷蔵高速遠心分離機で核後上清サンプルを摂氏4度で15分間15分間遠心分離する。
チューブの上部に集まった脂質がLD損失を防ぐために再懸濁されていることを確認し、ミトコンドリア後の上清を13ミリリットルの超遠心チューブに移します。ミトコンドリア上清の100マイクロリットルアリコートを氷上の冷たい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、後で純度分析を行います。超遠心分離管をミトコンドリア上清で満たし、冷たい1x IEバッファーでつばを塗り潰し、超遠心分離中に崩壊するのを防ぎます。
サンプルのバランスをとり、100,000倍gの超遠心分離機で摂氏4度で60分間遠心分離します。LD層を除去するには、チューブを45度の角度で傾け、ガラスピペットで吸引します。ペレットを冷たい1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移した後、脂質層の下に100マイクロリットルのポストER上清を集めて純度分析を行います。
任意の細胞の破片をペレットするには、摂氏4度で5分間最高速度でマイクロ遠心分離機で遠心分離機。次に、LD層を再懸濁させる手で管を穏やかに温め、脂質層を含む上清を新しい1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。これらの洗浄工程を繰り返し、チューブを2〜3回温め、ペレットが見えなくなるまで繰り返す。
次に、ペレットフリーLD上清を洗浄し、最終体積1.5ミリリットルに1倍のPBSを加え、最高速度で遠心分離機に4°Cで5分間遠心分離します。ガラスピペットを使用して、脂質層を乱すことなく、脂質層の下にある1x PBSの1ミリリットルを除去します。LD洗浄を4~5回繰り返し、1x PBSが濁りなく視覚的に透明になるまで繰り返します。
次いで、ガラスピペットを用いて、脂質層の下の全1倍のPBSを除去し、そして得られた純粋なLD画分を下流分析に使用する。代表的な20x蛍光および明視野LD画像をERキットLD分離法とスクロースLD分離法の両方から撮影した場合、同様のレベルの粒子状物質が明らかになり、2つの異なるプロトコルを使用して同様の純粋性が示唆された。精製後、LDトリグリセリドおよびタンパク質レベルを比色アッセイを用いて測定し、データを肝重量に正規化し、出発物質を正規化すると、LDトリグリセリドとタンパク質収率がERキットとスクロース法を用いて類似していたことを示した。
LD径を画像解析ソフトウェアを用いて定量化し、ERキットLD分離とスクロースLD分離が同様のサイズのLDを生み出したことを示した。LD純度を評価するために、サンプルを免疫ブロット法によってアッセイし、ERキットLD単離およびショ糖勾配プロトコルに由来するLDが共に等純度であることを示した。PLIN2(LDマーカー)は、ERキットLD分離PERおよびスクロースのPNSを除くすべてのサンプルで検出された。
免疫ブロットを用いたER画分の純度分析は、LDマーカーPLIN2を含まないが、ER SEC61Aタンパク質の有意なレベルを有していたことを示している。リソソーム濃縮キットを用いたリソソームのさらなる精製後のリソソーム画分の純度も評価した。現在、検出はプロトコルの中で最も有用なアプリケーションです。
精製された小器官でリピドミクスを行い、アルコール性肝疾患における脂質滴においてリポトキシンが特異的に増加することを示した。
