이 방법은 특정 세포 과립에 약물을 전달하는 방법과 같은 약물 전달 영역에서 핵심 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가스의 핵 전좌가 빛에 의해 유도될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹의 졸업생 인 리나 모가키와 아리사카 아키오입니다.
다른 곳에서 자세히 설명된 바와 같이 케이지 분자 접착제를 합성하여 양자점 연계 케이지 분자 접착제를 준비하기 시작한다. 건조 DMSO에 있는 caged 분자 접착제 연결된 dibenzocyclooctyne의 10 밀리머 스톡 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 먼저 aseye 기능화 퀀텀닷을 만들어 서 케이지 분자 접착제를 연결 한 퀀텀닷을 준비합니다.
이를 달성하기 위해 DMF에 125 마이크로 몰라 아세아이 PEG4 NHS 에스테르의 100 마이크로 리터를 Amine 기능화 페그로 코팅된 양자 점의 500 나노 몰라를 포함하는 DMF 용액의 400 마이크로 리터에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 생성된 용액을 재생셀룰로오스 멤브레인에 배치하고 800ml의 DMF에 대해 24시간 동안 투석합니다.
다음으로 dMF를 사용하여 디벤조사이클로오틴과 연결된 케이지 분자 접착제의 스톡 솔루션을 희석하고 투석 후 용액에 200 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 3시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 그런 다음 25000의 분자량이 잘린 재생셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 신선한 DMF 800ml에 대해 24 시간 동안 생성된 혼합물을 투석합니다.
24시간 후 DMF를 사용하여 200 나노몰러로 생성된 용액을 희석시켰습니다. 표준 배양 조건하에서 10%의 FBS를 함유하는 이글의 최소한의 필수 배지에서 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포를 유지하십시오. 실험 전 하루 전에 5000 HEP3 B 세포는 배양 배지의 200 마이크로리터에서 8 개의 챔버 유리 슬라이드의 각 우물로.
그런 다음 슬라이드를 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 배양 배지를 제거하고 미리 따뜻워진 PBS 의 100 마이크로리터로 세포를 두 번 헹구는 다. 8 개의 챔버 슬라이드의 각 우물에 형광으로 염색 된 분자 접착제의 10 마이크로 몰라를 포함하는 FBS 무료 배지 200 마이크로 리터를 추가합니다.
3시간 동안 배양후 배양 배지를 제거하고 PBS의 100마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는다. 내모를 시각화하기 위해 LysoTracker Red와 같은 추가 적색 형광 염료의 100 나노 몰라를 포함하는 배양 매체의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 결과 셀 샘플을 20분 동안 배양합니다.
그런 다음 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 그 후 세포를 배양 배지의 200 마이크로리터로 되돌려 보입니다. 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제의 핵 전역을 유도하기 위해 세포는 365 나노미터 밴드패스 필터를 장착한 100와트 크세논 광원 아래에 배치한다.
세포를 UV 광에 2분 동안 노출시다. 이 시간 동안 어둠 속에서 UV 노출없이 제어 셀 샘플을 유지합니다. 유리 기판의 뚜껑은 효율적인 UV 노출을 위해 벗을 수 있지만 UV 광에 장기간 노출되면 세포 사멸을 일으킬 수 있으므로주의하십시오.
핵을 시각화하려면 배양 배지에 Hoeschst 얼룩의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 결과 셀 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 단계에 샘플을 배치합니다.
형광으로 염색 된 분자 접착제, LysoTracker 빨간색 및 핵 얼룩에 대한 현미경 그래프를 기록합니다. 앞서 나타난 바와 같이, 종자 5000 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포는 24시간 동안 표준 조건하에서 8개의 잘 챔버 슬라이드 및 배양의 각 우물으로 한다. 형광으로 염색된 분자 접착제를 포함하는 FBS 자유 배양 배지의 200 마이크로리터를 세포 샘플을 공급한다.
결과 셀 샘플을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 배양 배지의 200 마이크로 리터로 세포를 반환합니다.
그런 다음 샘플 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 적용을 받으며 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 현미경 을 기록한다. 이전에 도시된 시드와 같이 종자 5000 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포는 24시간 동안 표준 조건하에서 8개의 잘 챔버 슬라이드 및 배양의 각 우물으로 한다. 양자점 연결 된 분자 접착제의 10 나노 몰라를 포함 하는 FBS 무료 배양 배지의 200 마이크로 리터와 세포 샘플을 공급.
결과 셀 샘플을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 중간을 제거하고 PBS의 100 마이크로 리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 세포를 헹구고 배양 배지의 200 마이크로 리터로 돌려보도록 한다.
그런 다음 365 나노미터 밴드패스 필터가 장착된 100와트 크세논 광원 아래에 플레이트를 놓습니다. 세포 샘플을 UV 광에 2분 동안 노출하여 대조군 샘플을 어둠 속에서 유지합니다. 핵을 시각화하려면 배양 배지에 Hoechst 얼룩의 마이크로리터 1을 추가합니다.
결과 셀 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다. 인간 간세포 암 HEP3 B 세포를 96 개의 잘 배양 플레이트로 잘 당 5000 세포에서 실험 전날 종자.
그런 다음 200 마이크로리터의 배양 매체로 세포를 덮은 다음 24 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 그런 다음 0.1에서 100 마이크로몰라에 이르는 농도에서 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제를 함유한 FBS 자유 배양 배지 200마이크로리터를 첨가한다.
플레이트를 3시간 동안 배양한 다음 UV 광원 아래에 접시를 놓습니다. 세포 샘플을 UV 광에 2분 동안 노출하여 대조군 샘플을 어둠 속에서 유지합니다. 세포 계수 키트-8 시약의 10 마이크로리터에서 UV 노출에 이어 배양 배지에 대한 시약을 배양하고 결과 세포 샘플을 2시간 동안 배양한다.
그런 다음 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 샘플의 흡수를 읽습니다. 사진 방사선 전에 HEP3 B 세포는 형광으로 염색된 분자 접착제로 배양되어 내부에서 형광 방출을 천박하게 하여 LysoTracker Red를 나타내는 유사 현미경 그래프는 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제가 내분에서 국소화되었다는 것을 나타낸다. 이에 따라 형광염색된 분자 접착제에 할당가능한 형광 방출은 UV 방사선 이전에 세포 핵 외부에서 관찰되었다.
UV 방사선 후에 형광은 형광으로 염색된 분자 접착제가 세포질과 세포 핵으로 감금되고 이동되었다는 것을 건의합니다. 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제의 이러한 핵 번역은 적외선 근처의 2-광자에 의해 선택적으로 부위를 유도할 수 있다. 비조사 부위에 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제는 내분에서 벗어나지 않았고 형광을 천공하는 것으로 남아 있었다.
수지상 케이지 분자 접착제 태그는 양자점과 같은 거대 분자 손님을 세포 핵으로 전달할 수도 있습니다. 이러한 컨쥬게이트는 세포로 채택될 수 있으며 UV 노출 후 2분 동안 양자점의 형광 방출은 핵 내에서 볼 수 있다. 이 개발 후이 기술은 낮은 부작용 치료를 탐구하는 유전자 치료의 분야에서 연구원을위한 길을 포장.
