Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
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우리는 감사 독일 연구 재단 (DFG)에 재정 지원 (Nr. RO2414/5-1 선급을 부여).

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저자는 공개 없다.

여기 우리는 어떻게 그들이 다른 실험 조건에서 응용 프로그램에 대 한 최적화할 수 있습니다이 문서에 설명 된 기술에 중요 한 단계를 논의.
Microinjection 셀에 외 인 단백질, 억제제, 또는 약물 소개에서 인스턴트 효과 모니터링에 적용 될 수 있는 방법입니다. 그것은 특히 어려운에 단백질의 기능을 결정 하기 위한 유리한 수 transfect 세포 종류를 또는 장기 식 하지 원하는 상황에서. 그것은 특정 종류의 세포 생존에 씨를 뿌리고 기질에 따라 주목 해야 합니다. 가장 내 피, 상피, 또는 섬유 모양의 세포 유형, 심지어 작은 것 들 같은 생선 keratocytes (참조 댕 외. 21 고 앤더슨과 크로스22) 성공적으로 주입 될 수 있습니다. 그러나, 세포 이동의 우수한 모델 시스템을 구성 하지만 알 수 없는 이유로이 유형의 하 층에 주사와 호환 되지 않는 B16-F1 셀 laminin에 시드 같은 예외가 있다. NIH3T3 fibroblast 세포, 우리가 일상적으로 수행 주사 fibronectin 층, 및 추가적인 photomanipulation 기술은 졸라 (photoactivation도, 여기 B16-F1 셀에 대 한 표시) 등이 섬유 아이 세포 (참조에서에서 동일 하 게 수행할 수 있습니다. 예를 들어, Köstler 외. 3). 그것은 또한 고려 되어야 한다 그들의 기능 특성 및 실험 목표에 따라 다른 단백질 다른 양의 변경, 시간을 초에서 변화 하는 시간을 걸릴 수 있습니다. 기법의 장점은 외 인 에이전트의 복용량/농도 플라스 미드 transfection를 사용할 때 보다 예를 들어, 단일 셀 수준에서 더 정확 하 게 제어할 수는 이다. 또한, 단백질의 형광 태그 아니다 붙일 태그가 다른 단백질의 동시 다중 채널 시각화가 필요한 경우 유연성을 증가 시킬 수 있는 셀의 존재를 보장 하는 필요. Microinjection 셀 형태학 또는 (예를 들어, 당 외 골격의 동적 변화에 특정 단백질 또는 단백질 혼합물의 인스턴트 효과 분석 하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 21 Arp2/3 복합물 억제제 Arpin에 의해 마이그레이션에 인스턴트 효과의 예). 기술의 단점은 세포 손상 또는 세포 형태에 영향을 미칠 수 있는 그것의 침해입니다. 따라서, microinjections를 수행할 때 중요 한 고려 사항은 세포 생존 능력을 모니터링입니다. 여기 소개 하는 방법은 수동 조작에 의존 합니다. Fibronectin 층에 성장 하는 섬유 아 세포 등 성공적인 주사와 호환 되는지 테스트 하는 조건에서 여기에 설명 된 수동 주입 프로토콜을 사용 하는 근처 100% 성공률; 3이전 게시 비디오 현미경 또는 FRAP를 포함 하 여 정교 하 고 시간이 걸리는 후속 실험으로이 접근을 결합할 때이 필수적입니다. 이 때때로 그를 제외 하지 않습니다, 그리고 개별 셀의 핵 및 세포질, 세포 가장자리 철회 뒤 대비의 갑작스러운 변화에 의해 안전 하 게 인식 될 수 있다 microinjection 이벤트에서 저하 될 수 있습니다. 이러한 드문 경우에 실험은 제외 하 고 따라서 추가 분석에 대 한 간주 되지 않습니다.
그러나, 반 자동 접근은 또한 일반적으로 사용, 예를 들어 빠른 채용 (< 300 ms) 컴퓨터 제어 바늘 낮추는 사출 압력 증가, 일치는 바늘만 각각 이전 각 셀 위에 위치 해야 사출입니다. 반-자동 주사의 성공률은 정의상 단순히 위에서 설명한 수동 방식 보다 낮은 속도 위해 최적화 때문에 뒤에;이 치료를 성공적으로 살아남은 여러 셀의 분석 따라서 개별 셀의 성공적인 주입에 의존 하지 않습니다. 따라서, 단일 세포 분석, 반대 반 자동 주사는 더 나은 적합 몇 백 셀, 예를 들어, 비디오 현미경 낮은 확대율에서 또는 셀 고정 및 얼룩에 의해 주입 효과 분석 합니다. 고용 하는 상세한 접근 방식에 관계 없이 microinjection 분석 결과, 끝점을 구성 하지 않습니다 하지만 다양 한 기법, FRAP 또는 photoactivation3를 포함 하 여 결합 될 수 있다.
현미경 이미징 및 설치 조건에 따라 레이저의 강도, 낙관 한다 FRAP에 의해 단백질 이직 률을 결정할 때 (확대, 목표, 등, 셀 형식, 구조, 및을 위한 형광 단백질 photobleaching)입니다. Note는 최적의 레이저 전력 효율적인 표백와 결합 가능한 최소 photodamage 수축 방지 또는 분석 (예: lamellipodia 또는 filopodia) 또는 세포 수준에서도 피해 구조 철회 완료. 이상적으로, 표백 효율의 70-80% 이상 달성 되어야, 비록 완전 한 표백 있는 경우, 50% 이상의 아무것도 또한 받아들일만 할 수는 단백질의 매우 빠른 회전율에 의해 방해 받을 수 있습니다. 주어진된 구조와 형광 염료에 대 한 최적의 표백 전원 실험적으로 시험 되어야 한다, 그것의 점진적 증가 다음 낮은 레이저 전원에서 시작. 물론, 모든 형광 염료 수 정의 표백 흥분의 절정에 가까운 빛 레이저 (488 nm FITC 또는 EGFP 같은 자주 사용된 녹색 염료에 대 한). 그러나, 근처 UV 레이저와 같은 더 짧은 파장을 가진 레이저 높은 힘을 전달 하 고 따라서 또한 사용할 수 있습니다 일반적으로 사용 되는 염료의 효율적인 표백. 우리가 일상적으로 사용 하는 405 nm 다이오드 레이저 (120 mW)와 후자 (데이터 표시 되지 않음)의 경우 약간 낮은 효율 EGFP와 (예: mCherry), 빨간색 형광 염료의 탈색. 로 405 nm 다이오드 PA-GFP (아래 참조)의 photoactivation도 사용할 수 있습니다, 그것은 최대한 유연성이 시스템을 endows.
B16-F1 셀 구조와 형광 단백질 photobleached 여기에 대 한 65-100 사이 405 nm 레이저 힘은 적용 되었다. 분석할 때 photobleached 지역, 그것은 보존 여부 주어진된 구조는 그것의 원래 모양에서 분석을 통해 기간을 고려 하는 것이 중요. 예를 들어, lamellipodia 끝 단백질의 매출을 분석할 때 주의 해야 lamellipodia의 곡률 크게 시간이 지남에 변경 여부로 곡률에 변화 지역/컨투어 분석 하지 않으면 부정확 한 결과으로 이어질 수도 있습니다. 완전히 각 측정 프레임에서 구조 전체를 포함 합니다. 또한, lamellipodia, microspikes, 등에 포함 된 번들 형광 강도 편차를 발생할 수 있습니다 주목 해야한다. 그림 2b (9 s 시간 프레임에 흰색 화살표)에서 볼 수 있듯이 microspike 같은 구조 측정된 photobleached 지역 옆에 위치 하 고 있습니다 하지만 외부 측정의 기간에 걸쳐 있고 따라서 모든 발생 하지 않습니다. 부정확입니다. 단백질 회전율의 분석, 지역 분석의 위치와 크기를 선택할 때 중요 한 고려는 시간이 지남에 그들의 형광 해야 하지 수 크게 영향을 변화 세포 형태학 또는 요인에 의해 다른 하드을 피하기 위해 수집 photobleaching입니다. 예를 들어, 구조 분석된 구조에 상당한 양적 기여를 제공 이동 해서는 안됩니다 측정 지역의 분석; 중 또한, 나노미터 구조 단백질을 유치 하는 등 관련 없는, 형광 엔터티 분석 중 관심 분야를 입력 하지 해야 합니다. Lamellipodial 걸 중 합 속도 결정 한다 주의 없음 제거 또는 구겨지지 (즉, 위쪽으로 접는) lamellipodia는 분석으로이 강하게 결과의 정확도 영향을 미칠 것입니다. 또한, lamellipodial 말라 합의 과대평가로 이어지는 잠재적으로 lamellipodial 지역 철회 급속 한 후방 전으로 나타날 수 있습니다. 추가 고려는 세포내 정규화 영역 (인수 photobleaching의 교정에 대 한 참조 위치로 촬영 한 것)의 거리에서 photobleaching의 실제 위치는 충분히 커야 한다 피하기 위해 직접 photobleached 영역에 의해 영향을.
PA GFP 태그 구문 photoactivation에 대 한 최적의 조건을 설정할 때, photoactivation 동안 인스턴트 표백 방지 하기 배려를 취해야 한다. 우리의 작업에서 최상의 결과 얻으려면 레이저 힘으로 가져온 EGFP의 표백에 대 한 일반적으로 고용 보다 5-10 배 낮은. Photoactivated 분자의 이미지 수집에 대 한 노출 시간 프레임 사이의 시간 간격 해야 지역 및 photoactivated 될 구조물의 크기를 고려 하 여 최적화와 photoactivated의 잠재적인 이동성 뿐만 아니라 분석 다른 subcellular 위치에 단백질입니다. 형광 이미징의 모든 유형에 서 세포 생존 능력의 유지 보수 순수 관련 결과 얻기 위해 결정적 이다.
원칙적으로, mEos 등 Dronpa 변종12 형광 단백질의 그린-레드 photoconversion 다음 역학의 동등 하 게 강력한 방법 및 subcellular 구조는 lamellipodium 등의 매출 구성 ( 예를 들어, 참조 Burnette 외. 23). PA-GFP 반대로 후자의 방법의 장점은 공동 추가 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 필요 없이 두 가지 색상으로 변환 전후 단백질 역동성을 따라 가능성 것입니다. 그러나, 우리의 예비 실험에 대비 변경의 범위와 형광 신호 PA GFP의 photoactivation에 따라 달성의 강도 photoconverted 프로브에 비해 더 큰 아마도 레드와 그린의 우수한 스펙트럼 기능 형광 조사 (데이터 표시 되지 않음) 합니다. 어떤 경우에, lamellipodia 또는 Vaccinia 바이러스 유도 말라 꼬리 같은 셀 가장자리 돌출 말라 필 라 멘 트 매출에 대 한 상세한 연구 지금까지 출판 되었습니다 PA GFP 파생 상품5,,624를 사용 하 여.
Photoactivation에 따라 분석 하는 셀 영역을 고려할 때 여러 가지 요인 취해야 한다 계정에는 (활성화는 cytosol에 따라 셀 가장자리에 말라 단위체의 설립), 여기에 표시 된 특정 한 예를 사용 하 여 설명 하지만 다양 한 유사 과학적인 문제를 확실히 추정 될 수 있습니다. 첫째 때 측정 cytosolically photoactivated 단백질의, 예를 들어, lamellipodial 설립의 고유 실험 조건에서 (같이 Dimchev 그 외 여러분 6) 크기의 cytosolic 영역 및 lamellipodial 가장자리에 그들의 거리 실험 그룹 사이 비교 해야 합니다. 그것은 또한 photoactivating cytosolic 영역, 셀 두께 크면 위치 가까이에 핵을 고려 하는 것이 중요입니다. 두꺼운 세포 지역 활성화 활성화 될 단백질의 분포 homogenously는 cytosol에서 배포 되는 활성화 된 단백질의 더 높은 양을 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 활성화 될 단백질의 표정 수준을 확실히 수 높은 변수 개별 셀에. 이러한 모든 고려의 다양성으로 인해 특정 지역에서 활성화 시 얻은 총 형광을 기준으로 셀에 다른 cytosolically 활성화 단백질의 통합 수준을 비교 결정적 이다.
우리는 설명 어떻게 microinjection 세포 형태학에 단백질의 효과 조사 도구로 사용할 수 있다 exemplified이 보여주는 NIH3T3 fibroblast 세포와 microinjected에서 lamellipodial의 강력한 유도 작은 GTPase Rac1. 우리 이전 셀 흉터/웨이브3의 C-터미널 WCA 도메인 microinjected Arp2/3 기능 방해에이 기술을 적용 했습니다. FRAP 또는 photoactivation 같은 다른 분석 실험에 의해 microinjected 세포에 다양 한 매개 변수를 분석할 수 있습니다. 우리는 어떻게 FRAP 및 photoactivation 조사 subcellular 역학과 말라 단위체의 이동성에 대 한 사용할 수 있습니다 설명 했습니다. FRAP 우리의 그룹에 의해 사용 되었습니다 이전5 VASP, Abi, cortactin, cofilin, lamellipodia를 지역화 하 고 상한 단백질, 단백질 또는 elucidating 존재에 초점 접착에서 부품의 매출에 대 한 매출을 조사 하 그리고 Rac의 부재 신호4. 또한, photobleaching EGFP 태그 β-말라5에 의해 달성 될 수 있다 걸 중 합 속도 측정 하지만 존재 하는 다른 방법. 라이브 셀 이미징 호환 프로브 셀룰러 걸 필 라 멘 트, Lifeact25, 같은 라벨 보는 형광 이질성을 추적 고용된6,26일 수도 있습니다. 여기 장점은 β-말라의 overexpression 피할 수 있다, 셀 가장자리 돌출 및 마이그레이션, 증가 수 그리고 이렇게 잠재적으로 방해 실험 질문 또는 특정 분석 결과 (참조 예를 들어, 케이지 외. 26. Peckham 외. 그러나 27). Lifeact 프로브의 뚜렷한 단점 있도록 프로브 매출에만 정보를 제공 하는 셀에 Lifeact 이라고 표시 된 걸 필 라 멘 트 구조의 표백/걸 필 라 멘 트에 바인딩의 활동 그것의 급속 한을 구성 하는, 하지만 하지 말라 필 라 멘 트, 있는 그것은 바인딩25의 회전율. 형광 이질성의 추적 고용 이전6,26 실용적인 타협에서는, 많은 유사한 형광 speckles의 널리 사용 되는 추적에 통합 filamentous cytoskeletal 구조 ( 예: 연어와 워터 맨28참조), 하지만 사용 하는 만큼 정직 하 고 F-말라 EGFP 태그 구조의 FRAP 처럼 정확 하지 않을 수 있습니다. Photoactivation으로 돌기 하는 그것의 이동성 cytosol, 실험적으로 조정된 cytosolic F 걸 레벨6의 맥락에서 전체로 서 lamellipodia, 단위체 말라 설립의 속도 추정을 위한 회사에 의해 적용 되었습니다. 기술은 cytosolic 영역 등 비교적 큰 지역에서 파생 된 이동성 및 단백질의 분포를 검사 하는 경우 유용 합니다. 그러나, 상대적으로 작은 photoactivated 구조;에서 파생 된 단백질의 분포 조사 예를 들어, 성장 콘 형광 분자 활성화의 낮은 숫자, 약한 신호를과 따라서 감도의 부족 될 수 있습니다. Photoactivation 또는 photoconversion 형광 (위 참조)의 잠재적인 대체 기술을 역 투자 수익, 형광 분자에서의 이동성을 추적 하 여 다음을 제외 하 고 전체 셀 photobleaching에 의존 FRAP 포함 될 수 있습니다. 이 지역. 기술은은 단백질의 photoactivatable 버전 overexpressing 필요 하지 않습니다 하지만 항상 잠재적으로 photodamage 등 원치 않는 부작용을 일으키는 레이저 힘의 비정상적으로 높은 복용량에 노출 포함 됩니다.
명확 하 게, photoactivation 및 FRAP 단백질 단위체, 이합체, 또는 심지어 작은 올리고, 이동 하는 그들은 추가 바인딩 파트너와 함께에서 이동 여부 및 구별할 수 없습니다. 형광 상관 분광학 기법29 또는에서 또는, FLIM 무서 워30대신 그런 종류의 정보를 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, FRAP photoactivation 직접 관심, subcellular 위치, 또는 세포 유형 공부의 단백질에 관계 없이 셀에 지역 및 글로벌 단백질 역동성을 평가 하기 위해 간단한 접근 구성.

단백질 및 살아있는 세포에서 다른 분자의 spatiotemporal 역학 모니터링 세포와 분자 생물학의 여러 분야에서 필수적인 도구가 되고있다. 고급 형광 현미경 검사 법 기술로 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 무서 워-형광 일생 (FLIM 무서 워), 이미징 또는 FRAP, photobleaching (플립)과 photoactivation 형광 손실 뿐만 아니라 많은 다른 사람 허용 시간적 및 공간적 확산의 속도 론 및 지역화 셀1,2에 있는 다른 단백질의 결정 뿐 아니라 단백질-단백질 상호 작용, 구조적 변화의 추적. FRAP 및 photoactivation 기술을, 특히 말라 골격 및 세포 이동의 레 귤 레이 터를 조사 하기 위한 널리 적용 됩니다. 이 기술은 또는 microinjection3, 같은 추가 micromanipulation 기술로 적용 될 수 있다 고 붙일 표시 된 단백질의 표현을 포함. 그들은 걸 부자 구조 단백질 협회의 활동의 추정 filopodia 또는 lamellipodia, 초점 접착4, 단백질의 회전율 등 셀 마이그레이션에 관련 된 또는 말라 네트워크5분기 있습니다. 그들은 또한 lamellipodial 걸 중 합 속도, 결정 단위체 말라 cytosol, subcellular 말라 단위체 전 polymerizing에서 튀어나온 걸 필 라 멘 트에의 속도 내에서 분산의 평가 가능 하 게 lamellipodia6, 그리고 다른 매개 변수입니다.
FRAP 시각화 및 원래 악 셀7에 의해 1970 년대에 개발 된 살아있는 세포 내에서 단백질의 이동성을 측정 하는 방법 이다. 붙일 표시 된 단백질으로 채워진 셀, 내 관심 (ROI) 영역 정도 높은 강도, 시간의 짧은 시간 동안이 지역에 존재 fluorophore 분자의 표백을 충분 한 레이저에 노출 됩니다. 표백, 붙일 표백, 하는 동안 투자 수익 밖에 있는 단백질 분류 확산 되며 시간이 지남에 photobleached 분자의 변위를 일으키는 그들의 spatiotemporal 역학에 따라 표백된 지역에 침투. 형광 표백된 지역에 복구 속도가 주어진된 분자의 확산의 속도 및 크기를 포함 하 여 다양 한 요인에 따라 달라 고 내는 상 상속의 회전율이 표백된 구조를 연결 하는 코스. 따라서, 수용 성 단백질 단백질 초점 유착 등 구조와 밀접 하 게 관련 된 동안 보급을 통해 급속 하 게 표백된 ROI 내에서 형광의 복구 중재할 것 이다, 그들의 형광 복구 것입니다 회전율 시간이 더 오래 있을 것 이다 모두 구조 관련 분수의 단백질과 분리 협회 활동의 녹는 분수의 보급에 따라 달라 집니다. 형광 복구는 일반적으로 취득 하 고 계량 형광의 사전 표 백제 농도의 초기 수준에 도달할 때까지. 그러나,이 경우 초기 형광 강도의 일부 확산에 의해 보충 될 수 있는 소위 움직이지 분수에 속한다 또는 모바일을 구성 하는 분자의 대부분에 비해 매우 느린 속도로 보충은 발생 하지 않습니다. 분수입니다. 단백질 회전율의 비율을 확인 하려면 FRAP 곡선 시간이 지남에 형광 복구의 범위를 나타내는 생성 됩니다. 이러한 복구 곡선에서 단백질 복구의 평균 반 시간을 계산할 수 있습니다. 생성 함으로써 평균 FRAP 데이터 및 따라서 수학적 분석의 곡선에 맞는, 그것은 또한 모바일 분수의 평균 이직 률 구성 분자의 한 균질 인구의 합성 또는 그것은으로 구성으로 추정할 수 차동 속도에서 선회 하는 분자의 두 개 이상의 모집단 양적 접근에 의해 단백질 이직 률을 추정, 뿐만 아니라 lamellipodia에 photobleached 지역의 복구를 추적 허용할 수 있다 또한 역행 흐름, 돌출, lamellipodial 운동 성 매개의 정확한 정량화 그리고 말라 중 합 속도입니다. 따라서, FRAP 살아있는 세포의 구조 내에서 다양 한 매개 변수를 평가 하기 위한 적용 되는 다양 한 도구를 구성 합니다.
Photoactivation는 단백질 또는 지정 된 세포 위치에서 발생 하는 분자의 확산을 추적 하는 데 사용 되는 방법입니다. 기술을 사용 하 여, 예를 들어, 야생-타입 녹색 형광 단백질 (GFP), 패터 슨, 리 핀 코트 요 슈워츠8, 그것의 형광에 노출 시 매우 증가 될 수 있는 방식에 돌연변이 의해 처음에 개발의 변종 자외선 (UV) (약 400 nm; 여기, 405 nm). 패터 슨 외에 의해 설명된대로., 중립 페 놀 및 생산 약 397에 주요 흡 광도 피크 음이온 phenolates의 혼합된 인구로 서 존재 하는 야생-타입 GFP chromophores nm와 475에 사소한 한 nm, 각각. 자외선과 단백질의 조사, 시는 인구 photoconversion, 음이온 양식으로 변화를 겪 습. 488 흥분 때 nm, photoconverted/photoactivated 단백질 형광, 활성화 사이 구별 및 비-활성화 GFP 높은 본질적인 배경 형광 때문에 연습 부족에 3 증가 전시. 그러나, 배경 강도 감소 GFP 시퀀스 (히스티딘 대체 위치 203)에 단일 아미노산 돌연변이 도입 하 여 달성 되었습니다. Photoactivatable-GFP (PA-GFP)는 자외선과 방사선 조사 시 이후에 488 nm 빛에 의해 흥분 하는 때 거의 약 증가 작은 피크의 흡 광도 있는 뜻깊은 감소 특징 이다로 알려져는 결과 T203H 돌연변이 체 따라서, PA GFP 태그 단백질의 overexpression 유포의 결정 및 분자의 운동 성 세포 내에서 허용 하는 널리 사용 되 접근 이다. 우리는 이전 적용 PA GFP 태그 말라 말라 단위체 cytosolic 영역에서의 분산의 비율을 결정 하는 돌기에 cytosol, 뿐만 아니라 그들의 설립 속도 내에서 그들의 이동성의 뿐만 아니라 탐사를 허용 lamellipodial 걸 네트워크6. 최근 문학 소설, 사진-컨버터블 단백질 원리에서 사용 될 수 있는 유사한 방식, 설명 합니다 하지만 사진 변환 하기 전에 이미 볼 수 있도록 잠재적인 이점을 은닉. 형광 단백질의이 그룹에 대 한 예로 Dendra2 및 mEos29,10,,1112.
이 문서에서는, 우리는 단백질 microinjecting 셀 방법론 설명. 우리 더 어떻게이 기술은 결합 될 수 있다 FRAP, 말라 골격 규제 및된 운동 성, photobleaching 단백질에 의해 어떻게 FRAP 곡선 및 하프 타임 모바일 분수의 복구의 파생 될 수 있습니다 설명 합니다. 또한, 우리는 FRAP 기술을 사용 하 여 lamellipodial 네트워크의 걸 중 합 속도 결정 하는 방법을 예를 제공 합니다. 우리는 또한 지침 및 단위체 말라의 cytosolic 이동성 및 lamellipodia로 말라 설립의 결정 하는 데 사용할 수 있습니다 photoactivation 실험을 수행 하는 방법에 대 한 도움말을 제공 합니다. 이러한 기술은 물론, 하지 않습니다만 제한 걸 골격 구성 요소를 추적 하지만 잠재적으로 필요한 적당 한 적응 또는 최적화, 널리 적용할 수 다른 세포 유형 또는 다른 단백질, 구조, 조사 하 고 매개 변수입니다.

<table><tbody><tr><td>B16-F1 mouse skin melanoma cells&amp;nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>NIH-3T3 cells</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/L glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F-12 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum&amp;nbsp; (FCS)</td><td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>F7524</td><td>Lot054M3396</td></tr><tr><td>MEM Non essential amino acids&amp;nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glumatine 200mM (100x)</td><td>Life Technolgies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 5000 U/mL</td><td>Life technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Laminin coating buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td></tr><tr><td>Fibronectin from human plasma&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei buffer</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>702-50</td><td>150mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-actin plasmid DNA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>described in Koestler et al.2008</td></tr><tr><td>pEGFP-actin plasmid DNA</td><td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rac1 protein for microinjection</td><td></td><td></td><td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td></tr><tr><td>Microinjection buffer</td><td></td><td></td><td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1mM DTT</td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td><td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&amp;nbsp;</td><td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Grease&amp;nbsp;</td><td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Automatic temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope: Axio Observer&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap-HQ2 camera&amp;nbsp;</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG4 light source&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser source&amp;nbsp;</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet microinjector&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td></td><td>With built-in compressor for pressure supply</td></tr><tr><td>Nikon Narishige Micromanipulator system</td><td>Nikon Instruments, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview software v2.1.4</td><td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software v7.8.10</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot v.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

단백질의 spatiotemporal 역학 조사 하는 것은 다양 한 문맥에서 그들의 기능적인 중요성을 밝힐 수 있다. 이 문서에서 그것은 photobleaching (FRAP) 및 photoactivation 기술을 후 논의 어떻게 형광 복구 단백질 subcellular 위치에의 spatiotemporal 역학 공부를 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 기술을 간단한 결정 걸 cytoskeletal 레 귤 레이 션 및 세포 운동에 연결 하는 다양 한 매개 변수를 사용 하는 방법을 보여줍니다. 또한, 세포의 microinjection 또한 설명 (잠재적으로 앞 또는 상기 photomanipulation 기술을 보완) 대체 치료로 셀에 translocated 단백질의 트리거 즉각적인 효과를 형태와 기능 Micromanipulation 단백질 주입 또는 원형질 막 투과 약물 또는 cytoskeletal 억제제의 로컬 응용 프로그램과 같은 단일 세포 및 subcellular 세포 행동에 주어진된 치료의 즉각적인 결과 기록 하는 강력한 도구 역할을 할 수 있습니다. 수준입니다. 이것은 궁 행 여기 lamellipodial 셀 가장자리 돌출의 즉시 유도 의해 재조합 Rac1 단백질의 주입에 의해 4 분의 1 세기 전에 설립. 또한, 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 매출을 결정 하기 위한 프로토콜 제공-VASP는 걸 필 라 멘 트 중 합 효소 두드러지게 B16-f 1 셀의 lamellipodial 끝 축적 FRAP 고용 하 고 포함 하 여 관련 데이터 분석 및 커브 피팅입니다. 우리 또한 EGFP 태그 β-걸 표현 하는 세포에 의해 exemplified lamellipodial 말라 네트워크 중 합 속도 추정 하는 것에 대 한 지침을 제시. 마지막으로, 지시 급속 한 필 라 멘 트, lamellipodia, 돌기의 끝에와 같은 사용 하 여 어셈블리 photoactivation의 사이트에서 말라 설립 뒤 셀 세포질 내에서 말라 단위체 이동성의 비율을 조사 하는 방법에 대 한 주어 집니다. 접근 한다. 이러한 프로토콜의 구성 요소 또는 말라 골격의 레 귤 레이 터에 제한 하지만 유사한 패션 spatiotemporal 역학 및 다양 한 다른 subcellular 구조 또는 기능적 단백질의 기능에 찾아보기 쉽게 확장 될 수 있습니다. 컨텍스트입니다.

그림 1 g h 단계 이전 NIH3T3 fibroblast 세포 이미지와 10 분 후 microinjection은 복잡 한 파와의 상호 작용을 통해 lamellipodia 형성 유도 능력이 작은 Rho 가족 GTPase Rac1의 표시. 셀은 먼저 그것의 생존 능력 및 형태, 예를 들어, lamellipodia의 부족을 확인 microinjection (그림 1g), 전에 시각화 됩니다. 10 분 후 microinjection에서 셀 명확 하 게이 치료에서 예상 되며 성공적인 주입 (그림 1h) 나타냅니다의 형태를 변경 했습니다.
단순 하 고 선명도, 우리는 다음 또한 microinjected 하지가지고 셀에서 FRAP 및 photoactivation 분석을 위한 모범적인 결과 제공.
Lamellipodium 끝에 VASP EGFP 태그의 회전율의 분석 그림 2a ~ f에 표시 됩니다. Note VASP 또한 초기 및 초점 유착, 셀 내부18,19에 작고 길쭉한 점을 대상. 끝에 분명 VASP 누적 된 lamellipodial 영역의 형광 강도 표백 이었고, 중, 전과 후는 lamellipodium 돌출 전달으로 표백 투자 수익의 윤곽에 따라 각 기간에 대 한 측정. 표백된 EGFP VASP 단백질 비 표백 분자가이 사이트에서 재생 되는,으로 형광의 점진적인 회복 (그림 2b) 관찰 된다. 이 방식 하 고 사전 표 백제 농도 (1로 표현)으로 정규화 FRAP 복구 곡선 그림 2c에서 볼 수 있습니다. Photobleaching 효율과 다를 수 있습니다 표백이 예제에서 t 0에 있는 값에서 결정 하기 전에 값의 약 20%는 (photobleaching 후 첫 번째 프레임). 형광의 증가 고원 예 전에 표백 형광의 약 80%에 도달 합니다. 초점 접착 등 실험의 시간 과정 동안 정적 구조 사전 표 백제 강도와 고원 형광의 차이 도달 후 복구 움직이지 분수 (IF, 빨간색 화살표 그림 2에서로 정의 됩니다. c, e), 형광의 양을 사이 표백 하 고 완전 한 회복의 시간 복구 하는 반면 모바일 분수 (녹색 양방향 화살표 그림 2c, e)로 정의 됩니다. Lamellipodium 팁 여기 분석 등 동적으로 변화 하는 구조에서 IF의 범위 수 있습니다 뿐만 아니라 움직이기 힘 드는 분자를 대표 하지만 EGFP VASP 강도이 의존 알려져 있다 또한 돌출 속도의 감소에서 파생 매개 변수18. 복구의 하프 타임을 계산 하려면 시그마 플롯 (그림 2d)에 맞는 곡선을 만들었습니다. 해결 하는 방정식 2 에서 추출 된 "b" 매개 변수 값은이 경우에, 0.0754 때 적용 로그 함수 (식 4) 9.19의 복구의 결과 약된 반 시간에 (그림 2d , 맨 오른쪽 패널), 이전5에 게시는 상대적으로 평균에 비해 특정 셀이에 빨리. 그것은 그 복구-시간 달라질 수 있습니다 때로는 크게 셀에서 동일한 인구 내의 주목 해야 합니다. 따라서, 대표적인 결과 얻기 위해 적어도 15-20 셀에서 평균으로이 매개 변수를 확인 것이 좋습니다. 분산, 15 셀에서 평균 EGFP VASP 복구의 산술 방법의 정도 설명 하기 위해 각 시간-포인트 생성된 (그림 2e), 그리고 평균 곡선에 맞는 만든 유사한 패션 (그림 2 에 표시 f)입니다.
Lamellipodial 걸 네트워크의 중 합 속도 앞으로 네트워크 돌출 및 역행 흐름의 합으로 구성 됩니다. FRAP β-말라 EGFP 태그와 photobleaching 튀어나온 lamellipodial 지역 (그림 2g)와 (이 경우 F1 B16)에서 transfecting 셀 여 걸 중 합 속도 측정 하는 데 적용할 수 있습니다. Lamellipodial 걸 네트워크 중 합의 분석, 대 한 β-말라 EGFP 태그의 표백 시 형광 회복 시간이 지남에 평가. (이 모든 전면20쪽으로 포인트) lamellipodial 걸 필 라 멘 트의 가시 끝에 말라 단위체 진행의 합으로 네트워크 이며 끊임없이 translocated rearwards 전달, 진행 속도 쉽게 될 수 있습니다. photobleaching에 따라 형광의 편광된 복구 통해 얻은. lamellipodium의 형광 복구 완료 되 면 최대한 빨리 표백된 영역에는 lamellipodium의 뒤쪽 부분과 더 수평으로 배열 된 필 라 멘 트 번들의 낮은 밀도 의해 특징입니다 얇은 판자 사이 전환 영역에 도달 했습니다. 선회는 lamellipodium에서 무엇을 관찰 하는 것 보다 훨씬 더 느리게. 그림 2g에서 볼 수 있듯이 형광 복구 수평 가장자리를 돌출 고 (개별적으로 나타나는 퇴행 성 흐름의 거리 측정을 허용 하는 얇은 판자 쪽으로 거꾸로 흐르는 선으로 구상 될 수 있다 주황색과 빨간색 양방향 화살표로 그림 2g 의 맨 오른쪽 패널에서 각각).
우리는 또한 photoactivation PA-GFP-말라 말라 단위체는 cytosol 내에서 이동성 및 lamellipodia 튀어나온 내에서 그들의 설립의 속도 추적 하을 transfected B16-F1 셀에 적용 했습니다. 그림 3a, b에서 볼 수 있듯이 cytosolic 영역 405 nm 레이저에 노출에 의해 photoactivated, 이미지는 GFP에 인수 했다 하는 동안 채널 모든 1.5 GFP 태그, photoactivated 말라의 분포를 시각화에 대 한 s. 그림 3bcytosolic 지역의 확산 Photoactivated GFP-걸을 볼 수 있습니다. Photoactivated cytosolic 영역에서 형광 강도 감소의 속도 (t0)에서 초기 휘도의 비율로 표시 됩니다 (첫 번째 photoactivation; 후 프레임 그림 3 c). Photoactivated 말라 또한 새로운 걸 단위체의 돌출 하는 동안 걸 필 라 멘 트를 elongating 성장 가시 끝에 추가 됩니다 lamellipodia의 끝에 통합. Lamellipodial 설립의 속도 예상 하려면 우리는 약 5 µ m 폭에서 및 높이; 1 µ m의 2 차원 윤곽선/지역 시간이 지남에 형광 강도 측정 지역 끊임없이 다시 protruded 그것으로 lamellipodium의 끝에 위치 했다. 말라 설립 (t0)에서 photoactivated cytosolic 영역의 형광 강도의 비율로 표현 되었다 (그림 3d). 말라 필 라 멘 트의 연신 율 진행, 새로운 걸 단위체 lamellipodial 앞에 통합 했다. 이러한 걸 단위체의 분수 확률론 단위체 photoactivated을 했다 cytosolic 풀에서 파생 되었다. 첫 번째 20에 lamellipodia에 형광의 급속 한 증가에이 결과 후 photoactivation s. 로 새로운 단위체 퇴행 성 흐름으로는 얇은 판자 쪽으로 필 라 멘 트와 함께 이전 법인된 걸 단위체 흐름 lamellipodial 앞에 추가 되 고 있습니다. 시간, ROI 완전히 채워집니다 형광 단위체 및 형광에 대 지에 도달 하면 (그림 3d). 형광에 있는 점차적인 하락 다음 때, 셀에 걸쳐 photoactivated 단위체의 확산에 따라 관찰, 비 photoactivated 걸 단위체는 점점 추가 되 고 다시 lamellipodial 앞에. 형광이이 감소는 새로운 고원, photoactivated 및 photoactivated 비 단위체 사이 전체 셀에 균형 (데이터 표시 되지 않음)에 도달할 것입니다 발견할 것 이다.
cytosol에 걸쳐 걸 단위체의 이동성 distally ( 그림 3는 색상 코드 영역 표시에 exemplified photoactivated 지역에서 위치 하는 같은 크기의 영역에서 형광 강도 측정 하 여 파생 되었다 R1-R5). 이 지역의 각각에서 형광 강도에서 점차 감소e 그림 3볼 수 있듯이 cytosolically photoactivated 지역, photoactivated 말라 단위체의 일부분으로 된다 점점 희석 비 활성화 (즉, 비-형광 성) 단위체. 또한, 형광의 피크에 도달 하면 나중: 더 먼 측정된 영역은 위치 photoactivated 지역에서이 지역으로 확산 말라 단위체에 필요한 더 이상 시간. 각 지역에 말라 단위체 침투의 정도 대 한 대표적인 값 형광 고원 도달의 하프 타임을 측정 하 여 파생 될 수 있습니다. 더 먼 지역, 더 오래 걸리는 photoactivated 말라, 그것으로 무마 하 고 따라서 더 많은 시간 필요 도달 될 형광 고원 궁극적으로 더 높은 t1/2 값 (그림 3e)로 이어지는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> 그림 1 : 챔버 어셈블리 및 microinjection 절차를 이미징. (한) 이미징 약 실 구성 요소입니다. (b) 실리콘 그리스는 신중 하 게 플라스틱 마감재의 오프닝의 주위 발 랐 습. (c)는 coverslip 셀-면 열고 이미징 챔버의 중앙에 배치 됩니다. (d)는 보안 물개는 coverslip 위에 플라스틱 날 인자를 배치 하 여 고 사이드 클램프를 강화 하 여 설정 됩니다. (e) 현미경 중간 챔버 슬롯에 pipetted입니다. (f) 이미징 챔버가 현미경 스테이지에 배치, 열 탐지기 및 전극 미리 37 ° C로 설정 하는 난방 장치에 연결 되 고 셀 현미경 시작 하기 전에 적어도 30 분에 대 한 적응을 사용할 수 있습니다. 이 예제에서 현미경 단계 또한 갖춘 한 micromanipulator microinjections, 수행 하 고 microinjection 바늘 이미징 챔버에 셀 레이어를 취재 하는 매체에 담근. (g)는 NIH3T3 fibroblast 세포 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 microinjection 전에 시각 이다. Perinuclear 구획에 적십자 부피가 큰 핵에 가까운 근접 때문에 높은 세포질 영역에 해당 하는 미래 microinjection의 위치를 나타냅니다. (h) 다음 10 분 Rac1와 microinjection, 셀 (녹색 화살표로 표시 됨) 전체 셀 주위 lamellipodia의 저명한 형성에 의해 반응. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> 그림 2: FRAP 단백질 회전율 또는 lamellipodial 걸 중 합 속도 결정할 수 있습니다. B16-F1 셀 표시 lamellipodial 지역의 photobleaching 전에 EGFP VASP를 표현 (한) 대표 예. 서로 다른 색된 윤곽 또는 모양 어떤 지역 시간이 지남에 형광 강도 측정을 위한 고려 되었다 나타내는 레이블이 지정 됩니다. 참고 빨간색 윤곽선 레이블 cytosolic 영역 여러 소포 및 셀 표면 주름을 포함 하는 지역에 위치 하는 느낌표와 함께 표시. 이 같은 동적 영역으로 그들은 잠재적으로 부정확 한 결과가 발생 하는 형광의 강한 단기 변동에 의해 특징 이다 형광 참조의 영역을 선택 하는 데 피해 야 한다. (b) Lamellipodial photobleaching 전후 EGFP VASP 표현 세포의 영역입니다. 형광 신호 지역 내에서 photobleaching 자주색으로 표시 된 후의 복구 시간이 지남에 시각 이다. 화살표 걸 필 라 멘 트의 높은 밀도 인해 가능성이 VASP 위한 농축 한 microspike의 끝을 나타냅니다 polymerizing 거기19. (c)는 FRAP의 예를 들어 복구 곡선으로 b 레드 photobleached lamellipodium (보라색 컨투어)의 형광 강도 측정 하는에서 파생 하 고 오른쪽에 녹색 선, 각각, 부동 및 모바일 분수를 나타냅니다. (d) A c (왼쪽된 패널) FRAP 복구 곡선 및 복구 30 시간 (오른쪽 패널)를 파생 하는 데 사용 하는 계산 방법의 예의에 맞게. (e) FRAP 복구의 예 곡선 샘플 인구 내의 가변성의 정도 나타내는 SEM 바 15 셀의 형광 복구 곡선을 평균에서 파생. (f)는 곡선 맞추기 FRAP 복구 곡선 맞는 복구 반 시간 (오른쪽 패널)를 파생 하는 데 사용 하는 계산 방법의 예를 들어 15 셀 (왼쪽된 패널)의 평균에서 파생. (g) lamellipodium lamellipodial 지역의 표백으로 뒤는 lamellipodium에서 형광 복구 시간이 지남에 전후 EGFP 태그 β-걸 표현 B16-f 1 셀의 돌기의 시간 경과 패널. 맨 오른쪽 패널에서 값 돌출에 대 한 측정 및 역행 거리 제공 됩니다 (오렌지와 레드, 각각). 이미지 패널 아래 계산 돌출 및 역행 거리의 합 lamellipodial 말라 네트워크의 중 합 속도 파생 시키는 데 사용 하는 방법 공개. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> 그림 3: 의 PA-GFP-말라 단위체 셀 전체 추적에 대 한 Photoactivation. 빨간색 동그라미 (PA)에 표시 된 대로 cytosolic 영역에서 photoactivation를 실행 하기 전에 PA-GFP-걸 표현 B16-f 1 셀의 (a) A 대표적인 예. 서로 다른 색된 윤곽 어느 지역 시간이 지남에 형광 강도 측정을 위한 고려 되었다 나타내는 표시 됩니다. (b) PA-GFP-걸 다음의 시간적 분포의 그림 photoactivation. Photoactivated 걸 멀리 확산으로 photoactivated, cytosolic 영역 (빨간색 동그라미)에 형광의 점진적 감소를 note. 앞을 네트워크에 그들의 보급으로 인해 photoactivated 걸 단위체 lamellipodia (사이안 지역) 및 거리 및 시간에 따라 패션에 cytosol (다른 색으로 구분 된 지역)에 걸쳐 점차적으로 강화 된다. (c) 대표, 일시적인 감소 photoactivated cytosolic 영역 (빨간색 윤곽선 b에서) 형광의. (d) 측 변화 lamellipodial 지역 (시안색 컨투어 b에서) 형광 강도. (e) 형광 강도의 cytosolic 영역 (b에서 색) photoactivation의 지역에서 가변 거리에 위치 때문에 시간적 변화의 대표적인 곡선. 어떻게 반-시간 형광의 고원 참고 (오른쪽에 범례에 표시)의 거리 증가 지역 photoactivation의 영역에, 주어진 증가와 연관 가능성이 시간에 말라 단위체의 보급에 필요한는 해당 지역입니다. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

micromanipulation-techniques-allowing-analysis-morphogenetic-dynamics

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K 조회수.  Technische Universität Braunschweig. 어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

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Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

연구

생체공학

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

유전학

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

발생학

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and gradients are thought to control the timing and spacing of segment formation, respectively. While the involved signaling pathways have been studied extensively over the last decades, direct evidence for the function of signaling oscillations in controlling somitogenesis has been lacking. To enable the functional investigation of signaling dynamics, microfluidics is a previously established tool for the subtle modulation of these dynamics. With this microfluidics-based entrainment approach endogenous signaling oscillations are synchronized by pulses of pathway modulators. This enables modulation of, for instance, the oscillation period or the phase-relationship between two oscillating pathways. Furthermore, spatial gradients of pathway modulators can be established along the tissue to study how specific changes in the signaling gradients affect somitogenesis.
The present protocol is meant to help establish microfluidic approaches for the first-time users of microfluidics. The basic principles and equipment needed to set up a microfluidic system are described, and a chip design is provided, with which a mold for chip generation can conveniently be prepared using a 3D printer. Finally, how to culture primary mouse tissue on a microfluidic chip and how to entrain signaling oscillations to external pulses of pathway modulators are discussed.
This microfluidic system can also be adapted to harbor other in vivo and in vitro model systems such as gastruloids and organoids for functional investigation of signaling dynamics and morphogen gradients in other contexts.

A protocol for the culture and manipulation of mouse embryonic tissue on a microfluidic chip is provided. By applying pulses of pathway modulators, this system can be used to externally control signaling oscillations for the functional investigation of mouse somitogenesis.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

생물학

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

신경과학

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

단극성 미토틱 스핀들에서 디스크 현미경 검사법에 의한 미세소관 역학 측정

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...