Name: stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
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우리 감사 마가렛 Gardel 아낌없이 고분자의 사용을 허용. 우리 인정이 작업을 사용 하는 NIH (1R15GM116082)에서 지원 합니다.

1입니다. 부드러운 실리콘 기판의 제작
<ol><li>1.75 g A 구성 요소 및 B 구성 요소의 1.75 g으로 무게 (A:B = 1:1) 부드러운 실리콘 엘라 스토 머 키트 (폴리스 티 렌)를 사용 하 여 트레이 무게.</li>
	<li>A 구성 요소 무게 트레이에 B 구성 요소에 추가 하 고 적절 한 주걱 스틱을 사용 하 여 5 분 동안 함께 그들을 섞는다.</li>
	<li>35 mm 페 트리 접시 위의 혼합물을 추가 합니다. 몇 분 동안 배양 접시에 걸쳐 균등 하 게 확산 혼합물을 허용 한다. 참고: 페 트리 접시 지름과 부드러운 실리콘의 양을 부드러운 실리콘 두께 결정 합니다. 여기, 두께 약 3.5 m m; 될 것입니다. 토론 섹션에서 고무 두께 선택 하는 것에 대 한 더 많은.</li>
	<li>모든 기포를 제거 하려면 15 분 동안 진공 챔버에, 뚜껑 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 미리 70 ° c 뜨거운 접시가 열</li>
	<li>핫 플레이트에는 70 ° C에 도달 하면, 유리 슬라이드에 놓고 유리 슬라이드에 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 실리콘을 하자 30 분 동안 70 ° C에서 치료. 로 페 트리 접시 녹아 있습니다 핫 플레이트에 직접 폴리스 티 렌 접시를 배치 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 부드러운 실리콘에 형광 Microbeads 커플링
<ol><li>(발견된 페 트리 접시)에 치유 부드러운 실리콘 깊은 UV 챔버 (185 및 254 nm의 빛 파장의 깊은 UV 램프와 인클로저)에 배치 합니다. 부드러운 실리콘 샘플 (UV 램프에서 ~ 5-10 cm) 5 분에 대 한 깊은 자외선 노출.<ol>
<li>실리콘 깊은 자외선에 노출 되는, 아래 단계 2.2-2.6와 함께 진행 합니다. 깊은 자외선 노출 후 샘플을 검색 하기 전에 적어도 5 분 동안 깊은 UV 챔버를 드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한편, 19 mg microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 밖으로 무게 하 고 그것에 이온된 수 (DI) 물 500 μ를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 EDC를 분해.</li>
	<li>별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 11 mg N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo NHS)의 밖으로 무게, 디 물 500 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 떨고 sulfo NHS를 해산. 그런 다음, 단일 microcentrifuge 튜브에 EDC sulfo NHS 솔루션 결합.</li>
	<li>이 EDC/sulfo NHS 솔루션 (1 %w / v 재고 농도)와 30 μ 0.44 μ m 직경 빨간색 (또는 필터 큐브 형광 현미경에서 사용할 수에 따라 다른 형광 색)의 수정 카복실산 형광 microbeads을 추가 합니다.</li>
	<li>EDC/sulfo NHS/비드 혼합물에 추가 하는 콜라겐의 0.02 m g (쥐 꼬리, 0.02 M 초 산에 4 mg/mL의 재고 농도)에서 나 약 0.02 mg/mL의 농도를.</li>
	<li>EDC/NHS/구슬/콜라겐 소용돌이 나 구슬 결합 하기 전에,에 걸쳐 균등 하 게 분산은 되도록 짧게 혼합물.</li>
	<li>플라스틱 EDC/NHS/구슬/콜라겐의 1 mL 나 혼합물 parafilm 다른 얕은, 평면 뚜껑 (작은 직경)의 상단에 배치의 조각에. 반전이 혼합물에 부드러운 실리콘 페 트리 접시는 부드러운 실리콘 표면 혼합물을 연결 하지만 아래 작은 페 트리 접시의 뚜껑의 표면을 직접 만지지 않는다. 거꾸로 페 트리 접시 스페이서의 양쪽에서 하나 또는 두 개의 유리 슬라이드를 사용 하 여 거꾸로 페 트리 접시, 인상. 참고: 그림 1 단계 2.7를 수행 하는 방법을 볼 수를 참조 하십시오.</li>
	<li>알루미늄 호 일 샘플을 커버 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 제거 하 고 그것을 똑바로 설정 (실리콘-쪽).</li>
	<li>접시에 PBS (pH 7.4)의 2 개 mL를 추가 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 부드러운 실리콘 표면 세척. 몇 분 동안 앉아 보자. PBS에서 aspirate 그리고 2 mL의 PBS로 다시 실리콘 세척. 실리콘 추가 대 한 치료는 하루에 대 한 하자. 그 이유로 장소 부드러운 실리콘 샘플 PBS에서 37 ° C에서 하룻밤.</li>
</ol>3. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 영역 들여쓰기와 실리콘 강성 측정
<ol><li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 검색 하 고 실리콘 표면 액체 표면 아래 몇 mm을 PBS의 1 mL 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>날카로운된 핀셋을 사용 하 여, 부드러운 실리콘에 5 1 m m 지르코늄 구체 indentors 드롭. 액체 매체에 구체를 담가 그리고 실리콘 레이어 및 다른 indentors의 위치에서 적어도 5 indentor 직경의 가장자리에서 그들을 드롭. 참고: 액체 표면 위에 떨어졌다 구체 실패할 수 있습니다 액체 매체 (부동 소수점) 입력 액체 매체의 표면 장력 때문.</li>
	<li>기본 페 트리 접시를 통해 이미지 수 있도록 현미경 스테이지에 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 놓습니다.</li>
	<li>10 X 목표 단계 이미지를 사용 하 여 (건조 10 X 같은 나 0.30의 객관적인), 찾아서 초점으로 구체 indentor를가지고.</li>
	<li>부품의 단계 이미지는 indentor의 전부를가지고 고이 이미지를 저장. 타일 스캔을 사용 하 여 사용 가능한 경우. 어떤 눈에 보이는 결점에서 indentor 있으면 삭제 하 고 다른 indentor 바꿉니다.</li>
	<li>프레임의 왼쪽된 가장자리는 적어도 ~1.5 R indentor 센터에서의 거리를 라이브 단계 영상에서 indentor의 가장자리의 왼쪽에 이동 합니다. 센터는 indentor의 그대로 오른쪽 이미지 프레임의 오른쪽 가장자리 근처에 표시 됩니다 확인 하십시오. 단계 이미지 하 고 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>빨간 형광 채널에 대 한 조명 현미경 광원을 전환 합니다. X-및 y-좌표 변경 ( x-indentor 센터 내에서 하지만 프레임의 오른쪽 가장자리 근처의y 위치), 초점 (Z 감소) 아래로 구체 indentor의 센터 아래 빨간 형광 microbeads까지 그냥 초점 이동 합니다.</li>
	<li>(영상 프레임의 왼쪽된 가장자리) 근처 indentor 멀리 실리콘의 상위 계층에 microbeads 초점 이동까지 모든 z-0.5 µ m의 증가 대 한 이미지와 z 스택을 가져가 라.</li>
	<li>샘플에 다른 indentors와 3.4-3.8 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 실리콘의 강성 (탄성 계수)를 계산
<ol><li>ImageJ, 선 도구에 클릭을 사용 하 여 indentor의 위상 이미지를 열고 픽셀에서 indentor의 직경을 측정 합니다. 클릭 한 채로 indentor 가장자리에 지점에 커서를 정반대로 반대 지점에 가장자리에 고 길이 픽셀 커서를 해제 하기 전에 ImageJ 메인 윈도우의 상태 표시줄에 표시 합니다.<ol>
<li>분석을 클릭 하 여 길이 단위를 픽셀로 설정 되어 있는지 확인 | 설정 규모 길이의 단위를 확인 하 고.</li>
		<li>객관적인 확대 및 CCD 카메라 픽셀 크기에 의해 μ m indentor의 반경 픽셀 단위 변환 (μ R = R x μ m에 CCD 카메라 픽셀 크기 (픽셀)에서 / 객관적인 확대).</li>
	</ol>
</li>
	<li>열고 microbead 이미지의 빨강 채널 z-스택 (해당 되는 경우는 microbeads는 빨간색 형광) ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 | 가져오기 | 이미지 시퀀스 고 스택의 모든 이미지를 선택 하 고 스택의 열을 확인 을 클릭 합니다. 참고: f 1에서 indentor 센터에서 microbeads 최상의 가능한 초점 이며 F2 프레임 번호는 프레임의 왼쪽된 가장자리 근처 (구슬 중심에서 R ~1.5의 지역)에서 microbeads에 있는 최상의 가능한 초점 프레임 번호입니다. Z-두 프레임 간의 차이 들여쓰기 깊이 δ.<ol>
<li>ImageJ에서 선 도구를 사용 하 여, 이미지에 잘 정의 된 microbead에서 선을 그립니다. 클릭 분석 | 프로필을 플롯 구슬에서 다른 프레임을 선택 하는 동안 업데이트 된 라인 스캔 강도를 라이브 버튼을 클릭 하십시오. 초점에서 프레임으로 최대 강도의 높은 가치를 제공 하는 프레임을 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>Z-z-스택 프레임 사이 증가 0.5 μ m 이므로, δ로 μ m에서 들여쓰기 깊이 계산 (F2-F1) = 0.5 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(마이너스 반대 부 력 힘), 그것의 무게 때문 indentor 여 즉 젤에가 해지는 힘을 계산, 들여쓰기 강제 F, 중력 때문에 가속도 x indentor-액체 매체의 밀도 (밀도) x indentor의 볼륨으로. 방정식 F 를 사용 하 여 = (4/3) x (ρindentor -ρ중간) x (R3) x 3.142 g R 은 indentor의 반지름 x ρindentor indentor, ρ매체 의 밀도 액체 매체의 밀도 이며 g 는 중력 (9.81 m/s2) 때문에 가속도. SI 단위의 F (N)를 오른쪽에 모든 수량을 표현 한다.</li>
	<li>영의 계수 (E) 수정된11 헤르츠 모델12 방정식을 사용 하 여 실리콘의 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> 장소: c =; 뒤에 헤르츠 모델 식을 수정 하는 수정 계수 v = (비압축 자료7에 관해서는 0.5로 찍은); 실리콘 젤의 Poisson의 비율 F = 들여쓰기 힘; R = indentor 반경; 그리고 Δ = 들여쓰기 깊이. 전자 실바에서를 SI 단위로 오른쪽에 모든 수량 표현<ol>
<li>보정 계수 c 3을 다음과 같이 계산 합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> 장소: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; 그리고 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. 이 수정 계수는 부드러운 실리콘 (있는 경우) 아래는 페 트리 접시 (또는 뻣 뻣 한 실리콘)을 잘 준수 하는 경우에 사용 하기 위해 특별히 주목 한다.</li>
		<li>H 양의 실리콘 추가 페 트리 접시 지름에 따라 부드러운 실리콘 층의 높이 계산 합니다. 또는, 직접 단계 영상에 의해 실리콘 층의 위쪽 및 아래쪽 표면의 z 좌표를 결정 하 여 h를 구하는 (작은 불순물 중 표면에 초점에와 서). 큰 h에 대 한 유의 (h2 > Rδ), 보정 계수 c 1에 가깝다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 indentor 단계 4.1-4.4 반복 합니다. 영의 계수는 실리콘 샘플에 대 한 평균 탄성 계수를 각 indentor에서 얻은 평균.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+stiffness+dictates+development,+homeostasis,+and+disease+progression.">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. 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P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony.">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

영역 들여쓰기 메서드는 쉽게 구현할 수, indentor의 선택과 부드러운 실리콘 샘플의 두께에 주의 지불 한다. 영의 계수를 계산 하는 데 사용 하는 방정식 조건11의 세트에서 유효 하 고 이들은 일반적으로 실리콘 샘플의 두께 indentor 반지름의 > 10% 일 때 만족 하 고 < indentor 반지름 x 13 ~. 우리는 발견 실리콘 두께 5-10 x의 indentor 반경 했다 좋은 선택, 어떤 점에서 샘플 두께 너무 높은 (...

부드러운 조직에 세포의 강성은 kilopascal 범위1, 누구의 강성은 몇 배나 더 높은 조직 문화 요리 달리 마이크로-환경에 거주. 세포 외 기질 단백질 코팅 부드러운 기판에 초기 실험 기판 강성 영향 어떻게 세포 이동으로2,3아래 기질을 보여주었다. 사실, 기판 강성 근본적으로 영향을 퍼지는 생 화 확 적인 신호를 유사한 방식으로 셀 기능4 . (세포 외 기질 단백질 코팅) polyacrylamide 젤은 (물 permeating) hydrogels mechanobiology 연구5대 문화 기질 세포로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 입니다 (PDMS), 가장 일반적인 실리콘 (polysiloxane), 널리 사용 되었습니다 뻣 뻣 한 실리콘으로 megapascal 범위 강성과 마이크론 스케일 제조6. 더 최근에, 소프트 실리콘 기판 더 순수 관련 kilopascal 범위에서 경직 된 mechanobiology 연구7,8셀 문화 기판으로 고용 되었습니다.
여러 가지 방법은 유연한 기판, 원자 힘 현미경 검사 법, 스트레칭, 유동성, 및 들여쓰기 영역을 사용 하 고 둥글게 밀고 microindentors9 시 전체 샘플의 거시적인 변형 등의 강성을 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 각 기술에는 그것의 자신의 이점 및 불리, 구체와 들여쓰기만 widefield 형광 현미경에 액세스 해야 하는 특히 단순 하지만 상당히 정확한 방법입니다. 금속 구체와 들여쓰기 hydrogels 이전 작업3,,910의 강성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 셀 운동 기판 강성의 중요성을 설명 하는 초기 작업 히드로 기판 강성3를 결정 하는이 방법을 활용. 더 최근에, confocal 현미경 검사 법 또한 우아한 특성10에 대 한 사용 되었습니다.
여기, 우리 제시 부드러운 실리콘 기판 준비 단계별 프로토콜 형광 구슬 커플링 (과 콜라겐과 같은 세포 외 기질 단백질 나) 상단 표면에 단지 단계 들여쓰기 구와 최고 표면 사용 하 여 이미징 및 형광 이미징, 각각, 그리고 마지막으로 실리콘 기판의 영의 계수를 계산 하기 위해 이미지를 분석. 이 방식으로 준비 하는 부드러운 실리콘 기판 견인 힘 현미경 실험에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 기반으로 (배양 접시) 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용은 또한 mechanobiology 연구를 외부 뻗 기를 사용 하 여 수 있습니다. 보증, 어디 가능한 합병증 방지에 필요한 실용적인 고려 사항 또한 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B silicone elastomer kit</td><td>&amp;nbsp;Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td><td>Store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Pierce Sulfo-NHS crosslinker</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>Store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 &amp;micro;m, 2 mL</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>Store at 4&amp;deg;C, do not freeze</td></tr><tr><td>1.0 mm Acid washed Zirconium beads</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>Deep UV chamber with ozone evacuator</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>Wide field fluorescence microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, from rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>public-domain software</td></tr></tbody></table>

stiffness measurement of soft silicone substrates for mechanobiology studies using a widefield fluorescence microscope

인간의 신체에서 부드러운 조직 일반적으로 kilopascal (kPa) 범위에 강성을 있다. 따라서, 실리콘 및 히드로 유연한 기판 경작 조건 비보에 부분적으로 모방 하는 실제 microenvironment에서 셀에 대 한 유용한 기판 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 영의 계수 등방성 선형 탄성 기판 mechanobiology 연구에 일반적으로 사용의 특성화에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 준비 하는 페 트리 접시 또는 뻣 뻣 한 실리콘에 부드러운 실리콘 기판, 형광 구슬 실리콘 기판의 윗 표면 코팅,는 형광 이미징 (중력)에 의해 상면을 밀리미터 단위 구체를 사용 하 여 프로토콜 구성 들여쓰기 실리콘에 구슬 표면 형광 현미경을 사용 하 여 및 실리콘 기판의 영의 계수 계산 결과 이미지를 분석 합니다. 기판의 상면 (형광 구슬) 뿐만 아니라 응용 세포 외 기질 단백질 커플링 실리콘 기판을 셀 도금 및 견인 힘 현미경 실험을 사용 하 여 후속 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 베이스로 페 트리 접시 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용을 외부 뻗 기를 포함 하는 mechanobiology 연구를 사용 하 여 수 있습니다. 이 프로토콜의 구체적인 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 widefield 형광 현미경,이 절차에 필요한 주요 장비입니다. 우리는 다른 탄성 계수의 부드러운 실리콘 기판의 영의 계수를 측정 하 여이 프로토콜을 보여 줍니다.

위에서 자세히 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여, 우리 준비 35 mm 페 트리 접시에에서 부드러운 실리콘, 30 분 동안 70 ° C에서 그것을 치료 하 고 형광 microbeads 결합 (및 콜라겐 나) 개요로 서 그림 1에 표시 된 위쪽 표면에. 깊은 UV 기판13커플링 최종 단백질에 대 한 이전 사용 되었습니다. (나) 경화 조건 여기에 사용 되는이 부드러?...

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Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

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Bioengineering

6.8K 조회수.  Old Dominion University. Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

비디오: Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

연구

생체공학

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

발생학

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

생물학

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell behavior such as cell function, differentiation, and motility. However, as these processes are not homogeneous throughout the whole organ, it has become increasingly important to understand changes in the mechanical properties of tissues on the cellular level.
To be able to monitor the stiffening of collagen-rich areas within the liver lobes, this paper presents a protocol for measuring liver tissue elastic moduli with high spatial precision by atomic force microscopy (AFM). AFM is a sensitive method with the potential to characterize local mechanical properties, calculated as Young&#39;s (also referred to as elastic) modulus. AFM coupled with polarization microscopy can be used to specifically locate the areas of fibrosis development based on the birefringence of collagen fibers in tissues. Using the presented protocol, we characterized the stiffness of collagen-rich areas from fibrotic mouse livers and corresponding areas in the livers of control mice.
A prominent increase in the stiffness of collagen-positive areas was observed with fibrosis development. The presented protocol allows for a highly reproducible method of AFM measurement, due to the use of mildly fixed liver tissue, that can be used to further the understanding of disease-initiated changes in local tissue mechanical properties and their effect on the fate of neighboring cells.

We present a protocol to measure the elastic moduli of collagen-rich areas in normal and diseased liver using atomic force microscopy. The simultaneous use of polarization microscopy provides high spatial precision for localizing collagen-rich areas in the liver sections.

편광 현미경과 결합된 원자력 현미경을 사용한 간 경화도 측정

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...