Name: simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses at JoVE.com

This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President&#8217;s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.

하이드로 겔 관련 솔루션 및 분취 1. 준비 <ol><li> 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액의 제조. <ol><li> 아크릴 아미드 (A)을 혼합하여 폴리 아크릴 아미드 겔 전구체 용액을 준비한다 (V / w 40 %, M은 r에 71.08 g / ㏖), 가교제 비스 아크릴 아미드 (B) (V / w 2 %, M은 154.17 g / mol 인 R), 및 탈 표 1에 규정 된 부피 백분율에서 이온수. 참고 :이 솔루션은 큰 일괄 적으로 준비하고 몇 개월까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. <ol><li> 주의 : 아크릴 아마이드는 흡입 또는 섭취시 독성, 특히 분말 형태로 할 때 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 40 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고에 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것 (&lt;23 ° C, 영역을 통풍이 잘되는). </li><li> 주의 : 비스 - 아크릴 아미드, 특히, 흡입하거나 섭취시 유독분말 형 : 따라서, 바람직하게는 독성의 위험을 줄이기 위해 / V 솔루션 w 2 %를 사용합니다. 이러한 장갑, 고글, 및 실험실 코트로, 보호 옷을 입고있는 동안 만 처리합니다. 냉장고 (&lt;4 ° C에서, 환기가 잘되는 장소)에서 차광, 밀폐 된 용기에 보관할 것. </li></ol></li></ol></li><li> 제조 및 N -Sulfosuccinimidyl -6- (4&#39;- 아지도 -2&#39;- 니트로 페닐 아미노) 헥사 노 에이트의 사용량 분취 (설포 SANPAH는 M은 492.40 g / 몰 R). 주의 : 설포 SANPAH 눈에 심한 자극을 일으킴; 장갑과 적절한 보안경 · 안면 보호구로 처리합니다. 스토어 수령시 -20 ° C에서 이전, 분취한다. <ol><li> 설포 - SANPAH를 저장하려면 : 50 ㎎ / ㎖에서 dimethylsulfoxane (DMSO)에 설포 SANPAH을 용해. 튜브 당 20 μl를 50 마이크로 원심 분리기 튜브에 원액을 나누어지는. 드라이 아이스 나 액체 질소에 플래시 동결 -80 ° C에서 저장 (최대 가교제 효율을 유지하기위한 선택 사항이지만 선호 단계). 참고 : 분취 캘리포니아N 수개월 동안 저장 될 수있다. </li><li> 설포 - SANPAH를 사용하려면 : 나누어지는 잠시 해동 및 탈 이온수 480 μL에 희석. 즉시 사용합니다. 설포 SANPAH 물에 빠르게 가수 분해 : 따라서 신속하게 위의 단계를 모두 수행 할주의하십시오. </li></ol></li><li> 과 황산 암모늄 (M R 228.18 g / mol)을 분취의 준비. 참고 :과 황산 암모늄이 눈, 피부, 호흡기에 자극을 일으킴. 취급시 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 화학 흄 후드에서과 황산 암모늄 분말을 처리합니다. 건조하고 통풍이 잘되는 곳에 보관 분말. 분취하면, 희석 용액은 작업대에 사용될 수있다. <ol><li> / V w 10 %의 최종 황산 암모늄 농도를 달성하기 위해 증류수에 황산 암모늄을 녹인다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 사용하기 직전에 해동. </li></ol></li><li> 콜라겐 타입 I 용액의 조제. <ol><li> 그래서 주식을 희석하여 0.2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 솔루션을 준비합니다산도 7.4의 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)의 기술인 것. 얼음에 잠시 보관 또는 희석 즉시 사용한다. </li></ol></li></ol> 2. 하이드로 겔 준비 (그림 1 참조) <ol><li> 소수성 유리 슬라이드의 준비. <ol><li> 유리판 상에 소수성 용액의 몇 방울을 넣고 표면을 가로 질러 확산하는 휴지를 사용한다. 공기를 건조 시키과 소수성 코팅을 균일하게 다시 티슈로 닦아냅니다. 참고 : RT에서 가연성 캐비닛에 보관 소수성 솔루션입니다. 취급시 개인 보호 장비를 착용 할 것. 환기가 잘되는 곳에서 작업 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유연한 플라스틱 지원 준비. <ol><li> 소수성 코팅 된 유리판의 크기에 맞게 유연한 플라스틱 지지체를 잘라. </li><li> 가볍게 같은 메스와 같은 날카로운 도구로 표면을 긁어서 유연한 플라스틱 지원의 소수성 측면을 표시합니다. 참고 : 젤 번 - 완전히 투명 - 마를스크래치 마크는가요 성 플라스틱 지지체 측을 포함하는 겔을 구별 할 수 있도록한다. 참고 : 유연한 플라스틱 지원은 소수성과 친수성 ​​측면이있다. 일단 침착, 폴리 아크릴 아미드가 영구적으로 쉽게 이후의 하이드로 겔 처리를 용이하게 플라스틱 지원의 친수성 ​​측면을 준수합니다. </li></ol></li><li> 젤 제조 예 (실시 예 5 ㎖ 볼륨 겔 전구체 용액 주어진다). 주 : 겔 초기 두께가 0.5 mm 인 경우는 5 ~ 40 ㎖의 겔을 제조하기에 충분하다. 겔 두께가 감소하는 경우는 겔을 제조 할 수있다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 원하는 최종 농도 (표 1)의 폴리 아크릴 아미드 전구체 용액의 4972.5 μl를 놓습니다. 열린 캡 30 분 동안 탈 가스 챔버에 배치합니다. 주 : 산소 자유 라디칼 트랩으로서 작용하며, 본, 그것을 중합을 억제한다. </li><li> 과 황산 암모늄의 v / w 10 %의 25 μl를 추가 최종를 달성하기 위해 (1.3 포인트 참조)0.05 %의 황산 암모늄 농도. </li><li> N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 메틸 에틸렌 2.5 μl를 추가 0.5 % TEMED 최종 농도를 달성하기 위해 탈기 겔 용액 (TEMED, M은 116.24 g / 몰 R). 참고 : 저장 TEMED 실온에서 가연성 캐비닛. 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 때 화학 흄 후드 취급 할 것. 이 높은 공기와 습기 민감로 단단히 불활성 가스 하에서 닫아 보관할 것. </li><li> 5 회 - 아래 3을 피펫 팅에 의해 부드럽게 솔루션을 섞는다. 겔 전구체 용액에 산소 확산을 피하기 위해 와동 마십시오. </li><li> 소수성 코팅 된 유리 슬라이드와 유연한 플라스틱 지원 및 샌드위치의 친수성면에 겔 용액을 피펫. 원하는 두께 (예를 들면, 0.5 mm)의 실리콘 스페이서 두 개의 슬라이드를 분리합니다. 겔화의 지표로서 사용하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 폴리머 전구체 용액을 소량 (~ 100 μL)를 떠난다. 참고 :상관 스페이서가 사용될 수있다. 120 μm의 - 예를 들어, 파라 필름의 하나의 스트립 (100)의 최종 두께 팽윤 된 겔을 준다. </li><li> 중합시에도 하이드로 겔 표면을 확인하기 위해 유연한 플라스틱 지원 / 젤 샌드위치 꼭대기 다른 유리 접시를 놓습니다. </li><li> 원하는 경우에 더 적은 시간이 더 높은 중량 %의 겔에 사용될 수 있지만, 겔, 45 분 동안 중합하자. 겔 중합 된 것을 확인하기 위해, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 남은 용액을 관찰; 나머지 용액을 겔화 한 경우, 그때는 유리판뿐만 아니라, 겔화 개시되었음을 보인다. 그러나, 몰드의 개방 완료 조기 중합을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 겔이 형성되면, 상부에 공유 적으로 부착 된 폴리 아크릴 아미드 겔로가요 성 플라스틱 지지체를 박리하고, 자연 건조 겔 - 측 업을 설정한다. 주 : 대류 나 가열 건조는이 공정을 촉진시킬 수있다. 가요 성 플라스틱 지지체 상에 건조 후, 겔 저장소 일 수있다무기한 거라고. <ol><li> 폴리 아크릴 아마이드 젤이 거품으로 인해 형성하지 않은 유연한 플라스틱 지원의 벌거 벗은 반점을 표시합니다. 젤은 건조되면이 유연한 플라스틱 지원 조화 ​​것으로 표시 겔 여전히 수화된다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 멀티 웰 플레이트 조립, 콜라겐 코팅 및 살균 <ol><li> 멀티 웰 플레이트 어셈블리. <ol><li> 건조되면, 원하는 모양으로 PA 젤을 잘라. <ol><li> 96- 웰 플레이트를 들어, ~ 6mm 직경의 대형 구멍 펀치를 사용한다. 정사각형 또는 직사각형 모양으로 젤을 잘라 대형 종이 커터를 사용합니다. 또한, 가위를 사용합니다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 96 웰 플레이트 당 PDMS의 약 500 μl를 준비합니다. 멀티 웰 플레이트의 바닥에 겔 아교, 각 웰의 중앙에 작은 물방울은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 (~ 5 μL)를 올려. 집게를 사용하면, 하나의 폴리 아크릴 아미드를 배치아래 각 웰, 유연한 플라스틱 지원 측면에서 전자 젤. PDMS는, 치료 4 시간의 최소 37 ° C에서 조립 판을 떠날 수 있도록합니다. </li></ol></li><li> 폴리 아크릴 아마이드 겔의 콜라겐 코팅. <ol><li> 전송 피펫으로 소량의 배치 - 설포 - SANPAH (7 8 μl를) 겔 표면에 균일하게 코팅 좌우로 잘 소용돌이 각 (1.2.2를 가리 키도록 참조). 설포 - SANPAH 물 안정되지 않기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 - (365 nm의 강도 = 37 mW의 λ = 302) 고강도 UV 램프에서 잘 플레이트를 놓습니다. 초과 설포 SANPAH을 제거하기 위해 PBS와 젤을 씻어. </li><li> 50 μL 0.2 mg을 피펫 / ㎖ 콜라겐 유형 I 솔루션을 각 웰에 (1.4 포인트 참조). 4 ℃에서 적어도 2 시간 또는 O / N RT에서 커버 플레이트를 남겨주세요. 주 : 콜라겐 코팅 프로세스 속도, 전송 피펫은 콜라겐 용액을 부가하는데 사용될 수있다. 일반적으로, 1 - 시액 2 방울을 완료하기에 충분합니다LY는 겔 표면을 커버. </li><li> 콜라겐 결합을 가능하도록 적어도 2 시간 동안 RT에서 웰 플레이트를 남겨. </li><li> 2 시간 동안 조직 배양 후드에서 과도한 콜라겐 용액을 제거하고, UV (λ = 200 ㎚) 하에서 멸균 PBS로 씻어. </li><li> 수분과 평형을 O / N (중간 컴포지션 4.1 절 참조) 완전한 매체에 젤을 만끽. 셀은 최대 2 일 동안 냉장고에 바로 저장하거나 시드에 사용합니다. </li></ol></li></ol> PA 강성 분석 4. 셀 시드 음표 : 공통 포유류 세포주 전형적인 있지만,이 섹션에 설명 된 프로토콜을 구체적 유방암 MDA-MB-231 세포주와 함께 사용된다 (도 4 및 5 참조). <ol><li> 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 트립신 / EDTA에 노출 조직 배양 플라스크로부터 세포를 수집한다. 문화 플라스크 영역의 각 cm 2 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용; 예를 들면, fo를 트립신 / EDTA 2 ㎖를 사용하여라 T25 세포 배양 플라스크. 다시 일시 원하는 최종 세포 농도로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 완전 배지에 세포를 수집. 계정 배가 시간 셀뿐만 아니라 세포 분석법에 접종 될 시간의 길이를 고려하여 적절한 서브 - 융합 세포 농도를 선택한다. 추가 매체가 완전히 하이드로 겔 잠수함 충분히 있는지 확인하십시오. 참고 : 하이드로 겔이 매체에 미리 평형 되었기 때문에 충분해야 100 μL 볼륨 (3.2.6 단계를 참조하십시오). 젤 이전 단계에서 언론에 사전 평형 되었기 때문에 멀티 웰 플레이트에 사용되는 일반적인 매체 볼륨은 충분합니다. 주 : 분석은 첨부 파일에 의존하는 세포 유형에 적합한 것입니다. <ol><li> hemacytometer를 사용하여 반전 현미경 세포 수를 계산. 로드 (10) 각각의 포트에 hemacytometer 세포 현탁액 μL 및 적어도 8 사분면에서 세포 수의 평균. 를 얻으려면최종 세포 농도가 10 (4)에 의해 세포 수를 곱한다. 참고 : 각 hemacytometer 사분면에 휴대폰 번호가 20 인 경우 최저 세포 수의 결과를 얻을 수있다 - (50). </li></ol></li><li> 문화 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 PA 강성 분석 상 세포와 5 % CO 2. 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. 5 분 동안 37 ° C에서 5 % 트립신 / EDTA에 노출 됨으로써 필요할 때 세포를 수집한다. 조직 배양 플라스크의 cm 2 당 트립신 / EDTA의 ~ 80 μl를 사용합니다. 약간 옆으로 멀티 웰 플레이트 팁과 하이드로 겔을 터치 반대로, 잘 각각의 측면 벽에 피펫 팁을 터치하여 흡인 또는 피펫 매체 : 모든 세포 조작 단계 동안, 특별한 하이드로 겔 표면을 방해하지 않도록주의하십시오. 주 : 표준 조직 배양 처리 동안 하이드로 겔의 표면을 손상하지 않도록 특별한주의하면서 제외한 세포들은 시딩에 것처럼 강성 분석법 동일한 방식으로 조작 할 수있는 상으로 접종일반 멀티 웰 플레이트. </li></ol> PA 강성 분석에 시드 세포의 5. 이미징 <ol><li> 직접 PA 강성 분석에 이미지 세포. 주 : 상관 현미경 - 반전, 형광 또는 공 촛점은 세포 이미징을 위해 사용될 수있다. 주 : 강성 분석법을 구성하는 데 사용되는가요 성 플라스틱 지지체는 완전히 투명하며 autofluoresce 또는 세포 이미징을 방해하지 않는다. 그러나,가요 성 플라스틱 지지체 자체가 투명한 경우에도, 결상 성능이 목표의 작동 거리에 의해 제한 될 것이다. 가요 성 플라스틱 지지체는 급격히 감소에 대해 높은 배율, 0.23 mm의 두께 및 10X 대물 렌즈의 작동 거리 전형적인 ~ 4mm 인을 갖는다. <ol><li> 라이브 세포 이미징의 경우, 현미경 플레이트 홀더와 이미지의 위치 PA 강성 분석. 2 시간에서 영상 세션을 유지, 이상 이미징 회 환경 챔버가 장착 된 현미경을 사용합니다. </li><li> 때 살아있는 세포 메신저노화 목표 아니다, 0.1 %의 세제를 보충 4 % 포름 알데히드 용액에 세포를 고정합니다. 2 시간 이상 동안 실온에서 세포를 고정액에 담근다. PBS로 2 회 씻어. 지정 폐기물 용기에 정착 폐기물을 폐기하십시오. 참고 : 세포는 즉시 이미지를 만들 수 있습니다 또는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 PBS에 빠져들 저장됩니다. 주의 : 포름 알데히드는 흡입 및 접촉시 독성. 화학 흄 후드 장갑으로 처리합니다. 주 : 특정 고정 제는 일부 세포 단백질을 손상하기 때문에 세포 정착 프로토콜은 후속하는 세포 염색 및 처리 프로토콜에 기초하여 선택되어야한다. </li><li> 형광 이미징의 경우, 얼룩은 멀티 웰 플레이트에서 직접 원하는 셀 얼룩 세포를 고정. 이미지 즉시. </li></ol></li></ol>

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	<li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function.">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3, 299-306 (2007).</li><li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction:+A+stiff+response.">Mechanotransduction: A stiff response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Watt, F. M., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+extracellular+matrix+in+regulating+stem+cell+fate.">Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).</li><li>Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiwell+stiffness+assay+for+the+study+of+cell+responsiveness+to+cytotoxic+drugs.">Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs.</a> Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).</li><li>Mih, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+platform+for+studying+stiffness-dependent+cell+biology.">A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology.</a> PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).</li><li>Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+hydrogels+with+steep+stiffness+gradients+for+studying+cell+mechanical+response.">Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response.</a> PloS one. 7 (10), e46107 (2012).</li><li>Herrick, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).</li><li>Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+matrix+elasticity+with+PEG+hydrogels+to+study+melanoma+drug+responsiveness.">Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness.</a> Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+stiffness+influences+the+outcome+of+antitumor+drug+screening+in+vitro.">Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro.</a> Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).</li><li>Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Three-Dimensional+Matrix+Stiffness+in+Regulating+the+Response+of+Human+Neural+Cells+to+Toxins.">Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).</li><li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype.">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS one. 5 (9), e12905 (2010).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).</li><li>Kumachev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+hydrogel+microbeads+with+varying+elasticity+for+cell+encapsulation.">High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation.</a> Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+cell+function+with+geometrically+modulated+elastomeric+substrates.">Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates.</a> Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties.">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Lo, C. -. M., Wang, H. -. B., Dembo, M., Wang, Y. -. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate.">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+adipogenesis+of+adult+adipose-derived+stem+cells+using+substrates+that+mimic+the+stiffness+of+adipose+tissue.">Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue.</a> Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).</li><li>Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hepatocellular+morphogenesis+and+function+via+ligand-presenting+hydrogels+with+graded+mechanical+compliance.">Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance.</a> Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).</li><li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+mechanical+communication+through+compliant+substrates.">Cell-cell mechanical communication through compliant substrates.</a> Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Quinlan, A. M., Billiar, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+role+of+substrate+stiffness+in+the+persistence+of+valvular+interstitial+cell+activation.">Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).</li><li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolytically+degradable+poly(ethylene+glycol)+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties.">Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li><li>Chrambach, A., Rodbard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Science. 172 (3982), 440-451 (1971).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+of+substrate+thickness.">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).</li><li>Chrambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).</li><li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+force+microscopy.">Cell adhesion force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).</li><li>Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+generating+patterned+co-cultures+with+stable+interfaces.">A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces.</a> BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).</li><li>Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+molecules+and+fibronectin-mediated+cell+adhesion:+effect+of+proteolytic+digestion+of+membrane+proteins.">Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins.</a> The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).</li><li>Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creasing+instability+of+surface-attached+hydrogels.">Creasing instability of surface-attached hydrogels.</a> Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).</li><li>Saha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+creasing+instability+of+soft+polyacrylamide+cell+culture+substrates.">Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates.</a> Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre&#8217;EX, B., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).</li><li>Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+force+microscopy+on+elastic+layers+of+finite+thickness.">Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness.</a> Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

원래 개발 된 전기 영동 겔은 폴리 아크릴 아미드, (28)은 현재 일상적으로 세포 형태, 운동성 및 다른 전지 특성 간의 통신 3,24,29 기판에 강성의 영향을 연구하는 세포 배양 용 기재로서 사용된다. (그림 2, 표 1도 참조 17,25,26 참조) 고분자 전구체 농도의 간단한 변화 - (300 kPa의 0.3) (1) 폴리 아크릴 아미드는 기판 강성의 조작은 신체의 모든 연부 조직의 강성을 포함 할 수 있습니다. PA 겔은 비교적 저렴​​하고 제조하기 간단하다는 사실에 결합 그들은 강성 - 의존성 세포 - 물질 상호 작용의 연구에서 불가결 플랫폼되었다. 간단한 작업에도 불구 그러나, PA 겔을 제조하는 현재의 기술은 작은 배치로 제한된다. 이 제한은 황산 암모늄에 의해 촉매 자유 라디칼 중합이다 하이드로 겔의 겔화 특성, 유래반응은 자유 라디칼 중합 연쇄이므로 및 TEMED. 30, 그것은 산소와 같은, 자유 라디칼 트랩 역할 어떤 요소에 의해 억제 될 수있다. 부드러운 젤 45 분까지 걸릴 수 있습니다 - - 고분자 용액에 산소 확산은 중합시 피해야해야하기 때문에 따라서, 단순히 오픈 멀티 웰 플레이트에 PA 젤 피펫 팅 가능하지 않습니다. 또한, 2 차원 셀 기판으로서 사용할 수 있도록, PA 겔의 표면은 평평해야한다. 산소 확산을 억제하고, 겔 표면 평탄화 - 상기 요건 모두 즉 2D 셀 기판은, PA 겔 전구체 용액 중합시 두 평면 사이에 샌드위치한다로서 PA 겔을 생산 지시. 또한, 상부면은 쉽게 세포 부착을위한 표면을 노출 겔로부터 박리 할 수​​있는 것이어야한다. 이것은 일반적으로 유리 표면의 소수성 코팅함으로써 달성된다. 마지막으로, 일에 위치 할 때멀티 웰 플레이트의 전자 우물, PA 젤은 전체 잘 표면을 커버해야 부동 제한 될 수있다. 세포를 평가하기 위해 사용 된 분석은 웰 (예를 들면, MTT)에서 고려 전체 세포 집단을 얻어 형 어디에 전체 웰 저면에 따르면 애플리케이션에서 특히 중요하다. PA 겔 적절히 잘 전체 표면을 커버하지 않는 경우, 세포는 치료를 쉽게 유리 또는 플라스틱 상에 겔 롤오프 수 있으므로 노출 웰 표면에 세포 부착을 차단하도록주의해야한다. 필요한 경우, 블로킹 BSA 표준 프로토콜에 따라 또는 오프 선반 BSA 계 세포 접착 블로킹 키트 웰 플레이트의 바닥에 세포 부착을 차단하기에 충분해야 사용. 예를 들어, BSA 덮인 표면을 준비하기 위해, 0.5 ㎎ / PBS에서 BSA ㎖의 용액의 pH 7.4 PBS로 세정 RT에서 20 분 동안 조직 배양 접시 상에 흡착시키고 즉시 사용하거나 4 ℃에서 보관해야 이주까지. BSA는 세포 부착을 차단하는 O 나타났다크게 저감 세포 접착 힘에 의해 모두 친수성 및 소수성 폴리스티렌 표면에 F 포유 동물 세포 배양 물 원자력 현미경에 의해 측정. 31 BSA뿐만 아니라 셀 패터닝 표면들을 생성 포유류 세포 부착을 차단하는 일상적으로 사용되어왔다. 32,33 이 문서에 묘사 된 기술, 만족 사용자 정의 크기와 모양이 균일 PA 젤의 대량 생산을 가능하게 위의 요구 사항을 모두. 이 기술은 두 개의 유리 커버 슬립 사이 PA 겔 전구체 용액을 개재 현재 표준보다 더 간단하고 더 효율적이다. 또한, 임의의 복잡한 장비를 요구하지 않으며, 따라서 쉽게 연구소에 의해 채용 할 수있다. 그것은 단지 고가없는 유리판 또는 커버 글라스의 사용을 필요로 할뿐만 아니라 제한된 크기로 제공하지 않는 또한보다 비용 효과적이다. 기술은 여러 가지 이유로도 빠르다. 먼저, 임의의 예비 처리 단계를 포함하지 않는다영구적으로 폴리 아크릴 아미드 쉽게 겔을 형성 한 후에 박리 될 수있는 소수성 측면에 부착 친수성 ​​측면 - 유연한 플라스틱 지원은 두 가지면으로 설계되어 있기 때문에 유리 표면에 대한 일반적인. 얇은 젤이 벗겨 두 개의 유리 슬라이드 사이에 형성 될 때 상단 소수성 슬라이드가 어렵고 종종 젤을 훼손 파손 결과 : 플라스틱 지원이 유연하기 때문에 둘째, 그것은 쉽게 형성 젤을 떼어 빠릅니다. 45 분 (표 2)만큼 취할 수있는 표준 TEMED 계 중합 반대로 마지막 때문에가요 성 플라스틱 지지체 투명성 빠르게 UV 중합을 이용할 수있다. 표 2의 데이터는, 중합 시간, UV 광 강도가 최적화되어 유사 강성 모두 TEMED 및 UV 중합 방법에 의해 달성 될 수 있다는 점을 입증 해 보여준다. 하이드로 겔은 유연성 (PL)에 준비가되어 있습니다그 때문에 중합체 용액을 끼우는 두 표면 사이의 산소 확산에 겔의 가장자리 (즉, 에지 효과)의 불완전한 중합을 방지하기 위해 탈기 챔버에서 겔화 이루어져야 만도 1에 도시 된 바와 같이. ASTIC 지원. 목적은, 따라서, 임의의 크기의 유리판이 적절할 것이다 유연한 플라스틱 지지체 위에 큰 하이드로 겔 필름을 만들 수 있지만이 달성 될 수있다 아크릴 아미드 필름의 크기를 지시 할 것이다. 유리는 임의의 소수성 코팅 또는 대안 적으로,가요 ​​성 플라스틱 지지체의 소수성면이 대신 사용될 수로 코팅 될 수있다. PA 겔 막이 형성되면,이를 건조하여 원하는 형상으로 절단 한 후 사용 전에 재수된다. 건조시, 겔은 무한정 저장 될 수있다. 이것은 PA 겔 강성 겔은 수개월 (도 2c)에 대한 건조 상태로 저장되는 경우에도 재수 화시 불변임을 레올 로지에 의해 확인 하였다. 그러나, 매우 강도t 젤 (≤ 1 kPa의 영률) 건조 및 재 수화 악화 표면 주름과 형성 균열. 이 동작은 기하학적으로 제한하면서 드 수화 이후 다시 수화를 받아야 부드러운 젤 일반적입니다. 나 때문에, 시각적으로 이전에 사용하는 하이드로 겔을 검사 할 수 있으며, 34, 35 모든 젤 주름 균열 만 샘플을 사용 즉, 매끄러운 표면을 표시. 완전히 주름 형성 및 갈라짐,도 6에 도시되어 소프트 하이드로 겔을 제조하는 다른 방법을 피하기 위해. 여기서,가요 성 플라스틱 지지체가 원하는 형태의 프리 컷이며 PA 겔이 상부에 형성되고, 이에 따라, 겔은하지 해제 수화 할 수 있지만 준비로 사용할 수 있습니다해야합니다. 이 대안적인 전략의 추가적인 이점은 ~ 2.5 이상의 겔은 하이드로 겔 전구체 용액 (추정이 프로토콜 절에 설명 된 바와 같이 표준 96 웰 플레이트 용 젤의 제조에 기초한다)의 동일한 볼륨에서 제조 될 수 있다는 것이다. 한 가지주의 할 때이와 같이 하이드로 겔을 제조하는 것은 특히 작은 크기 (예를 들면, 겔은 96 웰 플레이트에 사용되는)의 겔의 경우에는 산소의 침투를 방지하는데주의를 기울여야한다. 겔 전구체 용액을 완전히 탈기되는 경우에도, 즉, 무산소, 산소 PA 용액을 끼우는 두 표면 사이에 확산 될 것이다. 따라서, 에지 효과 나 가장자리를 따라 불완전한 겔 형성을 방지하기 위해서는, 중합을 산소의 부재하에 일어날 수 있도록하는 것이 최상이다. 우리의 경험에서, 진공 챔버는 불활성 가스 환경이 동일 성공 사용될 수있다하더라도, 잘 작동한다. 세포 기질 강성 - 의존성 세포 반응을 테스트하도록 PA는 하이드로 겔의 제조, 얻어진 하이드로 겔의 두께는 중요하다 때 마지막주의 : 매우 얇은 겔 들어, 세포는 하부 기판을 감지 할 수있는 이론과 실험을 사용하여 36. 린 등 알. 증명하는 깊이있는 세포가 철을 할 수에서EL은 하부 기판은 셀의 측방 치수에 의존한다. (29) 현재의 연구가 수 마이크론으로부터 36만큼 60 미크론으로 &quot;숨겨진&quot;기판 감지로부터 세포를 방지하기에 필요한 최소 두께를 식별 모순이므로 100 ㎛의 37 최소 겔 두께를 목적으로한다. 멀티 웰 플레이트에 PA 겔을 조립할 때, PDMS의 작은 물방울은 웰의 바닥에 겔을 고정하기 위해 사용된다. 플레이트 조립체를위한 충분한 시간을두고 8 시간 - 그것이 경화시에 영구 접착제 역할을하기 때문에 PDMS 그것은 완전히 비 독성이며, 약 4 경화, 완전 투명하고, 후속 현미경 실험을 방해하지 않는, 선택되었다. 안전하게 세포 처리에 잘 보조기구의 바닥에 히드로 겔을 확보 : 단단히 고정하지 않을 경우, 예를 들어, 활발한 세척 하이드로 젤을 제거 할 수있다. 만약 세포 m에서 자주 변경edia 후 겔 글리세린 일시적으로 세포 독성 및 높은 점성 액체의 작은 물방울에 의해 웰의 표면에 고정 될 수있는 우려 아니다. 세포 파종 전에 마지막 단계는 젤 후 살균의 ECM 코팅을 포함한다. 여기 콜라겐 타입 I 코팅은 동일한 기술이 임의의 다른 ECM 단백질에 적용 할 수 있지만 (도 3)에 도시되어있다. 관능 가교제 술포 SANPAH 심지어는 단층 코트를 달성하기 위해 이용된다. 이전의 연구는 이러한 공유 부착 단순 단백질 흡착보다 더 균일 한 코팅을 수득하고, 간단히 다양한 농도의 단백질 용액을 이용하여 부착 된 단백질의 양의 12 배의 튜닝을 허용 것을 증명했다. (6) 마지막으로, 조립 된 멀티 웰 겔 플레이트 2 시간까지에 대한 조직 배양 후드에서 UV 살균 처리된다. 분석 후드, 외부 실험실 벤치에 조립하는 UV 살균 수있는전반적인 프로세스는 빠른 물류 간단하고 만든다. 도 4 및도 5는 다양한 강성의가요 성 플라스틱 지지체 부착 PA 젤에 배양 MDA-MB-231 유방암 세포에서 일부 대표적인 결과를 도시한다. 그들은 그들의 형태에서 측정 가능한 변화에 의해 하부 기판 강성에 반응하는 것으로 나타났다 때문에 MDA-MB가-231 세포에있어서 유틸리티를 증명하기 위해 선택되었다. -5,12- 예상 한 바와 같이, 세포가 더 긴이었고에 큰 확산 영역 있었다 소프트 0.5 1 kPa의 PA 젤에 비해 뻣뻣한 100 kPa의 PA 젤 (그림 4, 5). 도 4의 하단 행은 또한가요 성 플라스틱 지지체 형광 현미경 촬상을 방해하지 않는다는 사실을 보여주는, 세포핵과 세포질 염색 두 형광 염료의 사용 예를 보여준다. 요약하면, 간단한 방법에 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제조멀티 웰 플레이트 형식이 표시됩니다. 기술은 유효한 다르게 크기뿐만 아니라 사용자의 겔의 제조를 가능으로 세포 기질로서 사용하기에 더욱 빠르고 효율적이며 PA 겔을 제조하는 현재의 방법보다 비용이 많이 든다. 그것은 임의의 특수 장비를 필요로하지 않기 때문에,이 방법은 쉽게 어떤 연구 실험실에 의해 채택 될 수 있으며, 강성 - 의존성 세포 반응을 이해 집중 연구에서 특히 유용 할 것이다.

몸에있는 대부분의 조직은 1 ~ 조달 협정 계수가 0.1 kPa 내지 부드러운 연골 100 kPa의 뇌, 아직, 체외 세포 연구에서 대부분의 조직 배양 폴리스티렌 (TCP)에 실시에 대한 범위의 탄성 계수와 부드러운 점탄성 물질이다 . 1이 강성 불일치가 크게 세포가 자신의 환경에 반응하는 방식에 영향을 미친다. 연구 성장 본체, 2,3- 줄기 세포를 포함. 그 결과 4 다양한 세포 유형의 운명에 기판의 강성의 영향을 밝히기에 따라서 전용 인 다중 하이드로 겔 강성 - 의존성 세포의 이해를 돕기 위하여 개발되어왔다 기판 강성 세포 운명에 상당한 영향을 미치고 있다는 증거가 증가하고 있지만, 폴리 아크릴 아미드 (PA), 5-7, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 8,9 디메틸 실록산 (PDMS), (10) 및 알긴산 포함한 생물학. 11, 가장 연구가 실시되고 (S)의 수가 적은 소규모불가능한 명령어. 세포 유형 또는 환경 조건이 드물다의 배열을위한 기판 강성의 효과에 대한 체계적, 다차원 연구. (12) 몇몇 유망 높은 처리량 하이드로 겔 기술은 PEG 계 마이크로 어레이, 강성 마이크로로드의 직경 및 높이에 의해 변조되고, 아가 로스 겔 마이크로 비드 (14) 또는 마이크로 및 나노로드의 제조를위한 (13)의 마이크로 유체 장치를 포함하여, 개발되어있다. (15) 그러나 , 기술은 기판 정교하고 실험실의 수가 제한되어 있습니다 제조한다. 강도 변조 된 세포 반응을 포함하는 많은 연구가 구현뿐만 아니라, 영률, 즉 0.3의 생리 학적으로 중요한 범위 발휘할 만 저렴하고 간단하지 않은 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔 이용한다 -. 300 kPa로를 16-22 그러나 PA를 제조하는 방법을 기존 세포 배양 젤은 노동 집약적 결과적으로 준비하다작은 일괄 ared. 세포 기질로서 PA 겔의 제조와 관련된 문제의 일부가 겔을 제조 할 필요가 요구 유래한다 : 1) 산소의 부재하에 완전한 중합을 허용하기 위해, 2) 평활 한 표면과 균일 한 셀을 허용 부착 및 확산, 3) 부동 영구적 방지 세포 배양 접시의 바닥에 부착. 몇몇 그룹은 대형 일괄 적으로 세포 배양을위한 PA 젤을 생산하려고했습니다. 셈러 등. 홀 펀치 후 &quot;컷&quot;이었고, 96 웰 플레이트에 배치 PA 젤의 준비 두께의 시트. (23) 그러나이 방법은 엄격한 젤, 즉,&gt; 1 kPa의 영률, 부드러워로 제한됩니다 젤은 삭재하고 쉽게 손상 &quot;끈적 끈적한&quot;입니다. MIH가 외. 겔 직접 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에서 중합 될 수 있도록 더 정교한 기술을 개발 하였다. <s최대&gt; (6)이 작용 유리 바닥 판에 겔 솔루션을 따르고 사용자 정의 커버 글라스 배열로 &quot;를 사이에두고&quot;에 의해 겔을 형성함으로써 달성되었다. 6 비록 매우 유망한, 약간의 가장자리 효과는 아직이 기술로 관찰되었다. 또한,이 기술은 많은 실험실뿐만 아니라 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트에 즉시 액세스 할 수없는 맞춤 설계 배열이 필요합니다. 이 논문은 쉽게 실험실에 의해 채택 될 수있는 멀티 웰 플레이트에서 PA 젤을 조립하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 구충제는 PA 젤에있는 소수성 하나, 및 공유 증착에 PA 젤을 결합하는 친수성 ​​하나, - 여기, 유연한 플라스틱 지원은 두 가지 측면이있는, 사용된다. PA 겔 시트는가요 성 플라스틱 지지체에 부착 된 영구 증착이 된 후, 임의의 두께 나 강성의 겔을 처리하고 임의의 바람직한 형태로 절단 가능하게한다. 이 APPRoach는 PA 결합 액으로, 커버 글라스 또는 비용이 많이 드는 유리 바닥 멀티 웰 플레이트의 우물를 달리 상업적으로 사용할 수없는 크기의 사용자 정의 플라스틱 &#39;된 커버&#39;를 생산하고, 또한 유리 표면 - 치료의 사전 할 필요성을 미연에 방지뿐만 아니라 지루하고 시간 소모적 인 단계를 포함한다. 마지막으로, 균일 PA 겔 시트를 큰 배치로 제조하고, 몇 달 동안 탈 수화 저장 될 수있다. 요약하면, 여기에 제시된 분석은 몇 가지 측면에서 기존의 방법에 비해 개선이다. 첫째, 멀티 웰 플레이트 조립체의 프로세스는 효율적이고, 요구되는 물질의 총 비용은 낮다. 둘째, 하이드로 겔은 하나의 균질 한 겔 필름에 큰 일괄 적으로 생산된다. 마지막으로, 상업적으로 사용할 수있는 유일한 재료가 필요합니다. 분석의 유틸리티는 세포 형태에 강성 기판의 효과를 탐구하고 확산 영역으로 도시된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic solution &amp;#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37% Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA-based cell adhesion blocking kit &amp;#8212; ECM Cell Adhesion Array Kit</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Disposable lab equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>flexible plastic support &amp;#8212; GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Glass Plates</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals tubes</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (flat bottom)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pipettes (1&amp;nbsp;ml, 2&amp;nbsp;ml, 5&amp;nbsp;ml, 10&amp;nbsp;ml, 25&amp;nbsp;ml, 50&amp;nbsp;ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&amp;nbsp;ml: 05214038, 5&amp;nbsp;ml (FALCON): 357529, 10&amp;nbsp;ml: 13-678-11E, 25&amp;nbsp;ml: 13-678-11, 50&amp;nbsp;ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Glass Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4&quot;: 1367820A, 9&quot;:136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;#956;l, 101-1000&amp;nbsp;&amp;#956;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&amp;nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Powder Free Examination Gloves</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacers &amp;#8212; Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Large/non-disposable lab equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UV oven</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber/degasser</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump for degasser</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

폴리 아크릴 아미드 (PA) 하이드로 겔 널리 강성 - 의존성 세포 반응을 테스트하는 데 사용된다. 17,24을 아크릴 아미드 (A), 비스 - 아크릴 아미드 (B) 중 하나는 가장 연조직 강성 범위에 걸쳐 PA 겔을 만들 수있는 다양한 농도의 혼합함으로써 몸 - 0.3 -.. 여기에 300 kPa의 탄성 계수 (1) 그러나, 폴리 아크릴 아마이드 겔의 준비 지루한 시간이 종종 예를 들어 약물 스크리닝으로 &quot;높은 처리량&quot;애플리케이션의 유용성을 제한, 소모 (12), 간단하고 빠른 방법 (도 1) 제시된 멀티 웰 플레이트에서 PA 겔 또는 임의의 다른 바람직한 조직 배양 용기된다 조립.도 2a는 몇몇과 B 농도의 함수 (또한, 표 1에 요약)로서 영률을 나타낸다. 추가적인 B와 조합 계수는 문헌에보고되어있다. 17,25,26 완전히 swolle의 겔 강성10 ㎐, 및 2 %의 일정한 스트레인 - N 겔은 20mm 상부 평행 형상, 발진 주파수 스위프 시험 1 리올 로지 (AR에 2000EX 유량계, TA 인스트루먼트)로 측정 하였다. 예상 된 바와 같이, 그것은 모두 저장 모듈러스, G &#39;, 손실 탄성률 G &quot;는, 주파수 (도 2B)와 무관 한 것으로 입증되었다. 또한, 후 건조하고 다시 수화 젤 것을, 그들의 영률 (도 2C)에 영향을주지 않았다 확인되었다. 영률은 다음 식으로 저장 탄성률에 관한 하였다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52643/52643eq1.jpg" /> 여기서, E는 영률이고, V는 PA 겔 0.5에 근사 하였다 포아송 비이다.보고 된 값이 하이드로 겔로 제조 TEMED 용으로 27 주있다. 노출 시간 및 UV 강도가 최적화 될 때 PA 하이드로 겔은 UV 가교 결합에 의해 제조 될 수있다 ( <strong&gt; 표 2). 전반적으로, 우리의 경험은 먼저 프로토콜을 확립하는 것은 작업자의 기술에 의한 변화로 매우 중요 할 때 정기적으로 특히 하이드로 겔의 강도를 측정하는 것은 드문 일이 아니라는 것이다. 레올 하이드로 겔의 벌크 강성을 측정하기위한 최적의 기술을 확립시킨 상태 원자력 현미경 (27)과 같은 5,7 다른 방법이 적합하다. 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 혼자 불활성; 따라서, 유도하는 세포 부착 세포 외 기질 분자는 별도로 추가해야합니다. 콜라겐 타입 I은 하이드로 겔 코팅을 위해 선택되었지만, 동일한 방법이 코트 원하는 다른 세포 외 기질 (ECM) 단백질에 사용될 수있다.도 3은 보여주는 가교제 술포 SANPAH 임의 강성의 하이드로 겔에 균일 콜라겐 코팅을 사용하여 달성 될 수있다. (5) 또한, 셀이 상이한 stiffne의 하이드로 겔에 시드 것을 증명 하였다SS는 서로 다른 형태를 나타내었다. 72 시간 -이 실험을 위해, 유방암 MDA-MB-231 세포를 24 PA 젤 위에 씨앗을 품고 있었다. 세포는 37 ° C, 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 배지에서 배양 하였다. 세포를 96 웰 플레이트 / 웰의 1 × 105 세포 / ㎖ 또는 1 × 104 세포로 시딩 하였다. 전형적인 세포 시딩 밀도 - 포유 동물 세포주가 컨 플루 ~ 1 × 105 세포 / cm 2에서 포화 상태에 도달 할 때 셀 밀도보다 낮은 4 배량 이용한다. 이미지는 모양 기술자 및 면적 소프트웨어 플러그인을 통해 ImageJ에에 거꾸로 형광 현미경 촬영 및 분석 하였다. 그것은 24 시간 동안 PA 젤에 파종 할 때, 유방암 MDA-MB-231 세포가 부드러운 0.5 일 인민군 젤에 둥근 남아 있지만, (그림 4) 확산과 뻣뻣한 100 kPa의 겔에서 연장 할 수 있었던 것을 관찰되었다. 그림 4는 showcasES 하이드로 겔은 유연한 플라스틱 지지체 위에 한 것으로 사실은 투명하고 쉽게 시각화 및 현미경 허용한다. 더욱이,가요 성 플라스틱 지지체는 형광 표지 된 세포의 촬상을 방해하지 않는, 따라서 autofluoresce하지 않는다. 원형도 (도 5) - 세포 형태는 상기 셀 영역과 형상 계수 확산 전체 셀 정량화 하였다. 세포 확산 영역은 각 셀의 경계를 추적하는 마스크를 생성하여 측정 하였다. 셀 형상 (원형)은 다음 관계식으로부터 계산되었다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52643/52643eq2.jpg" /> 1 라운드 세포를 지정 찍은 0 - - 0.5는 신장 세포를 지정 찍은 0.6 1, - 원형도는 10-0의 규모에 측정된다. 적어도 약 3 개의 독립적 인 실험에서 세포 삼백 각 데이터에 대해 분석 하였다 Poin입니다<html> t. 차이는 통계 데이터 세트가 &lt;0.05 때 P 상당히 다른 것으로 간주 하였다 분산의 단일 요인 분석 (ANOVA)에 기초하여 산출 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52643/52643fig1.jpg" /> 그림 유연한 플라스틱 지원에 폴리 아크릴 아미드 겔 준비의 도식 표현입니다. 그림은 유연한 플라스틱 지원에 PA 젤의 제조에 관련된 다양한 단계를 나타냅니다. 겔이 완전히 건조 후, 컷 또는 임의의 바람직한 형상으로 펀칭 할 수있다. 96 웰 플레이트 용 젤을 제조 할 때 중장비 종이 절단기는 정사각형 또는 직사각형 형상을 위해 사용될 수있는 반면 전체 펀치 (~ 6mm 직경), 가장 편리하다. 또한이 그림으로 그리고 젤없이 모두, 우물의 가장자리를 강조하는 완전한 아니라 바닥 커버리지는이 방법으로 달성 될 수있다 보여.<html> OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52643/52643fig2.jpg" /> 레올 로지에 의해 측정 된 PA 그림 2. 강성은 하이드로 겔. (A) 다섯 가지 A &amp; B 농도 (두문자어 표 1 참조)에 대한 주제 영률 (B) 주파수의 함수로서 저장 및 손실 탄성률 레올로 측정 한 (C) 겔이 초기에 동일한 영률을 나타내고 (초기) 이들은 건조되었으며 수화 된 후에 다시 (재수) 중합체 전구체 농도와 무관. (완전 팽창시) 1.5 mm 높이 - 레올 로지 측정을위한 모든 젤은 20mm 직경 1의​​ 석판으로 제조 하였다. /52643fig3.jpg &quot;/&gt; PA 젤에 그림 3. 콜라겐 코팅. 콜라겐 코팅 (녹색)을 효율적으로 분산 PA 젤 (빨간색) 하이드로 겔 강성 탄성 계수의 표면 독립)에 유지됩니다. Cy5에 표지 콜라겐이 데이터에 사용 하였다. 빨간색 형광 구슬은 원조 시각화 PA 하이드로 겔에 포함되었다. 횡단면 이미지 Zustiak 등을 각색 공 초점 현미경 (스케일 바 = 100 ㎛). 이미지 촬영되었다. 알. (5) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52643/52643fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52643/52643fig4.jpg" /> 24 시간 동안 PA 젤에 시드 MDA-MB-231 세포의 그림 4. 위상 계약 (맨 윗줄)과 형광 (아랫 줄) 이미지. MDA-MB가-231 세포는 부드러운 젤 라운드 유지 (젊은<html> 7;의 0.5 일 인민군 계수)하지만 딱딱한 PA 젤 (100 kPa의 영률)에 연장. 세포는 에탄올에 고정 아 크리 딘 오렌지 염색, 24 시간 동안 젤에 파종 하였다 (AO - 녹색) 세포의 핵을 시각화하는 세포질 및 DAPI (파란색)를 시각화하는; 스케일 바 = 100 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52643/52643fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52643/52643fig5.jpg" /> 그림 5. 셀 확산 영역과 원형은 하부 기판의 강성에 의해 영향을받습니다. 0.5 kPa의 겔 대조적으로 (a) MDA-MB-231 세포의 확산 영역은 대폭. 100 kPa의 증가에 (b)는 원형 세포 PA 겔 강도의 증가와 함께 감소한다. P &lt;0.05; 별표는 유의 한 차이를 지정합니다. 항상 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;ve_content <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52643/52643fig6.jpg" /> 도 6가요 성 플라스틱 지지체 상에 다른 폴리 아크릴 아미드 겔 제제의 도식 표현. 도면은가요 성 플라스틱 지지체 상 PA 겔의 제조에 관련된 다양한 단계들을 나타낸다. 여기에서가요 성 플라스틱 지지체는 초기에 원하는 형상 및 크기의 플라스틱 &quot;커버 슬립&quot;로 미리 절단된다. 이 기술은 부드러운 하이드로 겔 가장 적합합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52643/52643fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 두문자어 </td><td> 아크릴 아미드 % </td><td> 비스 - 아크릴 아미드 % </td><td> 40 % 원액 (ML)에서 아크릴 아마이드 </td><td> 2 % 원액에서 비스 아크릴 아미드 (㎖) </td><td> 물 (㎖) </td><td> G &#39;±의 SD (kPa의) </td><td> SD ± E (kPa의) </td></tr><tr><td> PA1 </td><td> (5) </td><td> 0.025 </td><td> (625) </td><td> 62.5 </td><td> 4312.5 </td><td> 0.62 ± 0.19 </td><td> 1.85 ± 0.57 </td></tr><tr><td> PA2 </td><td> (5) </td><td> 0.1 </td><td> (625) </td><td> (250) </td><td> 4125 </td><td> 3.55 ± 0.12 </td><td> 10.64 ± 0.36 </td></tr><tr><td> PA3 </td><td> 8 </td><td> 0.1 </td><td> 1,000 </td><td> (250) </td><td> 3750 </td><td> 9.71 ± 0.64 </td><td> 29.14 ± 1.93 </td></tr><tr><td> PA4 </td><td> 8 </td><td> 0.25 </td><td> 1,000 </td><td> (625) </td><td> 3375 </td><td> 22.00 ± 2.10 </td><td> 66.01 ± 6.31 </td></tr><tr><td> PA5 </td><td> (12) </td><td> 0.25 </td><td> 1,(500) </td><td> (625) </td><td> 2,875 </td><td> 37.42 ± 2.68 </td><td> 112.25 ± 8.03 </td></tr></tbody></table> 표 여기서 G &#39;및 E로 표시되는 아크릴 아미드 (A) 및 가교제 비스 아크릴 아미드 (B)와 PA 얻어진 겔 강성. 강성 1. 농도, 레올로 측정 하였다. G &#39;는 1 Hz의 주파수에서의 저장 탄성률이다. 영율, E는 수학 식으로부터 산출 하였다. 1. 표준 편차 (SD)는 실험에 따라 측정 3-5 샘플 3 개의 독립적 인 실험을 기반으로 계산 하였다. 테이블의 약어는도 2a에 사용되는 약어에 대응한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> UV 강도 = 15 mW의 / ㎠ </td><td colspan="2"> 노출 시간 = 300 초 </td></tr><tr><td> 시간 (들) </td><td> SD ± E (kPa의) </td><td> 에긴장 (MW / cm 2) </td><td> SD ± E (kPa의) </td></tr><tr><td> (75) </td><td> 0.14 ± 0.03 </td><td> (15) </td><td> 28.05 ± 2.62 </td></tr><tr><td> (100) </td><td> 6.98 ± 2.34 </td><td> (26) </td><td> 21.13 ± 3.01 </td></tr><tr><td> (125) </td><td> 19.11 ± 2.29 </td><td> (37) </td><td> 20.01 ± 2.38 </td></tr><tr><td> (300) </td><td> 28.05 ± 2.62 </td><td> (66) </td><td> 19.35 ± 2.86 </td></tr></tbody></table> 표 2. UV 중합 대안 겔화 조건이 최적화되어 PA 겔 제조를위한 빠른 방법이다; PA3 젤 묘사된다 (1 표 참조). 표는 (두 개의 열 왼쪽) 노출 시간 또는 UV 강도 (오른쪽 두 개의 열) 중 하나가 동일한 솔루션에 대한 다양 결과 탄성 계수를 요약 한 것입니다. 테이블의 결과에 기초하여, 그 300 초의 노출 시간 15 나타나는mW의은 / cm 2 UV 강도는 표 1에보고 된 전통적 중합 겔의 강성에 필적 최고 PA 겔 강성을 준다.

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Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

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JoVE Journal

Bioengineering

19.6K 조회수.  Saint Louis University. Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

비디오: Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

연구

생체공학

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is facilitated by actin-rich protrusions called invadopodia that proteolytically degrade the extracellular matrix (ECM). Invadopodia activity has been shown to be dependent on ECM rigidity and cancer cell contractile forces suggesting that rigidity signals can regulate these subcellular structures through actomyosin contractility. Invasive and contractile properties of cancer cells can be correlated in vitro using invadopodia and traction force assays based on polyacrylamide gels (PAAs) of different rigidities. Invasive and contractile properties of cancer cells can be correlated in vitro using invadopodia and traction force assays based on polyacrylamide gels (PAAs) of different rigidities. While some variations between the two assays exist, the protocol presented here provides a method for creating PAAs that can be used in both assays and are easily adaptable to the user&#8217;s specific biological and technical needs.

Mechanical rigidity in the tumor microenvironment plays a crucial role in driving malignant behavior by increasing invadopodia activity and actomyosin contractility. Using polyacrylamide gels (PAAs), invadopodia and traction force assays can be utilized to study the invasive and contractile properties of cancer cells in response to matrix rigidity.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

의학

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

생물학

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

발생학

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, function, and fate in general. Although increasingly more adherent cell types&#39; responses to matrix stiffness have been characterized, how adherent cells&#39; susceptibility to bacterial infection depends on matrix stiffness is largely unknown, as is the effect of bacterial infection on the biomechanics of host cells. We hypothesize that the susceptibility of host endothelial cells to a bacterial infection depends on the stiffness of the matrix on which these cells reside, and that the infection of the host cells with bacteria will change their biomechanics. To test these two hypotheses, endothelial cells were used as model hosts and Listeria monocytogenes as a model pathogen. By developing a novel multi-well format assay, we show that the effect of matrix stiffness on infection of endothelial cells by L. monocytogenes can be quantitatively assessed through flow cytometry and immunostaining followed by microscopy. In addition, using traction force microscopy, the effect of L. monocytogenes infection on host endothelial cell biomechanics can be studied. The proposed method allows for the analysis of the effect of tissue-relevant mechanics on bacterial infection of adherent cells, which is a critical step towards understanding the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria. This method is also applicable to a wide variety of other types of studies on cell biomechanics and response to substrate stiffness where it is important to be able to perform many replicates in parallel in each experiment.

We have developed a multi-well format polyacrylamide-based assay for probing the effect of extracellular matrix stiffness on bacterial infection of adherent cells. This assay is compatible with flow cytometry, immunostaining, and traction force microscopy, allowing for quantitative measurements of the biomechanical interactions between cells, their extracellular matrix, and pathogenic bacteria.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

면역학 및 감염병학

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Source: Bastounis, E. E. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57361">A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

1. Manufacturing Thin Two-layered Polyacrylamide (PA) Hydrogels on Multi-Well Plates

	Dissolve ammonium persulfate (APS) in distilled ultrapure water to ...