Name: diagonal method to measure synergy among any number of drugs
Uploaded: 2018-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

이 작품은 NIGMS 그랜트 P50GM107618에 의해 투자 되었다. 저자는 Zohar B. 와인 스타인 통찰력 있는 의견 및 원고에 대 한 제안 감사합니다.

참고: 대장균 박테리아의 성장을 억제 하는 어떤 작은 분자는 대각선 방법에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜, levofloxacin (레프), nalidixic 산 (NAL), 및 페니실린 G (PNG) 사용 됩니다 예를 들어, 이러한 약물 표시 현저한 3 방향 시너지 때문. 이 프로토콜의 워크플로 그림 6으로 표시 됩니다. 실 온에서 모든 단계를 실시 합니다. 박테리아와 약물의 신선한 aliquots 매일 사용 합니다. 대장균에 대 한 적절 한 biosafety 수준에서 실험을 수행 합니다.
1. 준비 단계
<ol><li>증류수 1 l 파운드 국물의 25 g을 추가 하 여 Luria Bertani (파운드) 미디어를 준비 하 고 혼합. 15 분 및 실내 온도에 압력가 미디어 저장소를 위한 121 ° C에 고압.</li>
	<li>살 균 50% 글리세롤과 세600 희석 하는 세균성 세포의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 대장균 글리세롤 주식 준비 = 1 파운드 국물 하 고 동결-80 ° c.에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 150 µ L aliquots</li>
	<li>항생제, 레프, NAL, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 각의 1 mL에 PNG의 20 밀리 그램을 디졸브. DMSO의 990 µ L로 레프 솔루션의 10 µ L를 혼합 하 여 레프 솔루션 100 x 0.2 µ g/mL를 희석. 0.2 mg/mL 레프, 그리고 20 mg/mL NAL 및 PNG 진행 단계에서 사용 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브를-20 ° c.에 동결 각 항생제의 aliquot 50 µ L</li>
	<li>받아 한 150 µ L 약 수의 대장균 -80 ° c.에서 해 동.</li>
	<li>14 mL 문화 관에 있는 LB 매체의 5 mL에 대장균 글리세롤 주식의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>밤새 200 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 튜브를 흔들어.</li>
</ol>2. 직렬 희석 복용량 응답 실험
<ol><li>-20 ° C에서 약 레프, NAL, PNG의 한 약 수, 해 동 하 여 이들이 약물의 직렬 희석에 대 한 준비 10 분 동안 실내 온도에 그들을 두고.</li>
	<li>파운드-10%의 LB 미디어의 990 µ L를 혼합 하 여 µ L 1100와 용 매 (DMSO) 110 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>500 µ L 파운드 미디어의 450 µ L를 혼합 하 여 파운드-10% 레프의와 레프의 50 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>5 소용돌이 % 파운드-10 솔 가장 높은 설정에서 s. 96-잘 microplate에 웰 스의 4 행에 파운드-10%의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>5 파운드-10% 레프 소용돌이 가장 높은 설정에서 s. 20 µ L % 파운드-10 레프의 행 A. 첫 번째 잘 추가</li>
	<li>5 번 위아래로 pipetting 두 번째 음을 추가 하는 첫 번째 우물에서 20 µ L를 취하여 파운드-10% 레프에 대 한 두 배 직렬 희석을 준비 합니다. 반복이 모든 우물에 대 한 순차적으로 40 µ L (그림 7A), 11까지.</li>
	<li>제거 하 고는 micropipette를 사용 하 여 잘, 20 µ L 11에서 콘텐츠를 삭제 합니다.</li>
	<li>NAL 및 PNG 각각 microplate의 두 번째 및 세 번째 행을 사용 하 여 약 2.3-2.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>내부 긍정적인 컨트롤로 단계 2.3-2.7 마약 레프 네 번째 행에 다시 반복 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 1시 10분의 OD600 문화 (단계 1.5-1.7)의 희석.</li>
	<li>셀 0.01의 OD600 파운드 미디어의 5 mL에 희석. 저수지로 부 어.</li>
	<li>멀티 채널 micropipette를 사용 하 여 마약 직렬 희석 단계 2.4 2.9에서에서 준비 희석된 셀의 80 µ L를 추가 합니다. 각 잘에 최종 약물 농도 그림 7A에 표시 됩니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인.</li>
	<li>16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	<li>(반복 단계 1.5-1.7) 3 단계에서 사용 하는 새로운 세균성 문화를 시작 합니다.</li>
</ol>3. 선형 희석 복용량 응답 실험
<ol><li>(그림 7A 오른쪽) 플레이트 리더를 사용 하 여 2 단계에서 직렬 희석 복용량 응답 접시 세600 흡 광도 측정 하 고 다음 단계에 따라 결과 해석.</li>
	<li>각 행에 대해 아무 약물 제어의 성장과 함께 각 잘에서 성장 나누어 성장 정상화 그리고 OD600아무 약물 상태를 정상화 하 여 백분율 성장 계산할.</li>
	<li>각 약물에 대 한 50% 성장 억제 (IC50), 그림 7A 오른쪽에 주황색 표시는 우물을 찾습니다. 각 약물에 대 한 "직렬 IC50"로이 스 농도 지정 합니다.</li>
	<li>신선한 약물 aliquots을 녹여, 파운드-10%의 1 mL 파운드 미디어 및 약물의 농도 LB 미디어를 추가 하기 전에 각 약물의 직렬 IC50의 100 x 9:1 비율에서 약물을 혼합 하 여 파운드 미디어와 용 매 (DMSO)는 9:1 비율에 파운드-10% 약물을 혼합 하 여 준비 단계 3.3에서 선택한.</li>
	<li>파운드-10% 약물 및 그림 7B에 표시 된 볼륨에 % 파운드-10 솔을 혼합 하 여 약물 레프, NAL PNG 11 농도에 선형적으로 증가 복용량을 준비 합니다.</li>
	<li>내부 긍정적인 컨트롤로 레프의 네 번째 행에 선형으로 증가 복용량을 준비 합니다.</li>
	<li>1시 10분의 OD600 측정 문화권의 희석 단계 2.14에서에서 시작.</li>
	<li>셀 0.01의 OD600 파운드 미디어의 5 mL에 희석. 저수지로 부 어.</li>
	<li>마약 선형 희석 단계 사용 하 여 멀티 채널 micropipette 3.6에서에서 준비에 희석된 세포의 80 µ L를 추가 합니다. 각 잘에 최종 약물 농도 그림 7B에 표시 됩니다. 참고: 복용량 응답에서 중간이이 약에 대 한 직렬 IC50 받게 됩니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인.</li>
	<li>16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	<li>(반복 단계 1.5-1.7) 4 단계에서 사용 하 여 2 개의 신선한 세균성 문화를 시작 합니다.</li>
</ol>4. 대각선 약물 상호 작용 실험
<ol><li>단계 3 (그림 7B)에서 선형 희석 복용량 응답의 OD600 흡 광도 측정 합니다.</li>
	<li>각 약물에 대 한 IC50 귀착되 고 준비 농도 100 x IC50 농도에서 마약 레프, NAL 및 PNG를 선택 합니다.</li>
	<li>신선한 약물을 녹여, 100 준비 각 x IC50 마약 및 레프 + NAL, 레프 + PNG 및 NAL + PNG 및 1의 볼륨에 의해 약 1:1 혼합물을 준비: 레프 + NAL + PNG의 볼륨 1:1 약물 혼합.</li>
	<li>그림 8에서 같이 약물 상호 작용 실험에 대 한 두 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>1시 10분의 OD600 측정 문화의 희석 단계 3.11에서에서 시작.</li>
	<li>준비 세600 파운드 미디어의 두 10 mL에 2 개의 문화의 0.01 희석 =.</li>
	<li>문화 1과 판 1, 2, 2에서에서 셀의 80 µ L를 각각 추가 합니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인. 16 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
</ol>5. 대각선 약물 상호 작용 점수
<ol><li>대각선 약물 상호 작용에 대 한 OD600 흡 광도 측정 실험 접시 4 단계에서.</li>
	<li>각 행에 대해 잘 아니 약 제어에 성장에 각 잘 성장 나누어 성장 정상화.</li>
	<li>각 행에 대 한 성장 저해 IC50, 오른쪽 오렌지 그림 8에서에 표시 된 가장 가까운 있는 열을 찾습니다. IC50 약이 잘에서의 상대 농도에 따라 할당 합니다.</li>
	<li>레프 + NAL, 레프 + PNG 및 NAL + PNG 및 레프 + NAL + PNG 복용량 응답, 각 조합에 단일 약물의 IC50 평균 예상된 IC50 계산 합니다. 평균는 정확한 예상된 IC50 계산에 대 한 간단한 근사12전에 설명한 대로 note.</li>
	<li>각 조합에서 예상된 IC50에 의해 관찰된 IC50 나누어 소수 금지 농도 (FIC) 점수를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

병원 체 또는 종양에 대 한 약물 조합의 사용은 건조 항생제 파이프라인의 상황 특히 매력적인 전망 이다. 그러나,이 잠재력은 적어도 2 개의 어려움에 의해 방해 된다. 첫 번째 어려움이 가능한 조합의 천문학적입니다. 있다, 예를 들어 100 항생제 중 4950 가능한 없음을 조합. 100 항생제 사이 모든 가능한 조합 (2100) 지구에 박테리아의 수와 동일한 크기 순서에는 (10 ~30). 이러한 가능성 중 강하게 시너지 조합을 예측 하는 방법 수많은 전산 연구의 대상이 되었습니다. 두 번째 어려움은 상위 약물 상호 작용의 측정. 고려 전산 플랫폼 특정 10-약물 조합을 특정 병원 체에 대 한 강력한 시너지는 제안할 수 있습니다. 약물 상호 작용을 테스트 하는 전통적인 방법을 확인 하거나이 가설을 반박 하려면 너무 비용이 많이 드는, 따라서 많은 약물 시너지 효과의 연구 과학적 탐구의 경계에 밖으로 왔다. 거의 30 년 전 처음 제안 하 고 몇 가지 최근 시너지 화면에 사용 된 대각선 방법 많은 쌍 사이 상호 작용의 테스트 함으로써 첫 번째 문제에 대 한 강력한 기반을 제공 합니다. 그것은 전통적인 분석 실험의 유익한 샘플링에 의해 두 번째 문제를 해결 하 고 상위 약물 상호 작용의 연구를 수 있습니다.
우리는 중요 한 것은 주의 우리의 프로토콜 사용 하 여 선형 주입 약물 상호 작용 측정을 위해도 약한 상호 작용 검출을 위한 감도 제공. 선형 먹이 지 오른쪽 농도 범위를 설정 하는 것은 도전 작업입니다. 첫 번째 수행 직렬 희석, 하 여 우리 선형 먹이 지에 대 한 검색 공간에 대 한 정보통된 결정을 확인 합니다. 그러나, 2-fold 사용 하는 프로토콜을 수정할 수 또는 높은 직렬 희석에 대 한 약물 상호 작용 테스트. 이러한 수정 실험 시간 단축을 허용 더 많은 상호 작용;의 테스트 그러나, 그것은 강하게 상승 또는 대립만 상호 작용을 검출 하는 감도 할 것입니다.
우리가 설명 하는 프로토콜 없음을 또는 3 방향 상호 작용의 측정을 보여줍니다. 프로토콜의 중요 한 측면은 단일 에이전트 플레이트 변이 때문에 바이어스를 최소화 하기 위해 조합으로 같은 접시에는. 따라서, 사소한 수정에 의해 7-방향 조합까지 상호 작용을 측정 하는 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 7 개 이상의 약물의 조합 되며 하나 이상의 96-잘 미 판과 추가 고려 사항 간 plate 복제 등 올바른 데이터 통합을 보장 하기 위해 이동 해야 합니다.
대각선 방법의 주목할 만한 한계 분석 결과에서 각 약 관심의 표현 형을 억제 해야 하는 제한입니다. 따라서, 대각선 방법은 활성 에이전트 불활성 adjuvants 간의 상호 작용을 이해 하는 데 유용 하다. 이러한 'potentiating' 상호 작용 행복 또는 높은 단일 에이전트 모델 대체 모델에서 공부 될 수 있습니다.
상위 약물 상호 작용의 분석을 위한 중요 한 고려 사항은 이다 "예상 IC50."에 대 한 null 모델 선택 두 약물 결합, 결합의 효과 단일 약물 효과에 비교할 수 있습니다. 3 약물 결합 될 때 하나의 효과 또는 없음을 효과에 결합의 효과 비교할 수 있습니다. 예를 들어 3 개의 약의 모든 인덱스도 조합 시너지 인 경우 다음 그것은 예상 수 있습니다 수이 약 3 방향 시너지를 보여줄 것 이다. 없음을 상호 작용에서 예상 되는 무슨에서 3 방향 상호 작용의 편차는 최근 별명 "긴급 상호 작용"16,17. 편의상 3 가지 방식의 조합 "net 상호 작용의," null 모델을 정의 하는 단일 약물 효과로 측정을 우리의 프로토콜에 설명 합니다. 그러나, 프로토콜에서 얻은 데이터도 3 방향 조합의 긴급 상호 작용을 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리의 분석에 3 방향 조합의 예상된 IC50 단일 약 IC50s의 평균으로 정의. 또는 예상된 IC50 없음을 조합 (~1.1-1.2)의 IC50s의 평균으로 정의할 수 있습니다. 관찰된 IC50이 대체 예상된 IC50 나눈, 획득된 FIC는 앞에서 설명한12로 3 가지 방식의 조합에 대 한 긴급 FIC을 제공 합니다. 이 레프 + NAL + PNG는 세 가지 약물 중 없음을 상호 작용에서 예상 되는 것 보다 더 시너지 레프 + NAL + PNG 응급 시너지 효과 보여주는 계시 한다.

약물 조합을 의외로 높은 또는 낮은 효과 시너지 또는 대립 약물 상호 작용, 각각,12,3에 해당 하는 구성 약물의 효과 주어 표현 형에 전시 수 있습니다. 시너지 조합 사용 효능 증가 복용량 단계적 확대 및 부작용 완화를 위해 복용량 감소 수 있습니다. 조합 치료 또한 세포질 기계, 저항4잠재적인 진화 탈출 메커니즘을 차단 함으로써 여러 난관을 적용할 수 있습니다. 따라서, 3 개 이상의 약물의 조합은 정기적으로 병원 체 또는 암 치료5에 사용 됩니다.
시너지와 적개심 개별 약물 효과 주어 예상된 효과 대 한 조합의 관찰된 효과 비교에 의해 정의 됩니다. 약물 상호 작용에 대 한 모델 중에서 베 가산 가장 엄격 하 고 잘 정의 된 null 모델 (그림 1)6, 그리고 유추 시너지/적개심 상호 작용은 사용 하는 약물 농도의 독립 6 , 그러나 7.,로 베 모델은 실험적으로 없음을 상호 작용 시험에 대 한 비용이 많이 드는. 약물 상호 작용 분석 실험은 전통적으로 약물 농도 조합 (바둑판 분석 결과)의 2D 매트릭스의 구성 (그림 2). 5 복용량이 각 약품 사용 경우 25 조합 필요, 하나에 해당 하는 미 판 실험 복제에서 실시 하는 경우의 절반. 이 방법의 비용 베 가산 모델 다중 약물 조합 (그림 3)에 대 한 시너지 효과 측정을 금지합니다. 예를 들어 10 방법 상호 작용을 테스트 하려면 전통적인 방법 필요 이상의 100 천 microplates, 엄격 하 고, 잘 theorized 고 농도 독립적인 베 가산 모델에서 상위 시너지 효과의 실험 측정을 금지 8.
현재 임상 치료 가능한 약물 조합 중 일부만을 사용합니다. 예를 들어 결핵의 표준 치료 3 항생제의 조합 이다. 결핵균 (Mtb) 치료에 사용 되는 약 20 항생제가 있다. Mtb에 대 한 강한 시너지를 잠재력 각 20 마약 중 1140 가능한 3 방향 조합 있다. 많은 약물 중 약물 상호 작용을 측정 하기 위해 비용 효율적인 방법 되었습니다, 잠재적으로 생명을 구하는 시너지 조합 안 된 남아 있습니다.
여기, 우리만 바둑판 분석 결과 (그림 4 의 대각선을 샘플링 하 여 쌍이 들어와 3 방향 약 상호 작용을 측정 하는 간단한 프로토콜을 설명 하 고 그림 5). 바둑판 실험의 대각선 샘플링의 기본 개념은 Berenbaum 19789에 있는 그의 정액 일에서에 이론 됩니다. 그러나,이 방법은 최근에 마약 시너지 화면10,,1112에 적용 되었습니다. 선물이 우리의 프로토콜 대장균 (E. 콜라가)와 성장 표현 형. 그러나, 우리는 프로토콜 생물학 종 및 관심의 표현 형의 독립적 이며 따라서 다른 생물학 문맥에서 상위 약 시너지 효과의 측정에 적용할 수 있습니다 주의.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Semi Micro Cuvette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL &amp;nbsp;Eppendorf&amp;nbsp;Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24830</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Breathable Cell Culture Tube</td><td>VWR</td><td>60819-761</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24804</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24815</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-262-PA</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Shaker Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Cell Culture Serological Pipette</td><td>VWR</td><td>53300-421</td><td></td></tr><tr><td>96-well Microplates</td><td>VWR</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Breathable Sealing Film</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0010</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41647</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>700926</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Powder</td><td>RPI</td><td>L24065</td><td></td></tr><tr><td>Levofloxacin</td><td>Sigma</td><td>28266</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>PIPETMAN Classic</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel micropipette</td><td>VistaLab</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid</td><td>Sigma</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pump</td><td>Drummond&amp;nbsp;</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>VWR</td><td>89094-658</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>BIO-RAD</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-320-807</td><td></td></tr></tbody></table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

시너지 약물 조합 개별 약물의 효과에 비해 더 높은 효능이 있다. 바둑판 분석 실험, 어디 약물 많은 복용량 결합 되어, 약물 상호 작용의 중요 한 측정을 허용 합니다. 그러나,이 분석 실험은 비용이 많이 드는 고 많은 약물 간의 상호 작용을 측정 하기 위한 잘 확장 되지 않습니다. 몇몇 최근 연구는 약물 상호 작용 측정의 전통적인 바둑판 분석 결과 대각선 샘플링을 사용 하 여 보고 있다. 이 대체 방법은 크게 약물 상호 작용 실험의 비용을 감소 하며 많은 약물과 조합에 대 한 상호 작용을 측정 여기, 3 없음을 상호 작용 및 5 일에서 중복, 3 항생제 중 한 3 방향 상호 작용을 측정 하는 프로토콜 3 96-잘 microplates 및 표준 실험실 장비를 사용 하 여 설명 합니다. 선물이 Levofloxacin + Nalidixic 산 + 페니실린 G 3-항생제 결합은 시너지를 보여주는 대표적인 결과. 우리의 프로토콜 많은 약물 및 다른 생물 학적 상황에서 병원 체와 종양에 대 한 다중 약물 시너지 효과 대 한 효율적인 화면에 대 한 허용 하는 상호 작용을 측정 하기 위해 확장 됩니다.

이전에 우리 3 약물 간의 없음을 상호 작용 보고: 레프, NAL와 PNG 두 약물 4 x 4 매트릭스13,14에서 결합 했다 소형된 바둑판 분석 실험에서 테스트에 따라. NAL 레프 상승 했다, 그러나 PNG 레프와 NAL13,14와 대립 될 알려졌다. 여기, 우리 확인이 없음을 상호 작용 대각선 분석 결과 사용 하 여 이러한 세 가지 약물 중에서 3 가지 방식의 상호 작용을 측정 하 고. 우리의 결과 레프 + NAL + PNG 시너지 3 방향 항생제 조합 임을 보여 줍니다. 그림 7 의 오른쪽에 주어진 개별 실험 절차 섹션의 결과 대 한 도식 적인 표현 및 그림 8. 여기, 선물이 고 그림 9에 3 개의 판 읽기에서 대표적인 원시 결과 해석. 상단 플레이트 읽기 직렬 및 선형 희석 실험 단계 2와 3 단계에서 실시에 해당 합니다. 아래 2 개의 격판덮개 독서는 중복 상호 작용 접시 4 단계에서 실시.
그림 9 에서 원시 데이터 표시 최고 성장 0.55, 주위 하지만 미디어 자체의 0.05 광학 밀도 높은 약물 농도의 OD600 에서 관찰 어디에 성장이. 따라서, 우리 정의로 IC50 (0.55-0.05)/2 = 0.25. 각 복용량 응답에 대 한이 값을 가장 가까운 있는 웰 스 오렌지와 함께 표시 됩니다.
그림 9A 의 상반신 직렬 복용량 응답 실험 2 단계에서 결과 보여 줍니다. 레프에 대 한 IC50 웰 스 4 ng/mL에 해당 하는 열 10에서 2 복제입니다. NAL 및 PNG에 대 한 IC50 3 µ g/mL와 25 µ g/mL, 각각 있다. 이러한 농도 그림 7B에 표시 된 1 x 농도에 해당 합니다. 그림 9B 의 아래쪽에서 선형 복용량 응답 실험 3 단계 결과 보여줍니다. 레프, NAL, PNG의 IC50 x, 0.8 x 0.4 그리고 1.2에서 찾을 수 있습니다 x, 각각. 이 농도 4 단계에 대 한 1 X IC50으로 할당 됩니다.
해당 실험은 그림 9B, 어디는 IC50 우물에 표시 된 두 개의 복제 하는 두 접시는 오렌지와 함께 표시 됩니다. 1 접시, 모든 단일 약물 그들의 IC50 1 배 농도에서 있다. 인덱스도 또는 3 가지 방식의 조합에 대 한 예상된 IC50 모든 조합 또한 1 배 농도 대 한 예상된 IC50 만들기 구성 약물의 산술 평균으로 계산 됩니다. 2 접시, 레프 및 PNG 그들의 IC50 1 배 농도에서 하지만 NAL IC50 1.2 x. 각 조합에 대 한 예상된 IC50이 IC50 값의 산술 수단을 사용 하 여 정의 됩니다. 예를 들어 레프 + NAL NAL + PNG에 대 한 예상된 IC50는 1.1 x. 약물 상호 작용 점수 (FIC)를 위한 각 조합 플레이트의 오른쪽에 표시 된 예상된 IC50와 IC50 관찰 나누어 계산 됩니다. 두 접시의 FIC 점수 검사 레프 + NAL 및 레프 + NAL + PNG는 시너지, 레프 + PNG와 NAL + PNG는 대립 하는 방법을 보여 줍니다. FIC 점수 두 접시에는 동의 프로토콜의 신뢰성을 지 원하는입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> 그림 1: 모델 정의 베 가산 약물 상호 작용 모델에 대 한 Null. 2 5 x 5 매트릭스는 microplate에 마약 A에서와 같이 한 축에 증가 선형, 고 정량 phenotype (오른쪽 상단)을 억제 하는 약물의 최고 농도. 이 행렬의 중간, 어디 equipotent 마약을 연결 하는 선 각 단일 약물의 농도 약 대답으로 동일한 농도에 표시 됩니다. 셀이 "체커 판" 약물 농도 조합에 추가 되,이 라인에 표현 하는 기록된 형 웰 스 연결에 대 한 동등한 것으로 예상 된다. 이 자기-자기 약물 상호 작용 실험에서 표현 형 (녹색 점선으로 표시)을 묘사 하는 isobole 선형, 가산 null 모델 정의 될 예정입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> 그림 2: 없음을 약물 상호 작용 베 가산 약물 상호 작용 모델. 두 약물은 그림 1과 같이 바둑판 분석 결과에 결합 되, 관찰 된 isophenotypic 컨투어 직선, 볼록 또는 오목 수 있습니다. 오른쪽, 가능한 isophenotypic 등고선 (녹색 파선) 바둑판 분석 실험에 겹쳐 있다. 직선 isophenotypic 컨투어가 있는 약물 조합은로 베-첨가제, 윤곽은 베 첨가물 이다 자기 자기 약물 상호 작용에서 다른 정의 의해. 때 isophenotypic 컨투어 크게 오목 또는 볼록, 결합 시너지 또는 대립, 각각 이다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> 그림 3: 3 방향 약물 상호 작용 베 가산 약물 상호 작용 모델. 없음을 상호 작용에 대 한 바둑판 분석 결과 마찬가지로, 3 약물 각 약품 한 축에 증가 선형 3D 그리드 (는 "checkercube")에서 결합 됩니다. 3 마약 동일 했다, isophenotypic 표면 편평한, 3 약물 조합에 대 한 가산 정의 될 예정입니다. 표면 더 오목 또는 볼록이 베 추가 null 모델 보다는, 약물 조합 있다면 시너지 또는 대립, 각각. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> 그림 4: 없음을 약물 상호 작용을 측정 하기 위해 대각선 방법. 각 바둑판 분석 결과, 자홍색 사각형에 표시 된 지역에만 측정 됩니다. i 및 ii는 선형 단일 약물 농도 증가 하 고. iii는 두 약물의 1:1 혼합물을 만들고 마치 그것이 하나의 약물이이 혼합물을 선형 titrating에 의해 평가 됩니다. FIC는은 관찰된 IC50 나눈 두 단일 약물의 예상된 IC50 조합입니다. 로 베 가산 모델에 대 한 예상된 IC50 두 단일 약물의 평균 IC50에 의해 직선 근사 줄. FIC 값 베 추가 쌍 1 이며 시너지 또는 대립 쌍, 각각2,12대 1 보다 낮은 이상. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> 그림 5: 3 방향 약 상호 작용을 측정 하기 위해 대각선 방법. 각 checkercube 분석 결과 표시 영역 으로만 측정 됩니다. i, ii 및 iii는 선형 단일 약물 농도 증가 하 고. iv 1 함으로써 측정: 1:1 혼합물의 3 약물과 단일 약물 마치 선형이 혼합물을 titrating. 소수 억제 농도 예상된 IC50 주어진 3 개의 단일 약물으로 나눈 조합에서 관찰된 IC50 과 같습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> 그림 6: 여기에 설명 된 대각선 방법 프로토콜 및 각 microplate에 대 한 설치 정보에 대 한 워크플로. 하루 4 접시는 중복에 실시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> 그림 7: 직렬 및 선형 희석 복용량 응답 실험. 한 약물 및 해당 최종 약물 농도 대 한 직렬 희석 복용량 응답 (A) 준비 합니다. 대장균 세포 격판덮개;에 추가 됩니다. 다음 날에 사용의 선형 16 h. 직렬 IC50, 주황색으로 표시 된 각 약물에 대 한 선택 후 성장 기록 희석 복용량 응답 실험. (B) 한 약물 및 해당 최종 약물 농도 희석 선형 복용량 응답의 준비. 대장균 세포 격판덮개;에 추가 됩니다. 성장 후 16 h 기록 됩니다. 각 약물에 대 한 다음 날에 사용 될 것입니다 선택한 IC50s 마약 상호 작용 실험 오렌지에 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> 그림 8: 약물 상호 작용 실험. 상호 작용 실험의 준비는 단일 유사 약물 선형 복용량 응답를 제외 하 고 1:1 또는 1:2 사용 되는 약물의 1:1 혼합물 또는 3 약물 복용량 응답, 각각. IC50s 오렌지에 묘사 된 하 각 복용량 응답, 관찰 FIC 점수를 계산 하는 데 사용 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> 그림 9: 대표 실험 결과. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 결과 주요 텍스트에서 제공 하는 세부 정보와 함께 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

이 프로토콜에서 우리가 어떻게 베 가산 기반 약물 상호 작용 측정 쌍 및 3 방향 약물 조합을 설명 합니다.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

diagonal-method-to-measure-synergy-among-any-number-of-drugs

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K 조회수.  Sabanci University. 이 프로토콜에서 우리가 어떻게 베 가산 기반 약물 상호 작용 측정 쌍 및 3 방향 약물 조합을 설명 합니다.

비디오: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

연구

유전학

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

암 연구학

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

생물학

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

면역학 및 감염병학

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund Sweden
Knowledge of the interactions between antibiotics and bacteria is important in understanding how microbes evolve antibiotic resistance. In 1928, Alexander Fleming discovered penicillin, an antibiotic that exerts its antibacterial function by interfering with cell wall regeneration (1). Other antibiotics with diverse mechanisms of action have subsequently been discovered, including drugs that inhibit DNA replication and protein translation in bacteria; however, no new antibiotics have been developed in recent years. Resistance to current antibiotics has been increasing, resulting in severe infectious diseases that cannot be effectively treated (2). Here, we describe several methods to assess antibiotic resistance in bacterial populations. Each of these methods works, regardless of the mechanism of action of the antibiotics used, because bacterial death is the measured outcome. Antibiotic resistance is not only rapidly disseminated specifically through hospital settings, but also throughout society. In order to investigate such means of resistance, different methods have been developed including the Epsilometer test (E-test) and the broth dilution test (3).
The E-test is a well-established method and is a cost-effective tool that quantifies Minimal Inhibitory Concentration (MIC) data, the lowest concentration of an antimicrobial that inhibits visible growth of a microorganism. Depending on the bacterial strain and antibiotics used, the MIC value can vary between sub &#956;g/mL to &#62;1000 &#956;g/mL (4). The E-test is performed using a plastic strip containing a predefined antibiotic gradient, which is imprinted with the MIC reading scale in &#956;g/mL. This strip is directly transferred on the agar matrix when applied to the inoculated agar plate. After incubation, a symmetrical elliptic inhibition zone is visible along the strip as bacterial growth is prevented. MIC is defined by the area of inhibition, which is the endpoint where the ellipse intersects the strip. Another common method to determine MIC is the microbroth dilution method. Microbroth dilution incorporates different concentrations of the antimicrobial agent added to a broth medium containing inoculated bacteria. After incubation, MIC is defined as the lowest concentration of antibiotic that prevents visible growth (5). It is also a quantitative method and can be applied to several bacteria. Disadvantages of this method include the possibility of errors when preparing the concentrations of the reagents and the large number of reagents required for the experiment. Measuring antibiotic resistance is imperative from both a clinical and research perspective, and these in vitro methods of investigating resistance are discussed and showcased below.
The profile of resistance for a specific bacterium can be applied in order to optimize antibiotic treatment to determine whether a patient would benefit from combination treatment versus single therapy. For the usage of more than one antibiotic at a single time, it is imperative to know their interactions with each other and if they have an additive, synergistic, or antagonistic effect. An additive effect can be seen when the joint effect of the antibiotics equals the potency of the individual antibiotics given at an equal dose. Synergy between antibiotics, on the other hand, is present when the joint effect of the antibiotics is more potent than if the drug would be given alone (6). Applying combinations of antimicrobial treatment is used to avoid the occurrence of antimicrobial resistance thus to enhance the effect of the individual antibiotic treatment (7). Knowledge of antagonism is also as important to prevent unnecessary use of antimicrobial combinations. E-test methodology offers simple and several ways to determine possible synergy and antagonism between different antimicrobial agents. In order to face the proliferation of antibiotic resistant pathogens, knowledge of possible synergistic and antagonistic mechanisms of certain antibiotics is important resulting in clinical efficacy and battling multidrug-resistance.
Determination of synergy using E-tests can be divided into two broad approaches: cross and non-cross testing. While both synergy tests rely on the previous knowledge of individual MIC values, the two approaches are slightly different in methodology and conceptual approach. In a non-cross synergy test, the first antibiotic in the pair to be tested is placed on an agar plate inoculated with bacteria. After allowing the antibiotics from the first strip infuse the plate (e.g. after 1 hour), the strip is removed and a new strip containing the second antibiotic is placed on the exact same spot as the first, making sure to place the two individual MIC values on top of each other. The resulting inhibition zone can then be analyzed as described above, and synergy calculated based on the Equation 1.
Equation 1 - Fractional Inhibitory Concentrations (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg" />
Values &#62;0.5 demonstrates synergy.
While rewarding the examiner with easy-to-analyze plates, the method is somewhat laborious and time-consuming due to the change of strips, as well as the need of using two plates per experiment. Instead, a cross test is often employed. Instead of adding the two different E-test strips subsequently on top of each other (after removal of the first), both are placed simultaneously but in the form of a cross (<img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg" /> 90&#176; angle), with the two previously determined MIC values forming the 90&#176; angle. By this approach only one plate is needed per synergy test, as well as less work, making it a preferred choice despite being slightly more difficult to analyze. The new MIC values in the combined antibiotics approach can be visualized as the modified inhibition zones, after which synergy can be determined by Equation 1.
Instead of using an agar plate approach, a microbroth approach can often be preferential due to its higher flexibility (e.g. ability to choose specific concentrations of antibiotics outside the limits of an E-test strip). Further, microbroth tests are suggested to be more sensitive due to their even distribution of antibiotics in a liquid solution, not depending on the dissociation within a solid phase (agar plate). Wells in a 96-well microplate will be inoculated with a set number of bacteria (106 cfu/mL: bacterial concentration can be estimated by OD600 nm measurements, turbidity standards, or by spread plating samples from 10x bacterial serial dilutions), and antibiotics in different dilutions will be added to the wells. Similarly, to the E-test strips MIC is determined as the intersection (well/spot) with the lowest concentration of antibiotics inhibiting visible growth of bacteria.
Experimental Aim
<ul>
	<li>The project below describes strategies to determine MIC-values of penicillin G and gentamicin of Streptococcus group G by two different methods, E-test and microbroth dilution. For E-test, Mueller-Hinton agar plates inoculated with Streptococcus group G were used in combination with gradient strips of penicillin G and/or gentamicin; while MH-broth with 50% lysed horse blood and 20 mg/mL &#946;-NAD were used with soluble antibiotics together with Streptococcus group G in a microbroth approach.</li>
</ul>
Materials
<ul>
	<li>Bacterial colonies on a blood agar plate, stored &#60;7 days in 4&#176;C</li>
	<li>Blood agar plates</li>
	<li>0.5 McFarland standard
	<ul>
		<li>1% BaCl2</li>
		<li>1% H2SO4</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Saline tube (2 mL)</li>
	<li>Cotton tipped applicator</li>
	<li>Mueller-Hinton agar plates (MHA plates)</li>
	<li>MH broth with 50% lysed horse blood and 20 mg/mL &#946;-NAD (MH-F)</li>
	<li>E-test penicillin/gentamicin (or antibiotics of interest) (BioMerieux, Marcy l&#39;Etoile, France, Sweden)</li>
	<li>Antibiotics penicillin/gentamicin (or antibiotics of interest (powder/solution))</li>
</ul>
Note: The specific media used for bacterial growth may vary for different species.

Antibiotic Susceptibility Testing, MIC and Antibiotic Synergy

항생 물질 감수성 시험: 두 항생제의 MIC 값을 결정하고 항생 시너지를 평가하기 위한 Epsilometer 검사

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

미생물학

Agonism and Antagonism: Quantification

When drugs are administered, they can elicit either an agonist or antagonist effect on the body. Agonism occurs when a drug activates a specific receptor, triggering a biological response. On the other hand, antagonism happens when a drug binds to the same receptors but blocks their activation, thereby preventing a biological response.
To quantify these effects, researchers use a dose-response curve, which provides valuable information about the potency and efficacy of a drug. Potency refers to the amount of drug required to produce a particular response, while efficacy measures the maximum therapeutic effect achievable with the drug.
In addition to agonism and antagonism, drug interactions play a significant role in determining the overall effect. Drug interactions can be additive or synergistic. Additive effects occur when the combined effect of two drugs equals the sum of their individual effects. For example, if one drug lowers blood pressure by ten units and another drug lowers it by fifteen units, their combined effect would be a reduction of twenty-five units in blood pressure.
Synergism, on the other hand, happens when the combined effect of two drugs exceeds the sum of their individual effects. This is commonly observed in the treatment of heart disease, where the combined effect of aspirin and clopidogrel on preventing blood clots surpasses what either drug could achieve alone.
To visually represent these interactions, researchers often use isobolograms. Isobolograms provide a graphical representation of the quantitative relationship between two drugs and their combined effect. This visual tool enables researchers to analyze and understand the nature of drug interactions more effectively.
Understanding the dynamics of drug effects and interactions is crucial in developing safe and effective treatments. Researchers can optimize drug therapy regimens, minimize adverse effects, and maximize therapeutic outcomes by comprehending the mechanisms of agonism, antagonism, and synergism.

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

오버랩² 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

항생 물질 감수성 시험: 두 항생제의 MIC 값을 결정하고 항생 시너지를 평가하기 위한 Epsilometer 검사

작용제와 길항제: 양화

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

항생 물질 감수성 시험: 두 항생제의 MIC 값을 결정하고 항생 시너지를 평가하기 위한 Epsilometer 검사

작용제와 길항제: 양화

오버랩² 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이