이 논문에보고 된 연구 내용은 전적으로 저자의 책임이며 JEK하는 보너스 번호 R01AI099122에서 알레르기 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 감염증의 국립 연구소에 의해 지원되었다 반드시 국립 연구소의의 공식 견해를 대변하지 않습니다 건강. 우리는 ICCB - 롱 우드의 검사 시설 및 / 또는 국가 검사 실험실을위한에서 제니퍼 스미스, 데이비드 Wrobel, 스와 치앙마이, 더그 홍수, 숀 존스턴, 제니퍼 Nale, 스튜어트 Rudnicki, 폴 연의, 리처드 시우, 레이첼 소장에게 감사의 말씀을 우수의 뉴 잉글랜드 지역 센터 디펜스의 개발과 높은 처리량 심사 분석의 성능을 자신의 도움 (U54AI057159에서 지원) 감염증을 신흥. 우리는 또한 원고에 도움이 의견 케네스 P. 스미스에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 실시간 세포 내 성장과 진핵 세포 세포 독성 분석 <ol><li> 제조 된 숙주 세포 (J774A.1 세포) <ol><li> 9 %의 철 보충 혈청과 RPMI 1640에서 서스펜션 문화 J774A.1 뮤스의 musculus 대 식세포 유사 세포. 조직 배양 플라스크에 처음 통로. 세포 배지 15 ㎖에 75 ㎠로 조직 배양 플라스크에서 컨 플루 언트하게 한 후 15 ㎖의 조직 배양 플라스크로 복귀 50 ml를 전달하는 매체의 동일한 유형, 65 ml의 긁어 희석하여 분할 250 ml의 세균 진탕 플라스크에. </li><li> 250 mL 및 / 또는 조직 배양 배지와 오분의 볼륨에 가득 1,000 ml의 세균 플라스크에 현탁액 스케일 업, 문화. 분당 약 120 회전 수로 회전 수를 설정하여 통기. 일관성있는 성장을 위해, 정확히 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 그들은 범위 농도 도달 수확 세포 2.5 × 106 세포/ 5 × 106 세포 / ml의. 죽은 세포 독성 분석에서 배경 노이즈가 증가하는 바와 같이, 25 %를 초과하지 않는 (쉽게 트리 판 블루 염색에 의해 분석) 죽은 세포의 비율을 확인. </li><li> 흰색 접시, 조직 384 웰 마이크로 플레이트 30 μl를 조직 배양 배지에서 5 × 10 4 J774A.1 세포에서 당은 물론, 문화 처리. 실험의 날에 90 %의 합류를 달성하기 위해 마이크로 밤새 품어. </li></ol></li><li> 준비 발광 또는 형광 레지오넬라 뉴모 필라 <ol><li> 통로 L.의 뉴모 필라 (Lp02 :: flaA :: 럭스 8) 해당 매체에 박테리아, 즉, 버퍼 숯불 효모 추출물 (BCYE) 매체. 티미 딘 영양 요 구성 균주를 사용하는 경우, 100 μg의 / ㎖ 티미 딘와 매체를 보완. 합류를 얻기 위해 새로운 BCYE 판에 두껍게 생물을 확산하고 (냉동 재고에서 경우) (이전 판 통로에서 경우) 하루 배양 또는 2 ~ 3 일에 의해 실험 세균의 패치를 준비성장. <ol><li> 10g 효모 추출물 10 g의 N 용해 BCYE 플레이트를 준비 - HPO 4 (2- 아세트 아미도) -2- 아미노 에탄 술폰산 0.35 g의 K (2) 및 탈 이온수 950 ml를 1 g 일 염기성 칼륨 α - 케 토글 루타 레이트. 수산화 칼륨 (11.9 몰 용액 ≥2.5 ㎖)으로 pH 6.9로 조정한다. </li><li> 15g의 한천 2g 활성탄을 추가; 1 L 최종 부피에 가져다. 자기 교반 막대 및 오토 클레이브를 추가합니다. 55 ° C로 냉각 매체 및 탈 이온수에 용해 된 0.4 g의 L 시스테인 및 0.42 g의 암모늄 철 (III) 시트 레이트를 포함하는 추가 필터 살균 솔루션을 제공합니다. 페트리 접시를 주입하기 전에 혼합 자석 교반 판을 사용합니다. </li><li> 무균 성장 매체에 L.의 뉴모 필라 성장의 테스트를 위해 숯을 제외하고 BCYE에 사용되는 모든 화학 시약을 결합하여 ACES-효모 추출물 국물 (AYE)를 준비하고 한천. 필터 소독 즉시 사용하거나 나중에 실험 동결. </li></ol></li><li> 는 sa에 재현 탁 생물적절 100 μg의 / ㎖ 티미 딘 보충되어 J774A.1 세포에 사용 나 조직 배양 배지. </li></ol></li><li> 대 식세포 감염 <ol><li> (박테리아 성장 억제 및 진핵 세포 용해 스크리닝 화합물 및 양성 및 음성 대조군) 관심 시험 화합물을 추가한다. 바람직하게는, 차량의 충분한 희석 있도록 DMSO (디메틸 설폭 사이드) 또는 수용액 ≥500x에 원액을 녹인다. <ol><li> 스톡 용액은 냉동 저장 될 수 있지만, 불안정한 화합물 항균제 동결 - 해동 사이클을 피한다. </li></ol></li><li> 조직 배양 배지에서 2.5 × 106 CFU (집락 형성 단위) / m 및 형광 기자 표지 세균 1.0 × 10 7 CFU / ㎖의 대상으로 적절한 비 독성, 막 impermeant, 핵산 산성을 추가하는 발광 박테리아를 희석 2.5 최종 분석 농도에서 염료 바인딩. </li><li> 물론 각 J774A.1 문화에 혼합물의 20 μl를 추가, 최종 분석 볼륨50 μl의 최종 세균 농도 1 × 106 CFU / ㎖ (럭스 오페론 기자) 4 × 10 10 6 CFU / ㎖ (형광 단백질 기자). </li><li> 100 % CO 2, 5 %를 1-3 일 동안 37 ° C에서 증발 가장자리 효과를 방지하기 위해 상대 습도 부화. </li></ol></li><li> 분석 판독 <ol><li> 기자에 맞게 마이크로 플레이트 루미 및 형광 계에 세균의 성장 및 진핵 세포 독성을 읽어 것이 사용된다. <ol><li> 열 (약 10 분 또는 뚜껑 생물 안전 캐비닛 오프에서) 약 20 분 동안 열려 뚜껑 실험실 벤치에 단일 층에 배치하여 사전 발광 독서에 마이크로 평형, 온도 관련 가장자리 효과를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 나중 시점에서 실시간 판독이 필요한 경우 인큐베이터 마이크로 플레이트 반환한다. </li></ol></li></ol> 2. 데이터 분석 <ol><li> 긍정과 부정 사기꾼에 데이터를 정규화trols는 진핵 세포에 대한 세포 내 세균의 성장과 %의 세포 독성에 대한 퍼센트 접이식 억제를 계산합니다. </li><li> P는 +를 n을 μ μ | 3 (σ p를 + σ n)이 / - 분석 견고성을 평가하기 = 1 &#39;Z 분석 Z-계수 (Z)를&#39;사용하여 박테리아 성장 억제 및 세포 독성 모두 긍정적이고 부정적인 컨트롤 사이의 통계적 거리를 계산 |. 이 식에서, P는 σ 및 σ n은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 표준 편차이다; μ p와 μ N은 각각 양성 및 음성 대조군 웰에 대한 평균 값이다. <ol><li> 높은 처리량 스크리닝 분석법을 위해, 관심있는 시험 화합물의 효과를 평가하기 위해, Z 표준 점수 (또는 다른 대안으로서, 정량적 통계 방법)을 계산한다. 또한, 간단한 배 감소를 계산하거나 관련성이 잠재적으로 생리 학적으로 감소 배를 기록<html> 기하학적으로 복제 세균에 대한 효과 크기의 측정. </li></ol></li></ol> 3. 단일 및 다중 차원 (즉, 시너지) 용량 - 반응 시험 및 자료 해석 <ol><li> 프로토콜 섹션 1에 설명 된 대 식세포와 박테리아를 준비합니다. </li><li> 직전 감염이나 무균 배양에 (즉, 최소 억제 농도 또는 MIC) 및 낮은에 하이 엔드에 스패닝의 목표로 희석 시리즈를 두 배로, 직렬 완전히 성장을 제거하는 농도를 실험적인 관심의 항균제를 추가 명백한 활동을 보여줍니다 농도를 종료합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 항균 희석 직접 자동 추가를 통해 단일 용량 - 반응 및 조합 시너지 테스트 셋업을 용이하게하기 위해 자동화 된 액체 핸들링 시스템을 사용한다. </li><li> 예를 들어, 서브 배로 희석하여 사용을 고려841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - 희석 시리즈를 접은 분석은 데이터의 정확성과 재현성을 높이기 위해 복제합니다. </li><li> 대식 세포를 감염, 발광 박테리아를 조직 배양 배지에서 2.5 × 106 CFU (콜로니 형성 단위) / ml로 희석 타겟팅. 물론 각 J774A.1 문화, 최종 분석 볼륨 50 μL, 최종 세균 농도 1 × 106 CFU / ㎖로 혼합물의 20 μl를 추가; 100 % 상대 습도 5 %에서 37 ° C에서 CO 2를 배양한다. <ol><li> 무균 성장 시험을 위해, AYE 배지에서 1 × 106 CFU / ㎖의 최종 농도 발광 박테리아 희석 384- 웰 플레이트의 각 웰에 50 μl를 추가 5 % CO 2에서 37 ° C에서 부화 100 % 상대 습도. </li></ol></li><li> 박테리아의 성장을 억제하는 항균 조합 분수 억제제 농도를 지수를 계산한다. 세균 g을 완전히 또는&gt; 99 % 억제를 초래 조합의 각 약물 (A, B,.. N) 미국rowth (FIC A, B를, N...) 각 부분 억제 농도 계산을 다음과 같이 FIC A = 화합물의 농도는 &quot;A&quot;의 최소 억제 농도로 나눈 값을 &quot;A&quot;자체. . 그러면 FIC 조합 인덱스를 계산하거나 등 FIC B를 계산 같은 수식을 사용하여 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC는 FIC의 A + FIC B 형 +를 =. . 각 저해 조합에 대한 .FIC 없음. <ol><li> 시너지 효과를 평가하기 위해 1.0에서 가장 멀리 벗어난 조합 인덱스를 사용합니다. 보수적 인 상승 효과의 표시 및 ≥4, 길항제의 효과로 ≤0.5의 차단을 고려하십시오. (12) </li><li> 플롯은 isobolograms isocontour isobolograms 및 / 또는있는 isosurface는 조합의 효과 (6) 같은 대체 그래픽 표현을 isobolograms. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

우리는 세포 내 박테리아의 성장 및 숙주 세포 독성의 동시 검출을위한 실시간 분석을 설명한다. 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 강력한 분석 성능, 세균 및 세포 독성 판독 사이에 충분한 스펙트럼 분리가 있어야합니다. 이러한 분리는 루시 페라 제 오페론 기자와 형광 DNA 결합 염료의 조합에 대한 고유이다. 그러나, 우리의 경험 (표 1-3,도 2), 이중 사용을 기반으로 형광 판독이 겹치지 않는 형광 신호 (예를 들어, 원적외선 형광성 단백질 리포터 녹색 핵산 염색 사용) 강력한 얻기 필요 용액 기반 데이터. 또한, 이전의 경험에서, 잠재적으로 가능한 판독기 광학 또는 솔루션의 형광 특성과 관련, 녹색 또는 주황색 발광 만 DNA의 얼룩&gt; 0.5, stron을 나타내는 척도보다 더 큰 즉, 사용할 수있는 세포 독성 데이터, Z &#39;를 준g 분석 성능을 제공합니다. (4) 따라서, 용액 계, 듀얼 판독 분석 다소 기자 사용할 수 있는지의 관점에서 제한된다. 다른 중요한 단계는 대 식세포에 세균 감염의 비율이다. 세균 감염은 숙주 세포 사멸을 유도한다. 따라서, 너무 높은 접종 초기 숙주 세포의 죽음, 세균 복제의 상대적으로 낮은 수준 및 연구에서 항생제의 직접적인 세포 독성 효과의 가능성이 난처 발생할 수 있습니다. 적절한 감염 비율은 실험적으로 결정될 수 있고, 연구중인 특정 균주의 병원성에 의존 할 수있다. 약 1의 낮은 비율 : 1은 좋은 출발점이 될 것입니다. 같은 그림 2에 표시된 및 표 1과 같은 실험 - 여러 감염 비율로 수행 3은 향후 분석에 사용하기위한 조건의 평가 및 최적화를 허용합니다. 참고로, 특히 레지오넬라, NAT와 변형 배경 사용ively 낮은 숙주 세포의 세포 독성 (A 플라 젤린 돌연변이) 8 얻은 높은 분석 안정성에 크게 기여했다. 또한, 다른 세포에 이중 판독 기술의 번역은, 병원균 호스트 시스템은 감염 프로토콜에 대한 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 레지오넬라 우리 단독 세포 성장 증가 리포터 신호 특성 있도록 조직 배양 배지에서 성장하지 않는다. 그러나, 다수의 세포 내 병원체 (예, 브루셀라)은 모두 세포 내 및 조직 배양 배지에서 다양한 범위로 성장할 수있다. 따라서, 초기 감염 후 겐타 마이신 처리 및 숙주 세포의 세척과 같은 추가적인 단계는 세포 외 복제를 감소시키고 세포의 복제 용량을 선택적으로 조사를 허용 할 필요가있다. (22) 높은 처리량 검사 및 시너지 효과 테스트에 사용하기위한 분석 스케일 업이 도전의 그것의 자신의 세트와 연결되어 있습니다. 대부분의 특정LY, 우리는 필요한 J774A.1 세포의 다수가 가장 세균보다는 기존의 조직 배양 플라스크 (도 1 참조)에서 배양 될 수있는 것을 발견했다. 그러나 문화 불임을 유지하기 위해,이 플라스크 용 스폰지 폼 또는 다른 필터 캡은 표준 박테리아 플라스크 캡 것이 바람직 발견되었다. 표준 조직 문화 인큐베이터 안에 작은 궤도 흔드는 플랫폼의 위치는 손에 장비와 스케일 업 문화를 수행하기 위해 우리를 허용. 마지막으로, 자동 분배 시스템의 사용 (도 1A, B)을 크게 분석 설정 및 조합 희석 시리즈의 테스트를 용이. 특히, 박테리아 복제의 적절한 검출은 충분히 관심 균주의 럭셔리 오페론 또는 형광 단백질 중 하나를 표현하는 능력에 의존한다. 이를 위해, 우리는 FA를 허용해야 강한 구성 적 프로모터에 의해 구동 형광 및 럭셔리 오페론 기자 트랜스포존의 집합을 만들었습니다박테리아의 다양한 유형의 표시 cile (강 및 커비, 데이터 도시하지 않음). 다르게는, 그 세포 내 복제가 숙주 세포에 대한 세포 독성을 증명 병원균 단독 실시간 독성 측정은 세포 복제에 대한 대용으로 사용될 수있다. 그러나,이 경우에, 세포 독성 및 비활성 화합물은 단일 분석에서 확실하게 구별 될 수 없다. 실시간 판독 밖으로의 가용성은 높은 처리량 심사 분석을위한 특별한 이점을 제공한다. 특히, 세균의 성장 (집락 형성 단위 결정) (7) 및 세포 독성 (분석의 종료에서 세포 생존 시약을 첨가) (23, 24) 여러 실험 단계 및 관련 노동을 제거의 엔드 포인트 평가의 회피. 또한, 시간 코스는 쉽게 실험적인 노력에 최소한의 증가와 같은 분석 우물에 따라 할 수있다. 중요한 것은, 세균 복제 기자의 두 가지 유형의 가용성 (박테리아리터의 럭셔리 오페론 및 형광 단백질)의 높은 처리량 심사 분석 개발을위한 특별한 의미가있다. 특히, 럭셔리 오페론 또는 형광 기자의 출력 가짜 간섭으로 인한 가양 항균 판독 값은 순차적으로 보완 직교 기본 및 보조 검사에서 분석, 각각 25 두 기자의 사용을 통해 해결할 수 있습니다. 특히, 우리는 박테리아 LUX 오페론가 대략 20 배와 세균 성장의보다 민감한 리포터 것을 발견 우리 형광성 단백질 리포터보다 낮은 검출 한계를 100 배. 그러나 럭스 출력은 여러 유전자의 제품과 광 출력에 필요한 단계에 따라 더 오탐 (false positive)에 대한 가능성이 될 수 있습니다. (26)은 구체적으로는, 하나의 진핵 유전자 루시페라아제 리포터 달리 박테리아 LUX 오페론은 루시퍼 기판의 내생 적 합성을위한 이성 루시퍼 라제 효소의 유전자를 모두 인코딩 다섯 유전자 클러스터이다. 그것은 것충분한 감도를 보장하기 위해 기본 화면에서 럭셔리 연산자 기자를 사용하는 것이 이해, 그리고 차 분석에서 형광 단백질 기자는 특이성을 확인합니다. 이와 함께, 기재된 방법은 박테리아 복제 및 진핵 세포 독성을 측정하기위한 분석 종단점 실시간 비파괴 대안을 제공하며, 그러므로 세포 내 병원체에 대한 항균 효과를 평가하기위한 방법론 간단하고 다양한 방법을 나타낸다.

세포 내 구획에 일시적으로 증가 또는 상주 병원균은 치료 근절하기 어렵다. 의무 또는 상대적으로 이러한 레지오넬라 뉴모 필라, Coxiella burnetii의, 브루셀라 종으로 세포 내 병원균을 의무. , Francisella의 야토 및 진균 종. 종종 달에 몇 년의 범위 일 수있다 치료를위한 항생제 치료의 과정을 연장 필요합니다. 또한, 세포 외 병원균은 일시적으로 세포 내 틈새 시장을 점유하고이 방법으로 항생제 치료의 일반적인 과정에 의해 허가를 탈출하고 나중에 악성 감염의 새로운 라운드를 시작합니다 나타날 수 있습니다. 황색 포도상 구균 (1) 및 uropathogenic 장내 세균 2,3 감염이 점점 인식 예입니다. 따라서, 근본적으로 신약 개발 목표는 세포 내 구획 침투 신규 항생제를 확인하는 것이다. 최적의 치료는 빨리 근절하기세포 생물 및 하위 억제 항균 노출을 통해 저항의 개발을 방지 특히 바람직하다. 이를 위해 모델 병원체, 레지오넬라 뉴모의 세포 성장을 표적 세포 - 침투제 항균제를 식별하기 위해 고 처리량 스크리닝 기술을 개발했다. 4 이전 임상 관찰은 표준 항생제 감수성 검사가 정확하게이 생물에 대한 생체 내 치료 효과에 예측하지 않았 음을 나타냅니다. 이러한 β - 락탐 및 아미노 글리코 사이드와 같은 항균제의 주요 클래스, axenically 성장 레지오넬라 균에 대해 매우 효과적이지만, 충분히 레지오넬라 균이있는 세포 내 구획에 침투하지 않기 때문에 5는 특히이이었다. 5,6 나중에 증거가 기술적으로 더 복잡한 세포 성장 분석을 효과적으로 임상 적 효능을 예측하는 것이 좋습니다. (7) </sup&gt; 불행하게도, 이러한 분석은 집락 형성 단위 열거 위해 상이한 시간 점에서 용해 될 항균제로 처리 감염된 대 식세포를 요하는 매우 힘든 종점 분석법이었다. 이러한 분석은 대규모로 수행하는 것은 비실용적이고 높은 처리량 약물 발견에 부적합하다. 따라서, 우리는 세포 내 세균 성장의 실시간 측정을위한 기술을 개발했다. 6이 박테리아 염색체에 4 형광 단백질을 (이전에 기술, 1 세대 분석) 중 세균 루시퍼 라제 오페론 (8)의 통합을 통해 변형 된 박테리아 균주의 사용을 통해 구 기자 (여기 한 제 2 세대, 직교 분석 등)를 달성했다. 이러한 방식으로, 발광 또는 형광 신호 세균 수의 대용 실시간 판독을 제공한다. 그러나, 이러한 특성은 세포 내 infectio의 주요 교란 요인을 해결하지n 개의 분석, 숙주 세포에 오프 대상 효과. 구체적으로, 숙주 세포의 죽음은 본질적으로 세포의 성장을 제한하고, 항균 효과의 위양성 식별 리드. 심사 라이브러리의 많은 화합물은 진핵 세포 독성, 이러한 오탐 (false positive)이 후속, 해결을위한 엔드 포인트 세포 독성 분석의 큰 숫자를 필요로 사실 항균제를 압도 할 것입니다. 따라서, 동시에 진핵 세포 생존율 및 세포 성장을 평가 할 수 있도록 큰 관심이었다. 특히, 비 생존 진핵 세포의 특성은 세포막 무결성의 손실이다. 세포막의 투과성을 테스트 프로브 따라서 세포 생존 능력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 우리는 이전에 액세스 사균의 핵 DNA를 염색하기 위해 추정되는 세포막 - impermeant, 형광 DNA 결합 염료의 일련의 기능을 특징으로한다. 4 핵 DNA 결합에,이 염료는 quantu에서 큰 증가를 표시배경 솔루션 형광 이상 증가 신호의 결과로 m 형광 수율. 따라서, 이러한 염료는 진핵 세포 사멸의 정량적 판독을 제공 하였다. (4) 특히, 우리는 여러 가지가 J774의 대 식세포와 연장 공동 배양하는 동안 자신 무독성 것으로 나타났다. 초기 감염 기간 동안 첨가하면, 그것들은 실시간 현미경 마이크로 플레이트 형광 계에 의해 측정 또는 관찰 할 수있는 진핵 세포 사멸의 형광 판독 값을 제공 하였다. 따라서, 세균 리포터 무독성, 막 impermeant 사용을 결합하여, DNA 결합 염료, 우리는 세균 부하 동시에 진핵 세포의 세포 독성을 동시에 측정 할 수있는 단순하고 비파괴 실시간 분석을 개발할 수 있었다. 이 분석은 우리의 세포 성장을 억제 할 수있는 능력을 위해 ~을 포함하여 기능적지지 않은 활동 (250) 항균제 및&gt; 240,000 작은 분자를 384 웰 플레이트 형식으로 화면 ~ 10,000 알려진 생체 활성제 할 수있다레지오넬라 뉴모 동시에 각 화합물 진핵 세포 독성 데이터를 생성하는 동안. 레지오넬라 균의 세포 성장에 대한 알려진 항생제 (6) 우리의 분석은 지금까지이 유형의 가장 포괄적 인 탐사했다. 6 병용 할 때 우리의 분석 포맷의 효율에 기초하여, 우리는 다음에 공지 된 항균제의 잠재적 상승 효과를 탐구. 가장 일반적인 시너지 테스트 중 하나, 소위 바둑판 분석은 표준 적 둘 이상의 항균제의 2 배 희석액의 조합 효과를 평가함으로써 수행된다. 두개 이상의 항 미생물제를 별도로 적용 각각의 효과의 합보다 함께 적용될 때 이러한 분석에서 10 시너지는 큰 효과의 관찰에 의해 정의된다. 참고로, 지금까지 만 집중과 선택적 시너지 시험은 세포 내 레지오넬라 뉴모 필라에 대해 수행되었다 </em&gt; 필요한 조합 순열을 곱한 기존의 엔드 포인트 분석에 포함 된 큰 노력 때문이다. 시너지 테스트를 용이하게하기 위해 디지털 자동 분배 기술 (6)과 조합하여 실시간 세포 성장 / 진핵 세포 독성 분석에 사용했다. 이 자동화는 DMSO 또는 수용액 단독 또는 384 웰 형식의 조합에 용해 화합물의 연속 희석을 분배하는 우리를 허용. (11) 또한, 이러한 강력한 액체 핸들링 기술은 용이하게 더 높은 해상도를 수행하라고 허가 제곱근 -의 두 (대신 표준보다 낮은 해상도, 두배) 우리 이차원 특이성 높은 수준을 달성하기 위해 희석 조합을 바둑판 시너지 분석. 이 배 희석 시리즈 12을 사용하는 경우이 해결 재현성에 대한 시너지 분야에서 문제를 해결에 특히 유용했다. 마지막으로, 우리의 분석은 정량적도 THER했다는 efore 억제의 그라데이션을 측정 하였다. 결과적으로, 분석은 성장 억제 비슷한 수준으로 조합 농도 isocontours 연결되는 isocontour isobolograms의 발현 억제 내용 전체를 캡처. 6이 묘화 전략은 조합 적 투여 량 - 반응 곡선을 가시화시켰다. 우리의 방법론을 설명하기 위해, 우리는 이러한 분석을 수행하기위한 우리의 프로토콜을 설명하고 대표적인 결과를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>J774A.1 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Host cell</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&amp;nbsp;</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Yeast extract, ultrafiltered</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors</td></tr><tr><td>Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Potassium phosphate, dibasic</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Ammonium iron(III) citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide solution, concentrated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Deonized water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium</td></tr><tr><td>Thymidine (tissue culture grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium &amp;mdash; lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, standard formulation</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>RPMI 1640 lacking phenol red</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine &amp;mdash; supplement to 2 mM before use</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)</td><td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration</td></tr><tr><td>Iron-supplemented calf serum</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density</td></tr><tr><td>SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)</td></tr><tr><td>Shaker flasks (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td></tr><tr><td>Shaker clamps for flasks (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td></tr><tr><td>Shaker flasks (1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td></tr><tr><td>Shaker clamps for flasks (1,000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection</td></tr><tr><td>Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes</td></tr><tr><td>Combi standard bore manifold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Default predispense volume of 20 &amp;#956;l is insufficient to compensate for settling &amp;mdash; increase to 80 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>White 384 well dishes treated for tissue culture</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully</td></tr><tr><td>DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>For dissolving positive control and test compounds</td></tr><tr><td>Azithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antibiotic positive control</td></tr><tr><td>Saponin (from Quillaja bark)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Cytoxicity positive control</td></tr><tr><td>Multichannel pipettor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing</td></tr><tr><td>Epson pin transfer robot</td><td>Epson/ICCB-L</td><td>(Custom equipment)</td><td>For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays</td></tr><tr><td>D300 digital dispensing system</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>D300</td><td>For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>T8+ cartridges for D300 digital dispensing system</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td><td>For dispensing test compounds</td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution</td></tr><tr><td>Glass-bottom tissue culture dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.&amp;nbsp; These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.</td></tr></tbody></table>

high throughput, real-time, dual-readout testing of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity

세포 내 항균 활성 및 진핵 세포의 세포 독성의 전통적인 조치는 엔드 포인트 분석에 의존하고 있습니다. 이러한 엔드 포인트 분석은 세포 용해, 집락 형성 단위 결정, 또는 시약을 추가로 판독을하기 전에 몇 가지 추가 실험 단계를 필요로한다. 예를 들어, 높은 처리량 스크리닝 분석법 중에 수천을 수행 할 때, 이러한 유형의 분석법에 필요한 하류 노력은 상당하다. 따라서, 높은 처리량 항균 검색을 용이하게하기 위해, 우리는 동시에 세포 내 세균 증식의 억제제를 식별하고, 진핵 세포의 세포 독성을 평가하기위한 실시간 분석을 개발 하였다. 특히, 실시간으로 세포 내 세균의 성장 검출은 세균 룩스 오페론 (1 차 세대 분석) 또는 형광 단백질 기자 (2 차 생성, 직교 분석) 중 하나와 세균 검사 균주를 표시하여 사용 하였다. 비 독성, 세포 막 impermeant 핵산 결합 염료또한 대 식세포의 초기 감염시 추가되었습니다. 이 염료는 가능한 세포에서 제외됩니다. 그러나, 비 - 실행 가능한 숙주 세포 엔트리 핵 DNA의 형광 표식 (디옥시리보 핵산)를 허용 막 완전성을 잃는다. 특히, DNA는 숙주 세포 사멸의 용액 기반의 판독을 제공하고, 형광 양자 수율이 크게 증가와 관련된 바인딩. 우리는 마이크로 플레이트 포맷에서 높은 처리량 스크린을 수행하고, 현미경으로 세포의 성장과 세포 독성을 평가하기 위해 결합 분석을 사용 하였다. 특히 항균제 함께 적용 둘 이상의 항균제의 결합 된 효과는 개별적으로 적용될 때보다 큰 시너지 효과를 입증 할 수있다. 다른 농도에서 항생제의 조합 순열을 평가해야하기 때문에 세포 내 병원균에 대한 시험 관내 시너지 효과를 테스트하는 것은 일반적으로 엄청난 작업입니다. 그러나, 우리는 우리의 실시간 분석이 자동화, 디지털 분배 기술 쪽과 함께 발견손쉬운 시너지 테스트 ermitted. 이러한 접근 방식을 사용하여, 우리는 체계적으로 세포 내 병원균, 레지오넬라 뉴모 필라에 혼자 항생제의 많은 수의 행동과 조합을 조사 할 수 있었다.

마이크로 세포 성장 분석 도 1은 분석 단계도이다. 도시 자동화 단계가 수동으로 수행 될 수있다. 그러나, 처리량이 큰 액체 핸들링 시스템을 이용하여 용이하게된다. 도 2는 384- 웰 마이크로 플레이트, 듀얼 판독 실시간 세포 성장 및 (Lp02)은 중 어느 하나에 lux 오페론 (도 2A, 2B) 또는 mNeptune2 형광 단백질로 표시된 레지오넬라 균주 (하여 진핵 세포 독성 분석에서 대표적인 결과를 나타낸다 그림 2C, 2D) 기자. 양성 및 음성 대조군 화합물 (DMSO는 항생제, 사포닌)는 높은 처리량 스크리닝 환경에서 성능을 시뮬레이션하기 위해 핀 이송 로봇을 이용하여 플레이트에 첨가 하였다. 중요한 레지오넬라 </EM&gt; 성장 (도 2A, 2C)은 각각, mNeptune2 표지 박테리아 발광 박테리아 (24) 72 시간 48 ~ 72 시간에서 사포닌 분해 및 항생제 치료 컨트롤에 비해 쉽게 구별 할 수 있습니다. 레지오넬라는 일반적으로 48 내지 72 시간 동안 복제 후, 숙주 세포를 lyses. 이것은 시간이 지남 SYTOX 그린 (a 대표 impermeant 핵산 결합 성 염료 및 숙주 세포 사멸 마커)의 형광 증가를 보여준다 1b 및도 1d에서 알 수있다. 독성 결국 세제 (사포닌)에서 관찰되는 최대 양은 숙주 세포 용해, 양성 대조군에 도달한다. mNeptune2 표지 생물 가능성이 더 빠른 숙주 세포 살해를 차지 럭스 오페론 표지 박테리아보다 4 배 더 높은 접종에 추가 및 이전 mNeptune2 실험에서 형광 신호의 증가 관련이 있었다. 효과적인 항균 처리 (레보플록사신 또는 아지 스로 마이신) 이전을 예상대로모두 세균의 성장 및 호스트 세포 용해를 ented. 역으로, 숙주 세포의 파괴를 통해 세포의 성장을 제한 세포 독성 화합물 (예를 들면, 사포닌)가 쉽게 낮은 발광 또는 형광 mNeptune2, 높은 독성과 연관된 신호의 조합에 의해 식별 될 수있다. 또한, 결합 발광 및 mNeptune2 형광 (세균의 성장) 모두에서 감소 및 세포 독성의 관찰이 화합물은 진정한 세포 성장 억제제는 것을 합리적 확신을 제공 (예를 들어, 아지 스로 마이신과 레보플록사신 긍정적 인 컨트롤) 대신에 가짜 간섭으로 인한 가양보다 세균 기자 신호. 표 1-3은 대표적인 세 가지 다른 박테리아 기자 Z &#39;(럭셔리 오페론, mNeptune2, tdTomato)와 컨트롤에 해당하는 형광 측정 값의 상대를 보여줍니다. A ~ Z &#39;&gt; 0.5는 STATISTICA을 나타냅니다높은 처리량 설정에 대한 에서야 강력한 분석 적절한; 그러나, 낮은 Z &#39;는 실험적인 목표, 즉, 신뢰성 시험 화합물 또는 교란의 다소 미묘한 효과를 구별 할 수있는 능력에 따라 적합 할 수있다. 도 2의 결과에 기초하여, mNeptune2은 박테리아 루시퍼 라제 오페론만큼 민감한 리포터 아니었다. 따라서, 예상대로 강력한 음에 mNeptune2 신호의 차이 (DMSO)과 양극 (레보플록사신, 아지 스로 마이신, 사포닌) 성장 억제제 컨트롤 대조적으로, 배양 2 일 또는 3 일까지 관찰되지 않았다 조기, 럭스의 합리적 강력한 신호 감염 후 1 일에 오페론 기자 박테리아. 반대로 tdTomato 대안 세균 형광 리포터는 감염성 과정을 통해 최적 Z &#39;를 보였다. 차선의 형광 특성 tdTomato의 최적의 판독에 사용되는 범위에 형광 여기 및 방출 꼬리의 잠식에서 일부 결과ignal. 이 잠식은 레보플록사신 비교 대 tdTomato 사포닌에있는 긍정적 인 Z &#39;에서 알 수있다 (박테리아 복제해서는 안 어디에 두 조건에서 세균 수에 큰 차이를 의미). 이 결과는 꼬리 tdTomato 방사로 감지하고, 따라서 사포닌 항생제 컨트롤 간의 차이 스퓨리어스 이어지는 강한 형광 신호를 일으키는 사포닌 분해에 의해 설명 될 수있다. 형광과 함께 박테리아 룩스 mNeptune2 기자 적어도 상기 수학 신호 컨벌루션없이, 듀얼 판독 용액 기반의 실시간 분석은 tdTomato 형광 조합 가능한 표시하면서 따라서하지 않는다. 도 3은 이전에 lux 오페론 리포터 표지 된 유기체를 이용하여 공지 된 항생제의 투여 량 - 반응 곡선의 예를 게시 나타낸다. (6) 특히, 레지오넬라는 않습니다조직 배양 배지에서 성장하지. 따라서, 대식 세포 감염 분석에서 박테리아의 복제는 전적으로 세포 성장을 나타냅니다. (- (2- 아세트 아미도) -2- 아미노 에탄 산 N) 효모 추출물 매체 그러나, 레지오넬라는 액체 ACES는, 전문, 저 나트륨에 axenically 성장할 것입니다. 세포 내 및 무균 성장에 여기에 (20) 효과를 비교 하였다. 두 성장 시스템을 사용하여, 우리는 β-락탐 (메로페, 세프 트리 악손) 및 아미노 글리코 사이드 (미도 데이터) 등의 극성 항생제는 세포 성장 불량한 억제제 무균 성장에 미치는 잠재적 효과에 대조적으로되어 있음을 관찰 할 수 있었다. 아마도 대식 세포 감염 분석에서 가난한 효능은 세포 내 레지오넬라 복제 성 틈새에 액세스 할 수 없음을 기반으로합니다. 반면, 같은 퀴놀론 (레보플록사신)과 아지 스로 마이신과 같은 진핵 세포 침투 항생제는 모두 세포 내 및 무균 세균에 강력한 효과를 보여 주었다. (50) 및 측정 할 수 CC (50) (50 % 진핵 세포 사멸을 유도하는 농도) 및 선택성 CC 50 / IC (50), 계산 (농도 50 %의 세균의 성장 억제 용). 세 가지 조치 신약 개발 노력에 화합물의 진행에 중요한 기준이다. 도 4는 항생제 독시사이클린에 응답 이러한 이중 용량 - 반응 곡선의 예를 나타내고, 시간의 경과와 동일한 스크리닝 웰에서 얻은 정보. 도 4a에서, 감염 1 일째에 약 수백 배의 박테리아 복제 항생제 관찰 억제 최고 수준에 비해 제로 항균 시험 웰에 분명하다. 매우 높은 doxycy 제외하고 최소한의 관련 진핵 세포 독성이 있었다클라인 농도 (≥10 μg의 / ㎖). 2 일 (그림 4B)에서 세균 럭셔리 신호가 약 낮은 항생제 농도에서 관찰 중요한 박테리아 복제 관련 세포 독성에 하루 1보다 10 배이었다. 예상 한 바와 같이, 박테리아 복제 유발 숙주 세포 사멸 항균 용량 - 반응 곡선에 걸쳐 세균 번호 (LUX 신호)와 긴밀하게 추적한다. 높은 항균제 농도에서 세포 독성이 형광 기반 세포 독성 측정에 비하여 약간 높은 항생제 농도를 향해 발광 용량 - 반응의 겉보기 시프트가 다소 과장 1 일째에 관찰 독시사이클린 다시 독성이 나타나는 매우 높은 농도까지 기준선으로 감소 로그 및 리니어 스케일에 발광 및 세포 독성을 플롯 할 때 각각 그림과 같이. CC (50)는 약 10 μg의 / ㎖ 동안 박테리아 성장을위한 IC (50)는 약 100 ng를 / ㎖이었다 </sub&gt;를 CC (50)과 일치는 백혈구 혈통의 독시 싸이클린 처리, HL-60 세포주에 대해 이전에 설명했다. (21) 따라서,이 듀얼 판독 실험 결정 전체 선택성은 약 100이었다. 그림 5는 이전에 항생제의 페어 조합이 세포 내 L.의 뉴모 필라에 대한 강화 효과에 대해 시험 된 두 차원의 시너지 시험과 관련된 isocontour isobolograms을 발표 보여줍니다. 도 6은 비록 표준 isobolograms 완전히 isocontours를 이용하여 억제의 유사한 수준의 점을 연결 가능한 정량 억제 데이터에 기초하여, 우리는 선택한 성장을 억제하는 항생 물질의 농도는 낮은 조합을 연결한다. 이 다이어그램의 오른쪽 가장 isocontour는 표준 isobologram 라인에 해당한다. 오목 isobolograms는 일반적으로 시너지 효과를 나타냅니다 볼록 isobolograms generall 동안Y는 무관심하거나 적대감을 나타냅니다. 시너지 (패널 AC) 무관심의 예는 각각 &lt;0.5 ≥1의 FIC 인덱스 값에 대응하는,이 경우 (DF) 나타낸다. 6 참고로, 아지 스로 마이신, 미노사이클린 및 리팜피신의 페어의 조합은 시너지 효과를 보여 주었다. 도 6에 도시 된 바와 같이 6 따라서, 이들 제제는 삼방 조합 함께 시험 하였다. 여기서, 표면은 세균 세포 성장을&gt; 99 % 억제되었다 세 미생물제의 최저 농도를 조합 연결 그려졌다. 관찰 된 오목한 모양의 표면은, 그 자체로 입체 시너지 효과의 암시, 상당한 시너지 효과를 나타내는 낮은 FIC 지수 (0.325)에 맞습니다. <img src="/files/ftp_upload/54841/54841tbl1.jpg" table="" /> 표 1 : Z &#39;럭셔리 오페론-보고서어, 양성 및 음성 대조군의 레지오넬라 infection- 비교. Z &#39;는도 2a, 2b에 도시 된 데이터 요소에 대응한다. 이 표는 치아라 비글 리오와 커비 2014 년 4 긍정적 인 발광 Z &#39;&gt; 0.25에서 수정 된 검정색 배경에 노란색 문자로 강조 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/54841/54841tbl2.jpg" table="" /> 표 2 : mNeptune2 - 기자, 레지오넬라 감염 Z &#39;- 양성 및 음성 대조군의 비교. Z &#39;는도 2c, 2d에 도시 된 데이터 요소에 대응한다. 긍정적 인 mNeptune2 형광 Z &#39;&gt; 0.25 빨간색 문자로 강조 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/54841/54841tbl3.jpg" table="" /> 표 3 : Z &#39;tdTomat에 대한오 - 기자, 레지오넬라 감염 - 양성 및 음성 대조군의 비교. 긍정적 인 tdTomato 형광 Z &#39;&gt; 0.25 빨간색 문자로 강조 표시됩니다. SYTOX 녹색과 tdTomato 방출의 중복과 관련된 거짓 긍정적 인 Z &#39;&gt; 0.25는 녹색 문자로 강조 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig1.jpg" /> 그림 1 : 듀얼 기자 분석 설정의 화보 표현입니다. 384 잘 접시에 정지 성장 J774A.1 세포의 (A) Replating. 마이크로 관심 화합물 (B) 추가. (C)의 동시 감염 핵산 결합 성 염료의 첨가; 잠복; 및 판독. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a><html> URE. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig2.jpg" /> 도 2 : 듀얼 고 스루풋 포맷의 세포 내 박테리아의 성장 및 진핵 세포 독성 실시간 판독. LUX 오페론 발현 레지오넬라 뉴모와 J774A.1 세포의 세포 내 감염 동안에 발광 (A) 및 형광 (B)의 신호에 대응. 레지오넬라 뉴모을 mNeptune2가 발현와 J774A.1 세포의 세포 감염시 형광 단백질 (C) 및 형광 (D) 신호에 대응. 네 치료가 표시됩니다 부정적인 DMSO 제어 ( <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq3.jpg" /> ); 양성 세포 독성 제어, 사포닌 ( <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq6.jpg" /> ); 양성 박테리아 성장 억제 제어, 아지트로 마이신 (기 4 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg &quot;/&gt;) 및 레보플록사신 ( <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq5.jpg" /> ). 데이터 포인트 중복, 384 웰 플레이트에서 수행 96 회 반복의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 참고 일부 데이터 포인트의 표준 편차 오차 막대는 최소한 따라서 데이터 포인트 기호 숨겨져 있었다. 패널 A와 B는 치아라 비글 리오와 커비 2014 년 4에서 수정 된 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig3.jpg" /> 도 3 일차원, 용량 - 반응 분석의 대표적인 예. J774A.1 세포는 표시된 항균제의 2 배 희석액 시리즈 LUX 오페론 발현, L. 뉴모 감염시켜 처리 (라&#39;세포&#39;)로이라고 표기. 병행 럭스 오페론 발현은 레지오넬라 에이스 효모 추출물 배지 (AYE)에서 동일한 최종 농도로 희석시키고 ( &#39;무균&#39;로 표시) 동일한 두 배 희석 계열로 처리 하였다. 발광 이틀 후 세균 접종을 읽고 항균 농도에 대해 그려졌다. 패널 A는 항 미생물제는 일반적으로 레지오넬라 감염을 치료하는 데 포함한다. 패널 B는 서로 다른 마크로 라이드 항생제의 활동을 비교합니다. 패널 C는 다양한 때로는 세포 내 및 무균 힘을 대조와 항생제의 여러 클래스가 포함되어 있습니다. 데이터 포인트는 평균과 상태에 따라 세 가지 별도의 테스트 우물의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig3large.jpg" target="_blank">큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig4.jpg" /> 도 4 : IC 50, CC (50) 및 선택성을 결정하기위한 듀얼 판독, 용량 - 반응 실험 예. 세포의 성장과 J774A.1 세포 독성에 독시 싸이클린의 효과는 일 1, 2 포스트 감염에 측정 하였다. 데이터 포인트는 평균과 상태에 따라 세 가지 별도의 테스트 우물의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig5.jpg" /> 그림 5 :이 차원의 시너지 효과 분석의 예. 조합 직렬 DIL항생제의 쌍 용액 사용은 J774A.1의 대 식세포에서 레지오넬라 균의 세포 성장에 대한 시너지 효과에 대해 시험 하였다. Isocontours 라인은 비슷 %의 억제의 점을 연결합니다. 가장 오른쪽 isobologram 완전한 세포 성장 억제 (&gt; 비 처리 대조군에 비해 99 %의 발광 감소)과의 조합을 연결하여 표준 isobologram 플롯에 대응한다. 각 그래프의 색상 코딩 키에 의해 묘사로 음영 %의 억제를 나타냅니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 Isocontours는 해당 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 미처리 컨트롤 20, 10, 5, 1 % 성장 상대. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54841/54841fig6.jpg" /> <strong&gt;도 6 : 입체 시너지 분석의 예. &gt; 99 %의 성장 억제의 결과로 마이신, 리팜피신 및 미노사이클린의 최저 농도는 조합 isobologram 표면 플롯을 형성 할 하였다. 이 그림은 치아라 비글 리오와 커비 2015 년 6에서 수정 된 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54841/54841fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K 조회수.  Beth Israel Deaconess Medical Center. A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug screening assays utilize cytotoxicity as one of the critical characteristics to be profiled for individual compounds. Cells in culture are a useful model to assess cytotoxicity before proceeding to follow up on promising lead compounds in more costly and labor-intensive animal models. We describe a strategy to identify compounds that affect cell growth in a tdTomato expressing human neural stem cells (NSC) line. The strategy uses two complementary assays to assess cell number. One assay works via the reduction of 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) to formazan as a proxy for cell number and the other directly counts the tdTomato expressing NSCs. The two assays can be performed simultaneously in a single experiment and are not labor intensive, rapid, and inexpensive. The strategy described in this demonstration tested 57 compounds in an exploratory primary screen for toxicity in a 96-well plate format. Three of the hits were characterized further in a six-point dose response using the same assay set-up as the primary screen. In addition to providing excellent corroboration for toxicity, comparison of results from the two assays may be effective in identifying compounds affecting other aspects of cell growth.

It is often necessary to assess the potential cytotoxicity of a set of compounds on cultured cells. Here, we describe a strategy to reliably screen for toxic compounds in a 96-well format.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

생화학

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

암 연구학

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

의학

CAR 발현 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸 평가

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable fragment, scFv), with an accompanying intra-chain linker, followed by a hinge, transmembrane, and costimulatory domain. Modification of the intra-chain linker and hinge domain can have a significant effect on CAR-mediated killing. Considering the many different options for each part of a CAR construct, there are large numbers of permutations. Making CAR-T cells is a time-consuming and expensive process, and making and testing many constructs is a heavy time and material investment. This protocol describes a platform to rapidly evaluate hinge-optimized CAR constructs in Jurkat cells (CAR-J). Jurkat cells are an immortalized T cell line with high lentivirus uptake, allowing for efficient CAR transduction. Here, we present a platform to rapidly evaluate CAR-J using a fluorescent imager, followed by confirmation of cytolysis in PBMC-derived T cells.

저자 스포트라이트: High-Throughput Screening of CAR T-Cell Constructs for Enhanced Cytotoxicity and Immunologic Memory (세포독성 및 면역학적 기억 향상을 위한 CAR T 세포 구조의 고처리량 스크리닝) 

A protocol to evaluate quantitative tumor cell killing by Jurkat cells expressing chimeric antigen receptor (CAR) targeting single tumor antigen. This protocol can be used as a screening platform for rapid optimization of CAR hinge constructs prior to confirmation in peripheral blood-derived T cells.

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

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낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

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인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

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