이 작품은 광 동 자연 과학 재단의 중국 (2015A030313500), 지방 키 국제 협동 연구 플랫폼 및 주요 과학 연구 프로젝트의 광 동 등 교육 (2015KGJHZ015), 과학에 의해 투자 되었다 고 광 동 담배 독점 관리 (201403, 201705), 과학 학부 학생 (201711078001) 국가 혁신 교육 프로젝트 (2016B020201001), 중국의 광 동의 기술 계획의 기술 계획. 상호 또는이 간행물에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.

1. SSR 마커의 PCR 제품의 준비
<ol><li>서식 파일 DNA를 포함 하 여 PCR 반응을 위한 모든 화학 제품 및 시 약 준비 (30 ng / µ L), 2 × PCR 마스터 믹스 (0.4 m m 각 dNTP, MgCl2, Taq DNA 중 합 효소와 염료의 0.1 U / µ L의 3 m m의 2 × PCR 버퍼를 포함 하는), 각 10 µ M 앞으로 반전 뇌관 증 류 및 저온 (dH2O). 참고: 현재 연구에 사용 된 SSR 마커 했다 PT51333 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' 및 역방향 뇌관 순서: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3') 및 PT50903 (뇌관 순서 앞으로: 5 '-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG-3'와 뇌관 순서를 반대로: AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3-5' ') 담배, 및 CX-43 (뇌관 순서 앞으로: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' 반전 뇌관 순서: 5'-AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3')와 CX-157 (뇌관 순서 앞으로: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' 뇌관 순서를 반대로: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3') 꽃 배 추에 대 한.</li>
	<li>템플릿 DNA, 2 × PCR 마스터 믹스, 각 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관의 0.2 µ L, dH2오의 2.6 µ L의 5 µ L의 2 µ L을 추가 하 여 10 µ L PCR 믹스의 확대를 위한 준비</li>
	<li>5 분 동안 94 ° C의 초기 단계로 thermocycler의 PCR 증폭 반응 수행, 45의 38 주기 여 변성, 45 94 ° C에서 s s 뇌관 어 닐 링 55 ° C에서 확장, 72 ° C에서 1 분 및 72 °에서 10 분의 최종 확장 단계 C; 그런 다음 나중에 사용할 4 ° C에서 PCR 제품 저장.</li>
</ol>2. 준비 솔루션의 Polyacrylamide 젤 캐스팅
<ol><li>기본 트리 및 dH2O 27.5 g 붕의 54 g 용 해, 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mL를 추가 하 고 솔루션 1, dH2o. 000 mL의 최종 볼륨을 조정 하 여 5 × TBE 버퍼 1 리터를 준비 참고: TBE 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 몇 달 동안.</li>
	<li>DH2O 2 L의 최종 볼륨을 5 × TBE 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 0.5 × TBE 버퍼의 2 리터를 준비 하 고 상 온에서 저장.</li>
	<li>29 g 분자 생물학 급료 아크릴의와 분자 생물학 급 N, N 1 g을 용 해 하 여 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션 준비 '-500 mL의 최종 볼륨을 0.5 × TBE 버퍼에 methylenebisacrylamide. 커버 알루미늄 호 일 및 나중에 사용할 4 ° C에서 저장소 솔루션 병. 주의: 아크릴 강력한 neurotoxin 간주 됩니다 하 고 신중 하 게 처리 되어야 한다. 분말 및 그것을 포함 하는 처리 솔루션 무게 때 항상 장갑을 착용 하십시오.</li>
	<li>DH2O 10 mL의 최종 볼륨을 APS의 2 세대를 용 해 하 여 20% 염화 persulfate (AP) 솔루션을 준비 합니다. 그것은 몇 달 동안-20 ° C에 저장할 수 있습니다. 참고: 편의 위해 20 %APS 솔루션의 10 mL 수 1.5 mL 또는-20 ° c.에 스토리지에 대 한 원심 분리기 튜브의 2 mL aliquoted 해 동 하 고 사용 하기 전에 잘 섞어.</li>
	<li>아세트산의 0.5%를 포함 하는 95% 에탄올 0.997 mL에 bind silane의 3 µ L를 용 해 하 여 희석된 바인딩-실 란 솔루션을 준비 합니다. 그것은 4 ° C에서 주 저장할 수 있습니다. 주의: 바인딩 silane 독성, 솔루션을 취급할 때 장갑을 착용 이며 룸 통풍 유지.</li>
</ol>3입니다. Polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 대 한 준비
<ol><li>1 세트의 유리 접시와 스페이서 수돗물, dH2오 어 완전 한 rinsing 하 여 다음 세제로 세척 접시 건조 선반에에서 그들을 설정 하 여 판 건조.</li>
	<li>그리고 5 분 동안 건조 직사각형 유리 접시의 안쪽 표면에 bind silane 솔루션의 1 mL를 분산. 참고: 경우 bind silane 솔루션은 접시의 표면에 균일 하 게 확산 되지, 젤 수 있습니다 얼룩 동안 분리할 고 결과 불만족 얼룩 효과.</li>
	<li>면봉으로 금이 낸된 유리 접시의 안쪽 표면에 격퇴 silane의 1 mL에 분산, 초과 격퇴-silane 티슈 종이로 닦아 하 고 5 분 동안 건조 한 공기. 참고: 반발 silane 균일 하 게 유리 접시의 표면 코트 하지 않습니다, 그것은 손상 될 수 젤 부분적으로 벗 겨 서.</li>
	<li>위에, 노치 플레이트 스페이서가 유리 접시를 조립 하 고 클램프 클램프 주조와 어셈블리의 양쪽.</li>
	<li>1.5 m m의 33 cm 폭 × 10 cm 높이 두께의 플레이트 세트에 대 한 비 커에 6% 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL)을 부 어, tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L와 200 µLfresh 20% 추가 AP 부드럽게 섞는다. 참고: 젤 솔루션의 적절 한 금액 (40 mL) 스페이서 (30 cm × 8.5 c m × 0.15 cm)의 간격을 가진 2 개의 격판덮개의 내부 볼륨에서 계산 했다. 젤의 중 합에 대 한 APS와 TEMED의 금액에 대해서는 참조17에 따라 APS와 TEMED 젤 솔루션의 표준 비율. 위에서 설명한 젤 솔루션 4 ° c.에 저장 됩니다. 젤 솔루션 TEMED의 20 µ L와 AP를 사용 해야 하는 20%의 100 µ L, 실내 온도에 저장 됩니다. 부드럽게 솔루션에 공기 방울을 피하기 위해 유리 막대기로 젤 솔루션의 혼합물을 저 어.</li>
	<li>즉시 솔루션을 부 어 하 고 신중 하 게 노치 플레이트의 가장자리를 따라 조립된 유리 접시로 가기로 거의 공간을 채우는 빗을 삽입. 빗에 젤 솔루션의 작은 볼륨을 추가 합니다. 참고: 유리 접시 젤 유출 하지 않도록 수평 유지. 필요한 경우 버블 걸이로 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다. 참고: 중 합에 대 한 시간 젤 솔루션 및 환경 온도를 변경할 수 있습니다.</li>
	<li>젤 완전히 중 합 후, 캐스팅 클램프를 제거 하 고 접시 세트 전기 탱크 단위에 위 버퍼 저수지 쪽으로 직면 하는 노치 플레이트 놓고 큰 클램프를 사용 하 여 연결 플레이트 탱크 단위로 설정.</li>
	<li>상단의 각 0.5 × TBE 버퍼와 낮은 챔버의 1 L를 붓는 다. 빗을 제거 하 고 피 펫 또는 주사기를 사용 하 여 버퍼와 모든 우물을 철저 하 게 플러시. 참고: 젤 샌드위치 접시의 바닥에 어떤 거품 없이 버퍼에 완전히 젖 었 확인 합니다.</li>
</ol>4. 실행 젤
<ol><li>각 잘 polyacrylamide 젤에 PCR 제품의 대략 1 µ L를 로드 합니다. PCR 제품의 샘플 함께 젤의 양쪽에 DNA 크기 사다리를 로드 합니다. 위 버퍼 약 실에 안전 덮개를 해결.</li>
	<li>리드 레드 레드와 블랙 하는 색 일치 하는 전원 공급 장치에 연결 합니다. 염료 ~ 70 분 동안 일반적으로 정의 된 위치에 도달할 때까지 110 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다. 참고: 전압 및 실행 시간 PCR 제품의 크기에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 실버 감지 SSR 마커를 비 Polyacrylamide 젤에 대 한 얼룩
<ol><li>전기 이동 법, 후 위 상공에서 버퍼는 큰 비 커를 통해 밸브에 배수 하십시오. 사이드 클램프를 분리, 제거 판 기구에서 신중 하 게, 주걱으로 한쪽을 따라 금이 낸된 유리 접시를 분리 하 고 다른 유리 접시에 부착 된 젤 남아 바인딩 silane로 입힌 다는 것을 확인.</li>
	<li>DH2O 900 mL에 NaOH의 10 g을 용 해 하 여 AgNO3 dH2O. 준비 1 L 신선한 개발 솔루션의 1 리터에서 1.5 g을 용 해 하 여 신선한 임신 솔루션의 1 리터, 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 dH2o.를 사용 하 여 1 L의 최종 볼륨을 조정 하 고 참고: 장갑을 착용 하 고 위의 화학 물질 및 주의 솔루션을 처리 합니다. 솔루션 및 해당 솔루션 단계 어둠 속에서 유지 하는 필요는 없습니다.</li>
	<li>신중 하 게 충분 한 dH2O 전기 이동 법 버퍼 제거 다음 접시 젤 플라스틱 쟁반에 향하도록 놓고 잠수함 침 솔루션의 1 리터에 젤 젤과 유리 접시를 헹 구 십시오. 통에 트레이 넣어.</li>
	<li>트레이 부드럽게 흔들어 분 60 r/3-4 분. 참고: 젤 두께 임신 솔루션에서 실버 질산염의 농도 따라 조정할 수 있습니다 시간을 떨고.</li>
	<li>임신 솔루션에서 격판덮개를 이동 하 고 다른 쟁반에 그것을 넣어. 접시와 두 번 3-5 s에 대 한 충분 한 dH2O를 사용 하 여 젤의 표면에서 떨어져 잔여 임신 솔루션 린스.</li>
	<li>다른 트레이에 향하도록 젤 접시를 놓고, 접시 개발 솔루션의 1 리터에 잠수함 그리고 50 r/분 ~ 3 분 DNA의 모양을 조각 하는 모니터에 대 한 트레이 부드럽게 흔들어 때 DNA의 신호의 높은 비율 조각 개발을 중지 배경 잡음을 관찰 (이 단계는 3 분 소요).</li>
	<li>두 번, 접시와 충분 한 dH2O 젤을 헹 구 고 건조 한 티슈 페이퍼와 젤 접시.</li>
	<li>적절 한 스캐너를 사용 하 여 젤 스캔. 300 dpi의 해상도 DNA 파편의 명확한 시각화를 제공합니다. 또한 카메라를 사용 하는 젤에 촬영 수 있습니다.</li>
	<li>SSR 마커 밴딩 패턴 기반 이미지에 DNA 파편에 득점 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genic+microsatellite+markers+in+plants:+features+and+applications.">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li><li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., N&#243;ia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers:+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+(Myrtaceae).">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li><li>Bassam, B. J., Caetano-Anoll&#233;s, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li><li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels.">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li><li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels.">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li><li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels.">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, 915-919 (1994).</li><li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li><li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment.">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li><li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels.">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li><li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

임신 후 젤의 세척은 중요 한 단계 이다. 부족 세척 시간 및 물 볼륨 접시와 젤의 표면에 침 솔루션의 불완전 한 제거 발생 하 고 어두운 배경에서 발생할 수 있습니다. 적절 한 개발에 또 다른 핵심 단계 이다,-개발 DNA 파편의 낮은 콘트라스트 이미지와 함께 어두운 갈색 배경에서 발생할 수 있습니다. 또한, 임신 단계 DNA 파편의 착 효율을 크게 영향을 줍니다. 임신 시간 5 분 이상 확장 또는 증가 임...

PCR 기반 마커의 개발 식물 유전학 및 번 식1의 과학을 혁명을 했다. 간단한 순서 반복 (SSR) 마커는 가장 일반적으로 사용 되 고 가장 다재 다능 한 DNA 마커 중입니다. 그들의 게놈을 광범위 한 범위, 풍부, 게놈 특이성 및 반복성 heterozygous genotypes2의 검출에 대 한 그들의 codominant 상속 뿐만 아니라 SSR 마커의 장점 중 일부입니다. 여러 연구 결과 유전적 다양성 조사, 가계를 추적, 유전 결합 지도, 구성 및 경제적으로 중요 한 특성3,4에 대 한 유전자 지도를 SSR 마커를 사용 했습니다.
SSR 마커의 PCR 제품 agarose 또는 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 및 다음 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 후 또는 UV 빛은 얼룩과 시각에 일반적으로 구분 됩니다. Polyacrylamide 젤에서 DNA 파편의 얼룩은 다른 착 색 방법5,6 보다 더 민감한 이며 SSR 마커7같은 DNA 파편을 검출 하기 위하여 널리 이용 되는.
많은 생물학 실험실 기술 처럼 polyacrylamide 젤의 얼룩은 꾸준히 그것의 처음 보고 되 고 19798조각 시각화 기술로 개선 했다. 기술은 처음 Bassam 외. 여 DNA 파편의 탐지에 대 한 수정 6 1991 년에 1994 년에 Sanguinetti와 동료9 을 향상. 메서드는 더는 지난 몇 년간6,7,9,10,11,12,13,14 에서 최적화 되었습니다. , 그러나 15., 프로토콜의 업데이트 된 버전의 대부분 아직도 이러한 프로토콜7의 응용 프로그램을 제한 하는 등 기술 수요 및 긴 처리 시간이 고정을 위한 장착6, 몇 가지 단점이 있다 11. DNA 조각 검출의 높은 효율성과 낮은 비용을 결합 하는 최적의 프로토콜은 생물학 연구에서 얼룩의 일상적인 응용 프로그램 긴급 하 게 필요 합니다.
또한, polyacrylamide 젤 변성 및 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤으로 분할 될 수 있다 그리고 둘 다 SSR 마커 얼룩 방법 실버를 사용 하 여 검색에 사용할 수 있습니다. 효과 해상도는 크게 차이가 없습니다, 하지만 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 프로세스를 쉽게 하 고 적은 시간16.
이전 연구15기준 현재 연구의 목표는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 SSR 마커, 쉽고 빠르고 저렴 한 비용 검색 상세에서 프로토콜을 얼룩이 지는 최적화 된 실버를 설명 하기 위해입니다.

<table><tbody><tr><td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 DNA marker</td><td>Takara Bio Inc., Japan</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylene-bis-acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silane</td><td>Solarbio Beijing, China</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td><td>#7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome black T(EBT)</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tray</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TS-1 Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>BenQ M800 Scanner</td><td>BenQ, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C Power supply</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td><td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

간단한 순서 반복 (SSR) 식물과 동물 유전자 연구 및 분자 breeding 프로그램에서 사용 하는 가장 효과적인 마커 중 하나입니다. 실버 얼룩 polyacrylamide 젤에 SSR 마커 검출에 대 한 널리 사용 되는 방법입니다. 그러나, 실버 얼룩에 대 한 전통적인 프로토콜은 기술적으로 요구 하 고 시간이 많이 걸리는. 다른 많은 생물학 실험실 처럼 기법, 프로토콜을 얼룩이 지 실버는 검출 효율 향상을 위해 꾸준히 최적화 되었습니다. 여기, 우리 보고 단순화 된 실버 얼룩 메서드를 크게 시 약 비용 감지 해상도 사진 선명도 향상 시킵니다. 새로운 메서드는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 대 한 두 가지 주요 단계 (임신 및 개발) 및 3 개의 시 약 (실버 질산염, 수산화 나트륨, 그리고 포름알데히드), 그리고 처리의 불과 7 분을 필요합니다. 이전에 보고 된 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 쉽습니다, 빨리 그리고 SSR 탐지에 대 한 더 적은 화학 시 약을 사용 하 여. 따라서,이 간단 하 고, 낮은-비용, 고 효과적인 실버 프로토콜을 얼룩이 지는 유전 매핑 및 SSR 마커 데이터의 빠른 세대 번 식 마커 기반 도움이 됩니다.

PCR amplicons 꽃 배 추와 담배에 해당 SSR 뇌관 쌍을 사용 하 여 생산 되었다. 전기 이동 법, 후 polyacrylamide 젤 SSR 마커 (그림 1)의 밴딩 패턴을 명확 하 게 감지 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 위의 실버를 사용 하 여 얼룩이 있었다.
프로토콜을 얼룩이 지는 다른 실버의 검색 효율성 비교를 SSR 마커 담배와 꽃 배 ...

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A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

a-fast-silver-staining-protocol-enabling-simple-efficient-detection

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

10.7K 조회수.  Guangzhou University. 여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

비디오: A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

젤의 단백질 염색법

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

생물학

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

면역학 및 감염병학

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, respectively. As many gel-imaging techniques use nonspecific stains or expensive fluorophore probes, sensitive, discriminating, and economical gel-imaging methodologies are highly desirable. RNA Mango core sequences are small (19&#8211;22 nt) sequence motifs that, when closed by an arbitrary RNA stem, can be simply and inexpensively appended to an RNA of interest. These Mango tags bind with high affinity and specificity to a thiazole-orange fluorophore ligand called TO1-Biotin, which becomes thousands of times more fluorescent upon binding. Here we show that Mango I, II, III, and IV can be used to specifically image RNA in gels with high sensitivity. As little as 62.5 fmol of RNA in native gels and 125 fmol of RNA in denaturing gels can be detected by soaking gels in an imaging buffer containing potassium and 20 nM TO1-Biotin for 30 min. We demonstrate the specificity of the Mango-tagged system by imaging a Mango-tagged 6S bacterial RNA in the context of a complex mixture of total bacterial RNA.

Here we present a sensitive, rapid, and discriminating post-gel staining method to image RNAs tagged with RNA Mango aptamers I, II, III, or IV, using either native or denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gels. After running standard PAGE gels, Mango-tagged RNA can be easily stained with TO1-Biotin and then analyzed using commonly available fluorescence readers.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Source: Sultana, S. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62628">Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor</a>. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

Source: Sultana, S. et al. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Fluorescent Silver Staining: A Technique to Visualize Total Protein in Polyacrylamide Gels

After electrophoresis, submerge the gel in a 100-milliliter solution containing ethanol and acetic acid on an orbital shaker, and incubate twice for 30 minutes each, at room temperature while shaking at 50 RPM. Next, wash the gel three times with ultrapure water in a clean container, with each wash lasting 10 minutes.
First, dissolve 0.01 grams of silver nitrate in 10 milliliters of ultrapure water to prepare a stock solution with a concentration of 0.1%. Add 100 microliters of this stock solution into 100 milliliters of ultrapure water to make the silver nitrate working solution. In a fume hood, submerge the gel in 100 milliliters of the silver nitrate working solution in a sealed glass chamber.
Use aluminum foil to protect the gel from light during impregnation, and incubate for 1 hour while shaking at 50 RPM on an orbital shaker. After this, wash the gel twice with ultrapure water in a clean container, with each wash using approximately 100 milliliters of water and lasting 60 seconds.
It is important to use ultrapure water to clean the gel after the silver impregnation step to minimize background staining.
First, add 50 milliliters of ultrapure water to 3 milligrams of TPE-4TA dye. Sonicate the solution for 3 minutes, and add 5 microliters of 1 molar sodium hydroxide solution in between each sonication session, to help dissolve the dye, usually up to three times. Then, check the fluorescence of the solution under a 365-nanometer UV lamp to ensure that the dye is fully dissolved. Only weak or non-emissive solutions indicate full dissolution.
To prepare the fluorogenic developing solution, add 10 milliliters of the TPE-4TA stock solution to 90 milliliters of ultrapure water. Use a pH meter to check the pH of the solution. Tune the solution to a pH between 7 and 9, using diluted sodium hydroxide solution or acetic acid, if the pH is out of range.
Next, transfer the gel to a clean and sealable container with 100 milliliters of the fluorogenic developing solution, and ensure that the gel is completely immersed. Seal the container, and cover it to protect it from light. Shake the container overnight on an orbital shaker at 50 RPM and at room temperature.
Transfer the gel to a clean container, and de-stain it in 100 milliliters of 10% ethanol for 30 minutes. Then, rinse the gel in ultrapure water for 5 minutes. The gel can be visualized on a benchtop trans-illuminator, or imaged on a gel documentation machine at the 365-nanometer channel or the 302-nanometer channel.