Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
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이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 "형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 "문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.

1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대
<ol><li>
C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO2, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
	<ol>
<li>셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 104 C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.</li>
		<li>Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.</li>
		<li>Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.</li>
		<li>문화 매체 100 mg/mL hygromycin 보충 transfected 세포에 대 한 문화 매체를 교환 합니다.</li>
		<li>3 일 취소 transfected 세포를 제거 하기 위한 문화 셀. 참고 중간 변경 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trypsinize transfected 세포 고 정화 선택을 위해 형광 단백질을 표현 하는 세포의 인구. 수신기 세포 pAI177를 들고, 그린 PE 채널 mCherry-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다. 사진에 민감한 보낸 셀 pAI218 운반, 송출 채널 iRFP713-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 표준 메서드를 제한 희석 또는 단일 셀 FACS에 의해 정렬 하 여 클론 세포 인구를 구축.</li>
</ol>2. 사진-감도 인구 수준에서 설계 된 셀의 평가
참고:이 부분에서는 생 화 확 적인 분석 실험, 정량 등 서양 blotting에 의해 블루 빛 조명에 따라 Dll1 ligand 단백질의 동적 유도 확인 하려면 프로토콜을 설명 합니다.
<ol><li>각각 두 가지 유형의 광원 없이 incubators 빛 유도 조건 또는 어두운 상태에 대 한 설정. 설치는 파란 LED 트랜스-조명 기, 그림 1B와 같이 노출 계를 사용 하 여의 빛 강도. 프로그램 타이밍 및 조명 (그림 1C)에 대 한 프로그래밍 가능한 일정 수를 단일 보드 마이크로-컨트롤러 제어 스크립트를 로드 하 여 빛 조명 기간</li>
	<li>셀 카운터 trypsinized 셀과 판 1.0 x 105 사진-민감한 보낸 셀 pAI218과 pAI170 35 m m 직경 플라스틱 문화 요리 (빛 조건에 대 한 이상 12 요리와 어두운 조건에 대 한 1 접시)에 고 요리를 설정 어둠/빛의 조건에 대 한 incubators 구분 합니다. 요리를 설정한 후 세포 lysates 수집까지 산부인과의 문을 유지.</li>
	<li>도금, 후 하나 30 일 시작 빛 조명 (셀 80% 이상이 될 것으로 예상 된다 confluent). 셀을 바람직하지 않은 사진-자극을 피하기 위해 빛을 노출 하지 마십시오. 참고: 일정 조명에 대 한 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 지속적인된 조명 조건 (예. 1-분 기간 및 10 분 간격으로 40 µ / m2/s 빛 강도) 사진-유도, 그리고 그 강한 빛 조명에 대 한 간단한 검사는 셀에 대 한 충분 한가. 따라서, 조명에 대 한 무해 매개 변수 선택 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>도금, 후에 2 일 약 30 분 간격으로 세포 lysate 준비. 얼음, 그리고 세포 lysates 추가 분석을 위해 준비 시작을 인큐베이터에서 샘플 요리를 이동 합니다.</li>
</ol>3. 인구 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: PMT에 의해 광 자극에 세포질 응답의 실시간 모니터링
<ol><li>Trypsinize 및 발신자와 수신기 셀의 숫자 표준 방법. 혼합 104 수신기와 1.25 x 10 x 2.5의5 보낸 셀 (1:5 비율)의 1 mL 전체 볼륨을 준비 합니다. 참고: 2:1, 1:1 또는 1:2 보낸 사람 수신기 비율 또한 작동 1.5 x 10의 전체 휴대폰 번호5. 10
</li>
	<li>플레이트 1 m m의 소를 포함 하는 문화 매체와 셀에 24-잘 블랙 플레이트의 각 잘 혼합.</li>
	<li>플레이트 리더 luciferase 분석 결과 대 한 셀을 분석 하 고 출력 신호 기록 시스템에 대 한 너무 높은 되는지 확인. 참고: 출력 신호 1 x 106 광자 수/s 보다 더 높은 경우에, 그들은 수 수 포화. 이 경우, 출력 신호는 1 x 106 광자 수/s 보다 낮은 최적의 값으로 소의 농도 줄일.</li>
	<li>기록 시스템에 접시를 설정 하 고 녹음 프로그램 (그림 1D) 시작. 예를 들어 녹음 후 18 h에서 빛 조명을 시작 합니다. 참고: 임시 필터링와 같은 이동 평균 및 Savitzky Golay 필터링, 신호 트렌딩 웨이브 폼의 시각화를 위한 유용 피크 탐지.</li>
</ol>4. 단일 셀 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: 실시간 Optogenetic 섭 동 통제 단일 세포 응답의 이미징
<ol><li>플레이트 0.5 x 105 수신기 그리고 2.5 x 27 mm 직경 유리 베이스 35 m m 직경 요리에 105 보낸 사람 세포. 그 혼합 비율 및 총 세포 수 (셀 밀도) 올바르게 조정 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>도금, 후에 1 일 교환 기록 매체의 2 mL와 매체 (페 놀 레드 무료 DMEM 매체 보충 5 %FBS, 페니실린-스와 1mm 소), 현미경에 유리-기본 요리를 설정. 필요한 경우, PBS (-)와 죽은 세포의 파편 세척 한다. 참고: 그것은 어두운 상태에서이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2환경 챔버를 장착 한 거꾸로 한 현미경을 설정 합니다.</li>
	<li>냉각된 CCD 카메라를 설정 합니다. 대상 값 (일반적으로-90 ° C) CCD 센서의 온도 아래로 냉각은 확인 하십시오.</li>
	<li>
5 분 간격으로 이미지와 보다 더 288를 자동 수집 소프트웨어에 "다차원 Timelapse" 창에 대 한 매개 변수 설정 (하나 이상의 야간 녹화) 시간.
	<ol>
<li>"다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 발광 채널 및 느린 50 kHz 읽기 모드를 선택 하 고 4 × 4 4 민 노출 binning 설정. 읽기 모드 읽어 소리를 약하게 발광 발광 빛을 감지를 줄이기 위한 중요 한 느린 50 kHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>"다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 형광 채널 및 고속 1mhz 읽기 모드를 선택 하 고 2 x 2 400 ms 노출 binning 설정. 읽기 모드 형광 영상에 필요한 시간을 줄이기 위해 빠른 1 MHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>시간 경과 "취득" 버튼을 클릭 하 여 녹음 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음과 같이 이미지 분석 소프트웨어, 시간 경과 영화에서 발광 채널의 단일 셀 자취를 추출 합니다. 먼저, 이미지 분석 소프트웨어를 이미지 데이터를 가져와서 발광 및 형광 스택 이미지를 확인 합니다. 발광 이미지에 대 한 ("SpikeNoise 필터"로 구현), 이전 및 다음 프레임의 시간 평균을 픽셀 값으로 바꿔 일시적으로 인접 한 이미지에서 픽셀의 농도 비교 하 여 우주선에서 파생 된 핫 픽셀 제거 이러한 처리 이미지 공간 스무 딩 필터를 적용 하 고 각 프레임에서 out-field 뷰의 배경 픽셀 값을 뺍니다. 그런 다음, "관심 영역"을 결정 (투자 수익) 각 시간 지점에서 형광 이미지에 각 셀에 대 한 투자 수익 발광 이미지를 적용 하 고 각 투자 수익의 발광 강도 측정.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단?...

셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.
광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.
최근 포유류 세포10제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT device</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Blue LED illuminator</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td><td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Potassium Salt</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Light meter</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA-Peroxidase antibody</td><td>Roche</td><td>clone 3F10</td><td></td></tr><tr><td>anti-Actin-Peroxidase antibody</td><td>Wako</td><td>clone 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.

우리는 LightOn 시스템11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스...

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An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K 조회수.  Kyoto University. 여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

연구

신경과학

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

발생학

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate light-gated ion channels and pumps in neurons. While this bioluminescent optogenetics (BL-OG) approach confers a chemogenetic component to optogenetic tools, it is not limited to use in neuroscience. Rather, bioluminescence can be harnessed to activate any photosensory protein, thus enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells. A variety of luciferase-luciferin pairs can be matched with photosensory proteins requiring different wavelengths of light and light intensities.
Depending on the specific application, efficient light delivery can be achieved by using luciferase-photoreceptor fusion proteins or by simple co-transfection. Photosensory proteins based on light-dependent dimerization or conformational changes can be driven by bioluminescence to effect cellular processes from protein localization, regulation of intracellular signaling pathways to transcription. The protocol below details the experimental execution of bioluminescence activation in cells and organisms and describes the results using bioluminescence-driven recombinases and transcription factors. The protocol provides investigators with the basic procedures for carrying out bioluminescent optogenetics in vitro and in vivo. The described approaches can be further extended and individualized to a multitude of different experimental paradigms.

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence-light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small-molecule substrate, a luciferin-can be harnessed to activate photosensory proteins, thereby adding another dimension to light stimulation and enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells across temporal and spatial scales.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

생화학

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

생체공학

제브라피시에서 광유전학적 신호전달 조작을 이용한 개발 조사

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

저자 스포트라이트: 세포 운명 결정을 해독하기 위해 제브라피시 배아의 신호 전달 조작 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

요약

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이 비디오의 챕터

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

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포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

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