Name: nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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이 작업은 GM055279, CA116034 및 CA163489에 의해 투자 되었다.

1. 버퍼 및 장비 준비 <ol><li>4 45 셀 중단 폭탄, 15 mL 튜브, 및 ultracentrifugation 튜브를 진정 ° c.</li>
	<li>준비 25 mL 당 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 2 x 10 7 셀 균질 버퍼의 진정 하 고. 
	참고: 더 나은 NaCl 반영 세포내 소금 성분 보다는 오히려 균질 버퍼는 일반적으로 KCl를 포함. PH 7.4, 10mm KCl와 1.5 m m MgCl 2 (이 하 소형 균질 버퍼 라고도 함)에서 10 mM HEPES이이 프로토콜에 사용 되는 균질 버퍼에 의하여 이루어져 있다. 대부분 버퍼 질소 현상에 대 한 적용할 수 있습니다 (내용 참조).</li>
	<li>준비 6 mL 당 4 ° C. 추가 protease 억제제 정제 사용 하기 전에 신선한에 샘플 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 버퍼 x 1의 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 PBS 버퍼 pH 7.4, 1.8 m m KH 2 포 4, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM에서 10 mM 나 2 HPO 4 이루어져 있다.</li>
	<li>준비 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 샘플 당 가용 화 버퍼의 4 mL를 진정 하 고. 
	참고:이 프로토콜에 사용 되는 가용 화 버퍼는 1 x Radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 %SDS, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 1%에서 25 mM Tris 이루어져 있는 NP-40. 4.6를 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 수확을 셀 셀 형식에 대 한 <ol>10 9 조직 문화 셀 권장된 x <li>성장 2 x 10 7-10 문화 미디어. 일반적으로, 한 15 cm 접시 수익률 2 x 10 7 HEK 293 세포 90 %confluency ( 그림 1)에서 DMEM에 교양.</li>
	<li>진공에 의해 성장 매체를 제거.</li>
	<li>부착 셀 문화 요리에 얼음, 냉장된 균질 버퍼 두 번 (15 cm 접시 세척 당 당 10 mL 버퍼)으로 부드럽게 문화 요리에 직접 세포를 씻어 놓고 셀의 적절 한 볼륨에 큰 셀 스 크레이 퍼와 수확 균질 버퍼; 현 탁 액 셀에 대 한 수집 및 냉장된 균질 버퍼에 두 번 (10 mL 버퍼 세척 당 50 mL 문화 당) 5 분, 4 ° C에서 500 x g 스핀과 셀 펠 릿을 세척 하 고 얼음에 균질 버퍼의 적절 한 볼륨에 씻어 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 볼륨 셀 중단 폭탄에 허용 최소/최대 볼륨으로 의도 된 실험에서 단백질 농도 대 한 요구 사항에 기반 해야 합니다. 일반적인 지침 2-10 배 10 7 셀/mL, 또는 세포의 약 10 볼륨 작은. 이 프로토콜은 균질 버퍼의 2 ml에서 HEK 293 세포의 3-15cm 요리에 대 한 최적화.</li>
</ol> 3. 질소 공동 현상은 <ol><li>전송 셀 서 스 펜 션 파문에 얼음 목욕에서 깨끗 하 고 냉장 폭탄 접시. 
	주의: 폭탄은 높은 압력, 낮은 온도, 질소 가스 &#8211; 착용 적절 한 개인 보호 .</li>
	<li>마이크로 자기 볶음 바 폭탄 안에 놓고 정지 동질성을 유지 하기 위해 저 어 접시에 설정.</li>
	<li>하나 protease 억제제 태블릿 정지를 추가 하 고 제조 업체 당 폭탄을 닫습니다 &#39; s 지시.</li>
	<li>점차 압력 제조 업체 당 질소 가스 탱크와 폭탄 &#39; 폭탄 압력 게이지까지 s 명령 300 ~ 600 psi를 읽습니다. 모든 밸브를 닫고 질소 탱크 분리. 
	참고: 필요한 압력 셀 유형으로 달라질 수 있습니다. 여기 우리는 HEK 293, NIH-3T3과 Jurkat 세포에 대 한 350 ~ 400 psi에서 현상 수행.</li>
	<li>질소 분해 하 여 셀 내에서 평형에 도달 수 있도록 20 분 기다립니다.</li>
	<li>피복 수건을 사용 하 여 배출 밸브 주위 초과 물을 제거 합니다. Homogenate의 dropwise 릴리스를 달성 하 고 미리 냉장된 15 mL 튜브에 수집을 부드럽게 배출 밸브를 엽니다. 
	참고: 컬렉션의 끝에 근처 거기 homogenate의 분출 되며 가스 쉿 소리와 함께 나타날 것입니다. 가스 하지 않습니다 있는지 확인 이전 수집 원인은 튜브 촬영 cavitate (따라서 15 mL를 사용 하 여 튜브 1.5 mL 튜브 대신). 일단은 기 시작, 배출 밸브 닫고 갑자기 하 폭탄 depressurize 폭탄에 나머지 셀의 현상 질소 유입 밸브를 엽니다. 오픈에 대 한 폭탄 cavitate 복구 및 철저 한 청소. 
	참고: 마지막 cavitate 거품과 밀키 모양 위에 있어야 한다. 원심 분리 전에 가시고 거품 수 있도록 피 펫 팁으로 부드럽게 저 어. 
	참고: 단계 대조 현미경 검사 법 균질 효율을 결정 하 여는 cavitate를 검사 합니다. 15 µ L 드롭 추가 cavitate 현미경 슬라이드와 커버는 coverslip의 표면에. 반복 단계 3.4-3.6 너무 많은 경우에 손상 되지 않은 세포는 20 X 목표 발견. 
	참고: 균질 버퍼는 EDTA 또는 EGTA를 포함 하지 않으면, 그것에 추가 수집 된 후 5 분 이내 1 m m의 최종 농도에 cavitate.</li>
</ol> 4. Cytosolic와 막 분수 분리 손상 되지 않은 세포와 핵 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안 <ol><li>분리기 500 x cavitate g. 
	참고: 없음 보이는 펠 릿 생산 원심 분리 단계를 반복 하 고 위에 떠 있는 거품을 피하 면 서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집 합니다. 필요한 경우 추가 수집 PNS, 결합 하는 거품을 다시 원심 ( 그림 1).</li>
	<li>관심의 분수를 원하는 대로 PNS를 처리 합니다. Cytosolic 분리 하 고 막 분수, 목적 ultracentrifuge 튜브에 PNS를 전송 하 고 원하는 대로 ultracentrifugation를 수행 합니다. 이 프로토콜에 대 한 최적화는 &#60; 3.5 mL 샘플 폴 리카 보 네이트 ultracentrifuge 튜브에서 및 ultracentrifugation 350000 x g 1 h 4에 대 한에 대 한 ° C.</li>
	<li>상쾌한 (S 분수) 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수집.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 차가운 PBS의 3 mL와 펠 릿을 씻어. 진공으로 PBS를 제거. 
	참고: cytosolic 단백질에 의해 막 분수의 오염 샘플의 손실 보다 더 큰 관심사 인 경우에, 3 ml PBS 춥고 단계 4.2에서 다시 ultracentrifuge의 펠 릿을 resuspend. 진공으로 PBS를 제거.</li>
	<li>선택의 가용 화 버퍼 세제를 포함 하는 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 완벽 하 게 resuspend. 셀 등가 달성 하기 위해 사용 하 여 가용 화 버퍼의 동일한 볼륨 cytosolic 분수. 
	참고: 효율적인 막 단백질 추출에 대 한 가용 화 버퍼 1 x RIPA 버퍼를 사용 하 여 것이 좋습니다. 없음 다운스트림 분석 결과 막 일부분에 대 한 필요한 경우, 1 x laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 최대한 막 단백질 추출에 대 한. 
	참고: 좋습니다 dislodging 하 고 최대한 막 단백질 추출에 대 한 4 ° C에서 튜브 회전자에 깨끗 한 튜브를 가용 화 버퍼에 펠 릿을 전송. 
	참고: 펠 릿은 너무 끈 적 (너무 많은 지질) 일에서 효율적으로 제거 하는 경우가용 화 버퍼에서 e ultracentrifuge 튜브, 좋습니다 스냅 액체 질소에는 펠 릿을 동결 하 고 펠 릿 녹아서 전에 미니 금속 주걱으로 신속 하 게 ultracentrifuge 튜브에서 펠 릿을 dislodging. 
	참고: 또는, 막 펠 릿 그냥 resuspended 고 막 소포 서 스 펜 션, 어떤 경우는 원심 4.6 단계 필요 하지 않습니다 P 일부 생산 세제 포함 된 버퍼에 solubilized 하지. 이러한 P 분수는 막 협회에 의존 하는 효소 활동 등의 기능을 조사 하는 경우에 유용.</li>
	<li>4 시 10 분에 대 한 탁상 원심 분리기에 20000 x g에서 4.5 단계에서 완전히 solubilized 펠 릿 정지 원심 ° C. 상쾌한 1 mL 피 펫 (P 분수)를 사용 하 여 수집 하 고 펠 릿 (불용 성 지질) 삭제.</li>
	<li>Cytosolic 또는 막 분수와 서 부 럽 등 원하는 분석을 수행 하거나 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. 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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기계 장애의 다른 방법을 통해 질소 현상의 장점은 매니폴드입니다. 아마도 가장 중요 한 장점은 부드럽게 아직 효율적으로 균질 표본 하는 기능입니다. 생성 지역 난방 손상 대신 압축 냉각 샘플의 원리는 초음파 좋아하고 기술을 기반으로 마찰/전단. 공동 현상 또한 원형질 막 방해에 매우 효과적입니다. 질소 거품 감압, 현상 프로세스에 따라 각 개별 셀 내에서 생성 되는 제한 때문에 셀 크기에...

세포질 단백질 2 개의 종류로 분할 될 수 있다: 막과 하지 않은 그와 관련 된 그. 비 막 관련된 단백질 cytosol, nucleoplasm 및 바인딩과 그물 (ER) 같은 세포의 루미나에서 발견 된다. 두 가지 수준의 막 관련 단백질, 정수 및 주변을 확인 하 고 있습니다. Polypeptide 체인의 하나 이상의 세그먼트 걸쳐 멤브레인, 소수 성 아미노산의 구성 하는 α-나선으로 일반적으로 있기 때문에 완전 한 막 단백질은 막 횡단 단백질 라고도. 막 횡단 단백질 co-translationally 그들의 생 합성 과정에서 세포 막에 삽입 되 고 그래서 구성 된 catabolized는 그들이 때까지 남아. 주변 막 단백질 이차 세포 막 지질 같은 소수 성 분자와 포스트 번역 상 수정 때문에 일반적으로 구동 됩니다. 달리 완전 한 막 단백질, 세포 막의 주변 막 단백질 연관 가역 이며 통제 될 수 있다. 신호 경로, 그리고 멤브레인과 규제 협회에 많은 주변 막 단백질 기능 활성화 하거나 억제 하는 통로 대 한 메커니즘 중 하나입니다. 주변 막 단백질은 신호 분자의 한 예로 작은 GTPase RAS입니다. 포스트 번역 상 수정 수정 farnesyl 지질을 포함 하는 시리즈, 후 성숙한 RAS 단백질의 수정된 C-말단 세포 막의 세포질 전단지에 삽입 합니다. 특히, 플라즈마 멤브레인 RAS의 다운스트림 이펙터 RAF1를 종사 하는 곳입니다. 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로의 구성 적인 활성화를 방지 하기 위해 여러 수준의 RAS의 제어 장소에 있습니다. GDP를 GTP를 hydrolyzing에 의해 RAS 비활성 렌더링, 게다가 활성 RAS 또한 수 나올 원형질 막에서 수정 또는 solubilizing 신호를 억제 하는 요소와의 상호 작용. 막 협회의 평가 하는 중요 한 필요 남아 있지만 형광 라이브 영상 극 세포 생물학 형광 단백질 태그 주변 막 단백질1의 subcellular 지 방화를 관찰할 수 있는 기회, 간단한 생 화 확 적인 접근으로 세미 양적 생 단백질입니다.
단백질 막과 수용 성 분수 사이 분할의 적절 한 생 화 학적 평가 비판적으로 두 가지 요소에 따라: 세포 균질 및 효율적인 분리 막과 수용 성 분수. 가장 널리 상용화 키트를 포함 하 여 일부 프로토콜 세제 기반 셀 균질에 있지만, 이러한 메서드는 분석 난독 하 처리할 용 해 단계2로 막 단백질을 추출 하 여 수 있습니다. 따라서, 세포 파쇄의 세제 비 기반으로, 기계적 방법 청소기 결과 제공합니다. 셀 문화에서 성장 또는 혈액 이나 장기에서 수확의 기계적 장애의 여러 가지 방법이 있다. Dounce 균질, 정밀한 바늘, 볼 베어링 균질, 쥡니다 있으며 질소 현상 포함 됩니다. 여기 우리가 질소 현상 평가 하 고 다른 방법에 그것을 비교. 질소 공동 현상은 높은 압력 하에서 세포의 세포질에 녹아 있는 질소에 의존 합니다. 평형, 후 세포 현 탁 액 질소 거품 때문에 그들의 비등 셀 열고 눈물 세포질에 형성 되는 등 갑자기 대기압에 노출 됩니다. 압력이 충분히 높은 경우 질소 비등 수 핵3 고 막 바인딩된 세포 리소좀4처럼 됩니다. 그러나, 압력은 충분히 낮게 유지 되는 경우 감압 원형질 막 및 응급실만 하지 다른 organelles, 그로 인하여 cavitate5지정 된 homogenate에 cytosol와 그대로 세포질 세포를 흘리 고 중단 됩니다. 이러한 이유로, 질소 현상 리소좀과 미토 콘 드리 아와 같은 세포를 고립 시키기를 위한 선택의 방법입니다.
그러나, 막과 수용 성 부분으로 쉽게 분리 될 수 있다 homogenate를 준비 하는 훌륭한 방법 이기도 합니다. 탱크 그리고 가변 배출 밸브와 출구 포트에서 질소 가스의 배달에 대 한 입구와 높은 압력을 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스 케이싱 압력 용기 (이제부터 "폭탄"에 게 불리는) 공동 현상 동안에 사용에 의하여 이루어져 있다.
질소 공동 현상은 1960 년대6이후 셀 균질에 대 한 사용 되었습니다. 1961 년, 사냥꾼 및 Commerfold7 포유류 조직 장애에 대 한 실행 가능한 옵션으로 질소 공동 현상은 설립. 그 이후, 연구원은 다양 한 세포와 성공, 조직에 기술을 적응 및 질소 현상 막 준비8,9, 핵과 세포 기관이 포함 하 여 여러 응용 프로그램에서 고정 되고있다 준비10,11, 그리고 불안정 생화학 추출. 현재, 세포 생물학 더 자주 다른 방법을 채택 셀 균질 질소 균질의 장점을 널리 광고 되지 있다, 질소 폭탄 비싼 이며 셀의 비교적 큰 숫자는 오해 때문에 필수. 그대로 핵과 세포-무료 homogenates를 달성 하기 위해 질소 현상에 대 한 프로토콜 게시 되지 않은, 그리고 가장 게시 된 평가에서 볼륨 세포 현 탁 액의 20 mL의 사용 되었다. 이 고전적인 기법 소규모 샘플 작업의 현재 요구 사항에 맞게 적응 하 선물이 질소 공동 현상은 특별히 배양된 세포의 수정 된 프로토콜. 질소 공동 현상은, 후는 homogenate로 분리 된다 성 (S)와 막 (P) 분수 차등 원심 분리에 의해 먼저 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 저속 회전 급강하 그리고 고속 스핀 (&#62; 100000 x g) 분리 녹는 분수에서 막입니다. 우리 immunoblots는 분리의 효율을 분석 하 고 다른 기계적 장애 기술로 질소 현상 비교. 우리는 또한 질소 현상 중 균질 버퍼의 삼 투 효과 조사.

<table><tbody><tr><td>Cell Disruption Vessel (45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>Nitrogen cavitation Bomb</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Dounce pestle and tube</td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe 28G&amp;frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Atg12 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tubulin antibody</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td></tr><tr><td>Calnexin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Calregulin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Catalase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>CIMPR antibody</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>EEA1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>EGFR antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;0&lt;/sub&gt;-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>F&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;-ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Fibrillarin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>374022</td><td>Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td></tr><tr><td>Golgin 97 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>HDAC1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Hexokinase 1 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2024S</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Lamin A/C antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>376248</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>LAMP1 antibody</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;/K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; ATPase antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Rab7 antibody</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Rab9 antibody</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>RCAS1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>RhoGDI antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Sec61a antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td></tr><tr><td>Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Sample tube for ultracentrifugation</td></tr><tr><td>TLK-100.3 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>rotor for ultracentrifugation</td></tr><tr><td>Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td>ultracentrifuge</td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>protease inhibitors</td></tr><tr><td>Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>large cell scraper</td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>micro stir bar</td></tr><tr><td>Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td>magnetic stirrer</td></tr></tbody></table>

nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

배양된 세포는 주변 막 단백질을 포함 한 단백질의 subcellular 분포를 공부 하는 데 유용. 유전자 붙일 인코딩 태그 단백질 subcellular 단백질 분포의 연구를 혁명 있다. 그러나, 특히 단백질 부분적으로 cytosolic 때 형광 현미경 검사 법, 함께 분포를 계량 하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 종종 내 생 단백질을 공부 하는 것이 중요입니다. 생화학 분석기 immunoblots 단백질 subcellular 분류 후 배포의 정량화에 대 한 황금 표준 남아 같은 분석 실험. Cytosolic 또는 특정 막 분수를 분리 하는 것을 목표로 상업 키트는,이 키트의 대부분 주변 막 단백질 세포 막에서 쉽게 추출 되는 공부에 적합 수 있는 세제와 추출 기반. 여기 우리 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 의해 세포 균질에 대 한 세제 무료 프로토콜 제시. 우리 다른 세포 유형, 전체에 녹는 subcellular 세포의 분리 및 펠 릿 분수를 확인 하 고 몇 가지 일반적인 세제 기반이 아닌 기계적 균질 방법 중에서 단백질 추출 비교. 질소의 여러 장점 가운데 현상 섬세 한 세포에 최소한의 물리적, 화학적 손상 세포 장애의 뛰어난 효율성입니다. Ultracentrifugation와 결합, 질소 현상입니다 cytosolic 사이 주변 막 단백질의 변화를 검사 하는 훌륭한 방법 막 분수.

그림 2 는 녹는 cytosolic 분수 (S) 또는 막 펠 릿 분수 (P) PNS에서 세포질 단백질의 분할을 보여 줍니다. 우리는 다른 종류에서 3 개의 대표적인 셀 라인 검사: HEK 293 (상피), NIH-3T3 (fibroblast) 및 Jurkat (림프 구). 로 구 아닌 분리 억제 물 (RhoGDI) 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CIMPR)에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다 cytosolic 막 분수, 각각. ?...

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Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.0K 조회수.  New York University. 여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

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Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

연구

생화학

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

생체공학

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

신경과학

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral budding, among other vital cellular processes. For efficient biological activity, cell membranes should be rigid enough to maintain the integrity of the cell and its compartments yet fluid enough to allow membrane components, such as proteins and functional domains, to diffuse and interact. This delicate balance of elastic and fluid membrane properties, and their impact on biological function, necessitate a better understanding of collective membrane dynamics over mesoscopic length and time scales of key biological processes, e.g., membrane deformations and protein binding events. Among the techniques that can effectively probe this dynamic range is neutron spin echo (NSE) spectroscopy. Combined with deuterium labeling, NSE can be used to directly access bending and thickness fluctuations as well as mesoscopic dynamics of select membrane features. This paper provides a brief description of the NSE technique and outlines the procedures for performing NSE experiments on liposomal membranes, including details of sample preparation and deuteration schemes, along with instructions for data collection and reduction. The paper also introduces data analysis methods used to extract key membrane parameters, such as the bending rigidity modulus, area compressibility modulus, and in-plane viscosity. To illustrate the biological importance of NSE studies, select examples of membrane phenomena probed by NSE are discussed, namely, the effect of additives on membrane bending rigidity, the impact of domain formation on membrane fluctuations, and the dynamic signature of membrane-protein interactions.

This paper describes the protocols for sample preparation, data reduction, and data analysis in neutron spin echo (NSE) studies of lipid membranes. Judicious deuterium labeling of lipids enables access to different membrane dynamics on mesoscopic length and time scales, over which vital biological processes occur.

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

생물학

Microbiota Multi-Omics를 위한 향상된 박테리아 세포외 소포체 분리

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

저자 스포트라이트: Accelerating Research on Bacterial Extracellular Vesicles Separation and Heterogeneity 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

요약

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고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

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형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

지질 막 역학 및 막 단백질 상호 작용을 위한 독특한 프로브로 중성자 스핀 에코 분광법

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

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