Name: isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering
Uploaded: 2017-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
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우리는 재닌 베커, 캐롤라인 비켈만와 루스 니클스의 우수한 기술 지원을 감사하고 있습니다. (- 독일 연구 재단 DFG) - LA 2682 / 7-1 본 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft의 연구비 지원을 받았다.

모든 절차는 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 및 제도적 지침 (Landesamt 대 Soziales, 어디 아퍼? 싶게 Verbraucherschutz,의 Abt. Lebensmittel- 싶게 Veterinärwesen, Zentralstelle, 자르브뤼켄, 독일)을 추적 관찰 하였다. 수술 도구 (1)의 제조 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 U / ㎖ 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 준비 절개 위 수술 집게, 소규모 제조 위 미세 겸자 15ml의 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM으로 무균 페트리 접시에 보관 ) 부고환 지방 패드를 수확합니다. </li><li> 5 분간 소독 용액에 노출 수술 도구. 대안 적으로, (증기 멸균을 121 ° C, 20 분)들을 소독. </li></ol> 2. 동물 및 마취 <ol><li> 연구 및 적응증으로 조심스럽게 쥐의 변형을 선택<html> 조사중인 될 수 있습니다. 참고 :이 연구에서 우리는 부고환 지방의 수확을위한 기증자로 남성 야생 형 C57BL / 6 마우스를 사용했다. 관심, 광고 MVF는 유전자 변형 녹색 형광 단백질 (GFP) 양성 기증자 동물 (C57BL / 6-Tg는 (CAG-EGFP) 1Osb / J) (22)로부터 분리 될 수있다. 이 단편은 GFP 음성 야생형 마우스 (14)에 주입 한 후 GFP의 면역 조직 화학 염색에 의해 쉽게 검출 할 수있는 큰 이점을 맺는다. </li><li> 자일 라진 (15 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (/ kg 75 mg)을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 동물 깊이 만 응답이 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. 기증자 동물은 지방 수확 후 희생으로 눈 윤활제는 표시되지 않습니다. 참고 : 진통 및 수술 불임이 실험을 계획하는 국가 및 기관의 각각의 가이드 라인과 일치 있는지 확인합니다. </li></ol>부고환 지방 패드의 제작 &quot;&gt; 3. 수확 <ol><li> 작업 테이블에 동물을 전송합니다. 수술 실체 현미경 하에서 앙와위에서 동물을 배치하고 발가락 핀치를 사용하여 깊은 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 용 드레이프에 테이핑하여 발을 고정 및 솔루션을 소독으로 복부를 소독. </li><li> 해부 가위로 기본 근육 층의 무료 복부 피부를 분리합니다. </li><li> 해부 가위 정중선 개복술을 수행하고 옆으로 복부 벽의 플랩을 전개. </li><li> 양측 고환, 부고환 및 미세 집게 (그림 1)를 사용하여 부고환 지방 패드를 식별합니다. 지방 패드의 분변 오염을 방지하기 위해 장 구조를 손상시키지 마십시오. </li><li> 실체 현미경 아래에있는 작은 준비 가위 및 미세 집게로 부고환 지방 패드를 수확. 부고환과 지방을 사이에 몇 mm의 안전 마진을 유지실수로 부고환 수확의 위험을 줄일 수 있습니다. 참고 :이 절차는 또한 실체없이 수행 할 수 있습니다. 그러나이 더 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 증가시킬 수 있습니다. </li><li> DMEM 15 mL를 함유하는 페트리 접시로 부고환 지방 패드를 이동시켜 세포 기관에 반송하여 37 ℃에서 사전 - 가열 하였다. </li><li> 복부 대동맥 경부 전위의 절개에 의해 동물을 희생. </li></ol> 광고 MVF 4. 분리 <ol><li> (15) 인산 완충 식염수 용액 (PBS), 멸균 수 14 ㎖의 폴리 프로필렌 (PP) 튜브, 멸균 된 50 mL의 삼각 플라스크에, 멸균 1.5 ㎖의 원추형 마이크로 원심 튜브 멸균 미세 위 세 멸균 페트리 접시를 준비한다. </li><li> 층류 후드 아래에 PBS의 15 mL의 페트리 접시에 세 번 지방 패드를 씻으십시오. </li><li> 14 mL의 PP 튜브에 지방을 전송합니다. t를 이용하여 (ML)에서 수확 된 지방 조직의 부피를 결정그는 튜브 규모. 조직 균질 현탁액이 얻어 질 때까지 미세 가위 기계적으로 지방 조직을 잘게. </li><li> 피펫을 측정 10 mL를 이용하여 50 mL의 삼각 플라스크에 NB4G 콜라게나 제 (0.5 U / ㎖ PBS)의 두 개의 볼륨으로 다진 조직을 옮긴다. 총 부피는 단계 4.3에서 측정 된 지방 조직의 체적 배로된다. 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 대기 조건 : 자동 교반기 (25mm 자기 교반 막대의 크기)을 이용하여 격렬한 교반하에 10 분 동안 항온 조직 분해를 수행한다. </li><li> 소화를 중지 할 수 있는지 여부를 판단하기 위해 현미경으로 소화 조직의 작은 부분 (10 μL)을 관찰한다. 효소 소화 과정 (그림 2)를 중지하는 적절한 시점을 나타내는 다 이제 주로 다음 하나의 셀에 &quot;무료&quot;광고 MVF 포함되어 있음을 확인. 참고 :이 단계는 절차에 경험을 필요로하며, 품질에 대한 중요의 광고 MVF을 격리합니다. 광고 MVF없이 단일 세포 현탁액 지방 소화 결과를 장시간. </li><li> PBS / 20 % FCS의 두 개의 볼륨으로 효소를 중화. 총 부피는 단계 4.4에서 세포 현탁액 용기의 용적 배로된다. PP 새로운 튜브에 다시 세포 현탁액 용기 전송. </li><li> 중력에 의해 지방 잔류 광고 MVF 별도 37 ° C에서 5 분 동안 현탁액을 인큐베이션. 그런 다음 조심스럽게 1 mL를 정밀 피펫 주요 지방 상층 액을 제거합니다. 서스펜션은 지방이없는 것으로 나타날 때까지 100 μL 정밀 피펫이 사이클을 여러 번 반복합니다. </li><li> 50ml의 원추형 원심 분리 튜브 위에 500 ㎛의 필터를 넣어. 지방 덩어리 나머지 제거하는 여과막에 14 mL의 PP 튜브에서 10 mL로 측정 피펫으로 셀 용기 현탁액을 전송. 개별 광고 MVF의 개수에 따라 새로운 14 mL의 PP 관으로 현탁액을 여과로 이동하면 계획된 실험 분리. 참고 : 대한의 vitr미세 혈관 망 형성을 중심 O의 분석은, 더 나아가 현미경 분석시 이미지 품질을 개선하기 위해 혈관 세포 현탁액을 정화하는 것이 유리할 수있다. 이를 위해, 현탁액을 추가로 필터에 수집 된 광고 MVF으로부터 단일 세포를 제거하기 위해 20 ㎛의 필터로 여과 한 번 할 수있다. </li><li> 광고 MVF를 함유하는 펠렛을 얻기 위해 세포 현탁액을 용기 (600 XG, 5 분, 실온)를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 용액이 남아 1까지 상청액을 제거한다. 이 1 ㎖의 광고 MVF와 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 mL의 원추형 마이크로 원심 튜브에 현탁 옮긴다. </li><li> 펠렛을 얻기 위해 마이크로 원심 튜브 내의 광고 MVF 현탁액 (600 XG, 5 분) 원심 분리기. </li><li> PBS / 20 % FCS의 필요한 최종 부피 펠렛을 재현 탁하는 상청액을 제거한다. 참고 : 분리 당 광고 MVF의 수는 미세한 계산에 의해 평가 될 수있다. 최종 세포 vesse의 목적 들어 1/10L 현탁액을 PBS에 1:10으로 희석하고,이 희석액 100 ㎕를 96- 웰 플레이트의 웰에 전달된다. 선박과 같은 형태를 보이는 광고 MVF의 전체 수는 계산하고 전체 분리로 추정된다. 필요한 광고 MVF 농도 및 정제는 개별적으로 시험 관내 또는 광고 MVF 생체 응용에 각각에 적용될 수있다. 이것은 미세 혈관 망 형성의 시험 관내 분석하거나 조직 결함으로 생체 내 이식 용 지지체에 광고 MVF 시드의 콜라겐 겔에 MVF 광고의 삽입을 포함 할 수있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 연구에서 우리는 광고 MVF의 절연을위한 잘 확립 된 프로토콜을 제시한다. 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF을 얻는 것은 몇 가지 중요한 단계를 간단한 절차입니다. 마우스는 다른 피하 및 복강 내 지방 예금을 나타낸다. 이전에 래트에 대해 기재된 바와 같이, 광고 MVF의 분리를위한 가장 적합한 지방 원 인해 큰 혈관 (11) 크기, 균일 한 구조와 최소한의 오염 (12)을 부고환 지방 패드이다. 반면, 마우스의 피하 지방 침착은 주변 조직에 더 작고 더 부착된다. 그러나, 부고환 지방 패드의 절제술은 정자와 수확 조직의 오염의 결과로, 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 맺는다. 따라서, 부고환, 고환 및 정삭의 식별이 절차의 주요 중요하다. 또한, 지방 패드 rapidl해야Y는 생체 조직의 손상을 최소화하기 위해 수확 후 처리. 마지막으로,이 쥐의 부고환 지방 패드 (23)의 혈관의 주요 연령에 따라 차이가 있다는 것을 고려해야한다. 우리의 경험에서, 6 ~ 12 개월 된 남성 기증자 마우스의 사용은 체외 및 생체 내 연구에서 광고 MVF의 충분한 양을 제공한다. 그러나, 또한 작지만 매우 혈관 지방 패드 (24)을 나타내는 젊은 쥐에서 광고 MVF을 분리 할 수 있습니다. 수확 부고환 지방 패드의 소화 효소는 결정적으로 고립 광고 MVF의 최종 품질을 결정합니다. 콜라겐에 너무 짧은 박람회는 주변의 지방 세포에서 광고 MVF의 불완전한 분리에 연결됩니다. 한편, 단일 세포 현탁액 광고 MVF의 파괴를 장기간 분해 결과, 소위 간질 혈관 분획 (SVF). SVF는 이종 세포 집단 함유 m이고esenchymal 줄기 세포, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 대 식세포 및 분비 및 분화 메커니즘 (25)을 통해 회생 가능성이있는 많은 다른 세포 유형. 광고 MVF의 사용은 SVF 기반의 접근 방식에 비해 상당한 장점을 나타낸다. 광고 MVF의 완전한 기능을 미세 혈관의 형태는 체외 배양에 시간이 많이 소요되는 복잡한없이 생체 실험에 대한 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 또한, SVF의 분리는 일반적으로 90 분 내지 26까지 콜라게나 조직의 분해를 필요로한다. 대조적으로, 티슈 열화 광고 MVF의 분리를위한 10 분을 초과하지 않아야한다. 이 광고 MVF 9 수술 한 단계 응용 프로그램의 아이디어를 지원합니다. 이를 위해, 광고 MVF 자동자가 lipoaspirates에서 고립 될 수 있으며 동작 극장을 떠나지 않고 환자의 조직 결함으로 다시 옮겼다. 이것은 현실적인 고아입니다lipoaspirates로부터 SVF의 자동 분리 이미 성형 27, 28, 29 일에 임상 적 설정 절차는 사실을 고려 L. 최근에, 우리는 뼈 (14)과 피부 (15) 대체의 생체 내 혈관에 광고 MVF의 강력한 효과를 증명하고있다. 관심, 우리는 그들이 광고 MVF (13)의 높은 혈관 용량에 기여하는 더 생리적 환경을 제공 할 수 있기 때문에, 분리 광고 - MVF에서 단일 세포를 제거하지 유익한 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 더 큰 비 소화 지방 혈전을 제거하기위한 광고 MVF의 분리 동안 500 μm의 필터를 사용했다. 또한, 우리는 이식 된 피부가 광고 MVF가 유도 림프관 15를 대체 발견했다. 따라서, 광고 MVF도 lymphat을위한 빌딩 블록을 약속 할 수있다IC의 조직 공학 및 림프 부종 치료. 임상 적으로 이러한 실험 결과의 성공적인 번역의 경우, 다음 논리적 단계는 인간 지방 조직은 설치류 지방 등의 광고 MVF의 절연을위한 동등하게 적합 여부를 명확히하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 중요한 문제는 광고 MVF 많은 양을 분리하는 데 필요한 지방의 양입니다. 프로토콜 설명 본 mL의 지방 조직 당 약 40,000 광고 MVF의 결과. 따라서, 3 ㎖의 지방 조직은 피부, 피부 (15)의 대체 1cm 2 prevascularize 할 필요가있을 것이다. 따라서,이 방법으로 인해 광고 MVF 분리 할 수 ​​지방 조직의 제한된 양에 큰 상처 또는 심각하게 아픈 환자의 치료를 위해 가능하지 않을 수 있습니다. 조직 공학 및 재생 의학 생체 내 응용 프로그램의 잠재적 광범위한 스펙트럼의 옆에, 광고 MVF 또한 혈관 시저의 체외 모델링에 적합esses. 예를 들어, 쥐 광고 MVF 새로운 미세 혈관 네트워크 (30)의 형성을 연구하기 위해 입체 콜라겐 하이드로 겔에서 배양되었다. 비슷한 접근 방식은 혈관 신생 31시 neovessel 성장 (13) 간질 매트릭스 리모델링의 시각화를위한 정교한 이미징 기술을 평가하는 데 사용되었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 광고 MVF 만 아니라 혈관 신생과 혈관 생리학 분야의 기초 연구에 대한 미래 치료 전략에 대한 혈관 및 lymphangiogenic 단위를 약속하지 않는 나타냅니다.

조직 공학에서는 생체 대응 1, 2에서 불가능한 기능을 복원하거나 보강 조직 및 장기를 유지한다 대체품의 제조에 초점을 맞추고있다. 조직 공학 구조물의 운명은 결정적 적절한 혈관 3에 의존한다. 이러한 구조 내에서 미세 혈관 네트워크는 계층 적으로받는 사람의 혈관 4 inosculation 후 효율적인 혈액 관류를 허용하는 소동맥, 모세 혈관과 정맥으로 구성되어야한다. 이러한 네트워크의 생성은 조직 공학의 주요 과제 중 하나입니다. 이를 위해 실험 혈관 전략의 폭 넓은 스펙트럼은 지난 20 년 5, 6을 통해 소개되었다. 혈관 접근 방식은 설계, 담배 마는으로받는 미세 혈관의 증식을 자극이러한 성장의 혼입 7 요인 구조적 또는 물리 골격 변형 수단에 의해 단말. 그러나 대형 입체 구조의 혈관에 대한 혈관 신생에 의존하는 전략은 크게 미세 혈관 (8) 개발의 느린 성장 속도에 의해 제한됩니다. 조직들은 주입하기 전에 9 내에 구축 반대로 prevascularization의 개념은 네트워크 기능 미세 혈관의 생성을 목적으로한다. 종래 prevascularization는 골격 내의 내피 세포 벽화 세포 또는 줄기 세포 (10)와 같은 혈관 형성 세포의 공동 배양을 포함한다. 미세 혈관 망 형성 후 prevascularized 구조이어서 조직 결함을 주입 할 수있다. 이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 체외 기반으로하기 때문에 주목,이 prevascularization 접근 방식은 임상에 적용하기 어려운 &lt;/ EM&gt; 주요 규제 장애물 (9)에 의해 제한되는 절차. 따라서, 폭 넓은 임상 응용 프로그램에 더 적합한 새로운 prevascularization 전략의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 이러한 prevascularization 전략은 지방 조직 유래의 미세 혈관 단편 (AD-MVF)을 적용 할 수있다. 광고 MVF 쥐 (11), (12)와 마우스 (13)의 지방 조직에서 다량으로 수확 할 수있는 강력한 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 세동맥, 모세 혈관 및 루멘 생리 미세 혈관 형태를 나타내는 세정맥 용기 세그먼트 및 안정화 혈관 주위 세포를 14, 15로 구성된다. 이 독특한 기능은 precultivation없이 조직 결함에 광고 MVF 시드 발판의 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 이 광고-MVF 빠르게에서 재 조립기능성 미세 혈관 네트워크. 또한, 광고 MVF은 또한 자신의 놀라운 재생 능력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포 (16)의 풍부한 소스를 나타냅니다. 따라서, 광고 MVF 점점 조직 공학 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21의 다양한 분야에서 사용된다. 광고 MVF의 분리는 원래 12 쥐 11 년에 설립되었습니다. 여기서, 우리는 부고환 지방 패드에서 쥐의 광고 MVF의 표준화 분리를 허용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 형질 전환 마우스 모델을 사용하여 광고 MVF 기능을 기본 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력을 제공 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>1.5-mL conical microcentrifuge tube</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;L precision pipette</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>4920000059</td><td></td></tr><tr><td>10-mL measuring pipette</td><td>Costar, Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>14-mL PP tubes</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>1-mL precision pipette</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>500-&amp;micro;m filter (pluriStrainer 500 &amp;micro;m)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>50-mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Erlenmeyer flask</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>214-0211</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>65518</td><td></td></tr><tr><td>cell detachment solution (Accutase)</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Charles River, Cologne, Germany</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice</td><td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>CD117-FITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553354</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB4G&amp;nbsp;</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>17465.02</td><td>Lot tested by manufacturer for enzymatic activity</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Braun Aesculap AG &amp;amp;CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BC 601</td><td></td></tr><tr><td>DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>PAN Biotech, Rickenbach, Germany</td><td>P04-03600</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>S&amp;amp;T AG, Neuhausen, Switzerland</td><td>FRS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>Dermal skin substitute (Integra)</td><td>Integra Life Sciences, Sain Priest, France</td><td>62021</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp;</td><td>Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany</td><td>7005294</td><td></td></tr><tr><td>M-IgG2akAL488&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-4724-80</td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm (disinfecting solution)</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp;amp; Mayer, Norderstedt, Germany</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Lonza Group, Basel, Switzerland</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20-&amp;micro;m (20 &amp;micro;m filter)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akFITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553988</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akPE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Small preparation scissors</td><td>S&amp;amp;T AG, Neuhausen, Switzerland</td><td>SDC-15 R-8S</td><td></td></tr><tr><td>Surgical forceps</td><td>Braun Aesculap AG &amp;amp;CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BD510R</td><td></td></tr><tr><td>Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm</td><td>Fink &amp;amp; Walter GmbH, Mechweiler, Germany</td><td>1671801</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&amp;nbsp;</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td><td>1320422</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-SMA-AL488</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-9760-82</td><td>Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)</td></tr></tbody></table>

isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering

기능성 미세 혈관 네트워크는 생존과 설계 조직 구조의 통합을위한 중요한 중요하다. 이러한 목적을 위해, 여러 혈관 및 prevascularization 전략이 수립되었다. 그러나, 대부분의 셀 기반 접근 방식은 미세 혈관 네트워크의 형성에 시간이 많이 소요되는 체외 단계를 포함한다. 따라서, 그들은 수술 한 단계 절차에 적합하지 않다. 지방 조직 유래 미세 혈관 조각 (광고 MVF)는 유망 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 쉽게 지방 조직에서 분리 및 기능성 미세 혈관의 형태를 나타낼 수 있습니다. 또한, 이들은 생체 빠르게 주입 후 새로운 미세 혈관 망으로 조립. 또한, 광고 MVF은 림프관을 유도하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 그들은 더 높은 혈관 잠재력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포의 풍부한 소스. 이전의 연구에서 우리는 놀라운 vascularizati을 증명하고있다설계 뼈와 피부 대체에 광고 MVF의 용량에. 본 연구에서 우리는 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF의 효소 분리를위한 표준화 된 프로토콜에보고한다.

본 연구에서 우리는 12 개월 된 수컷 야생형 C57BL / 6 마우스 (35 ± 1g 체중을 의미)에 7-에서 지방 조직과 육 광고 MVF 분리 절차를 수행. 도 1은 후속 기계적 및 효소 광고 MVF 절연 및 뮤린 부고환 지방 패드의 채취를 나타낸다. 지방의 수확에 필요한 시간은 30 분이었고, 광고 MVF의 분리 120 분이었다. 전체적으로, 절차는 150 분 걸렸다. 우리는 기증자 동물 당 지방 조직의 1.2 ± 0.1 mL를 수확. 지방이 금액은 용액 당 42,000 ± 2,000 광고 MVF의 분리를 허용했다. 단리 광고 MVF의 평균 길이가 42 ± 1 ㎛ (도 2a)이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 소화 효소의 기간은 미세한 제어를 이용하여 결정 하였다. 광고 MVF 계층 보이는 군 전형적인 미세 혈관의 형태를 전시SEL 세그먼트 (도 2C). 우리는 또한 유동 세포 계측법에 의해 광고 MVF 특징. 이를 위해, 광고 MVF는 또한 단일 셀 (15)에 30 분 동안 세포 분리 용액에서 분해되었다. 유동 세포 계측은 광고 MVF는 중간 엽 줄기 세포 마커 양성 26 ± 2 % CD31 양성 내피 세포를 17 ± 2 % α - 평활근 액틴 (SMA) 양성 혈관 주위 세포, 9 ± 1 %의 세포를 함유하는 것이 밝혀 분석 CD117 (도 3A-C). 고정 및 조직 학적 분석을 위해 즉시 구분 된 피부 피부 대신,에 파종 한 후 더 큰 광고 MVF는 주로 임플란트의 표면 (그림 3D)에 국소했다. 그러나, 모세 혈관 세그먼트는 공극 내에서 검출 될 수있다. 시드 광고 MVF의 면역 조직 화학 염색은 상기 세동맥, 세정맥과 생리 미세 혈관 구조를 보여모세관 형 단편 (도 3e). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig1.jpg" /> 그림 1 : 광고 MVF 절연. A) 중간 선 개복술 후, 부고환 지방 패드 (별표)가 식별됩니다. 지방 조직은 소규모 제조 가위로 수확하고, 동물은 복부 대동맥 (화살촉)의 절개에 의해 희생된다. B) 조직 현탁액까지 미세 위 지방 패드의 기계적 닦지 균질 나타난다. 효소 소화 C)는, 콜라겐 조직의 현탁액에 첨가된다. D), 셀 용기 현탁액 배양 상청 지방 층은 폐기된다. E)는 원심 분리 후, 광고 MVF를 포함하는 펠렛을 재현 탁 및 microvasc의 체외 분석과 같은 다양한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다울라 망 형성 또는 조직 결함으로 생체 내 주입 (F)에 대한 발판 광고 MVF의 시드. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig2.jpg" /> 그림 2 : 광고 MVF의 형태 학적 특징. 갓 격리 광고 MVF의) 길이 배포. 평균 ± 평균의 표준 오차 (N = 6). 큰 (화살표 셀 혈관 서스펜션 스미어 B) 현미경 화상), 중형 (이중 화살표) 작은 (흑색 화살촉) 광고 MVF뿐만 아니라 하나의 셀 (흰색 화살표 머리). 스케일 바 = 110 μm의. 높은 배율은 (C 그런 광고 MVF 전시 계층 미세 혈관 세그먼트 성숙한 미세 혈관 형태를 보여준다 <stroNG&gt;) B의 인셋. 스케일 바 : C 50 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig3.jpg" /> 그림 3 : 유세포, 조직 학적 및 광고 MVF의 면역 조직 화학적 특성. AC)는 도시는 유세포 갓 절연 광고 MVF CD31 양성 내피 세포 (A), α-SMA 양성 혈관 주위 세포 (B) 및 CD117 양성의 중간 엽 줄기 세포 (C) 분획 분석 흐른다. 적절한 아이소 타입 - 동일한 컨트롤이 임계 값 레벨을 조정하는 데 사용되었다. 평균 ± 평균의 표준 오차 (N = 6). D) 헤 마톡 실린 및 시딩 된 경피 피부 대체물 에오신 염색 섹션. 몇 모세 혈관 세그먼트가 임플란트에 위치 &amp;# 39; S 기공 (화살촉). 세정맥 (이중 화살표) 또는 동맥 (화살표) 형태로 큰 미세 혈관은 표면에 국부적된다. 스케일 바는 40 μm의 =. 깨진 라인 = 임플란트 테두리. E) 면역 내피 세포 마커 CD31 (적색의 검출) 및 혈관 주위 세포 마커 α-SMA (녹색)에 의해 광고 MVF 특성화. 세포핵은 DNA 결합 형광 염료 (파란색)으로 염색 하였다. 큰 루멘 (이중 화살표)으로 단편 세정맥에 비해 세동맥 광고 MVF (화살표)가 두꺼운 α-SMA 양성 세포 층을 특징으로한다. 화살촉 = 모세관 광고 MVF. 스케일 바는 25 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

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12.4K 조회수.  Saarland University.  우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다. 

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

연구

생체공학

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

생물학

혈관벽에서 murine CD34+ 줄기 세포의 분리 및 자기 분리

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

저자 스포트라이트: Magnetic Bead Screening-Coupled Flow Cytometry를 사용한 혈관벽 거주자 쥐 CD34+ 줄기 세포의 향상된 분리 및 특성 분석

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

의학

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

murine white 지방 조직의 반자동 분리

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

저자 스포트라이트: 조직 해리제를 사용하여 Murine White 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

요약

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탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Microvascular Fragments에서 Vascularized Thermogenic Adipose Tissue의 3차원 배양

세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34⁺ 줄기 세포의 면역자기 분리

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리