Name: isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering
Uploaded: 2017-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering at JoVE.com

אנו מודים על הסיוע הטכני המצוין של ג&#39;נין Becker, קרוליין Bickelmann ורות ניקלס. מחקר זה מומן על ידי מענק של (DFG - קרן המחקר הגרמנית) - LA 2682 / 7-1.

כל הנהלים בוצעו על פי המכון הלאומי הנחיות הבריאות לשימוש בחיות מעבדה ועקבו הנחיות מוסדיים (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, אבט. Lebensmittel- und Veterinärwesen, ה&quot;צנטרלשטלה&quot;, זארבריקן, גרמניה). 1. הכנת מכשירים כירורגיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מוכנים מספריים לנתיחה, מלקחיים כירורגיים, מספרי הכנה קטנים, מלקחיים בסדר צלחת פטרי סטרילית עם 15 בינוני הנשר השונים של המ&quot;ל Dulbecco (DMEM; 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), 100 פניצילין U / mL, 0.1 מ&quot;ג / mL סטרפטומיצין עבור) קציר רפידות שומן epididymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את מכשירי ניתוח לפתרון חיטוי עבור 5 דקות. לחלופין, לעקר אותם (עיקור קיטור; 121 ° C, 20 דקות). </li></ol> 2. בעלי חיים הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בקפידה את זן של עכברים כמצוין לחקר ואת<html> הנושא תחת חקירה. הערה: במחקר זה השתמשנו C57BL / 6 עכברי-בר זכר כתורמות עבור קצירת השומן epididymal. מעניין, אד-MVF ניתן לבודד גם מחלבון ניאון ירוק מהונדסות (GFP) חיות תורמות -positive (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. זו נושאת את היתרון העיקרי שרסיסי ניתנים לזיהוי בקלות על ידי מכתים immunohistochemical GFP לאחר ההשתלה לתוך עכברי-בר GFP שלילי 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות עם זריקה intraperitoneal של xylazine (15 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו קטמין (75 מ&quot;ג / ק&quot;ג). ודא כי בעלי החיים מורדמים עמוק על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן עם כל תגובה. חומר סיכת עין אינה שמוזכר בתור החיות התורמות מוקרבות לאחר קצירת שומן. הערה: ודא כי שיכוך כאבים ועקר כירורגיים עולים בקנה אחד עם ההנחיות המתאימות של המדינה ואת המוסד שבו הניסויים מתוכננים. </li></ol>le &quot;&gt; 3. קציר רפידות epididymal שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החיה אל שולחן הניתוח. מניחים את חיה במצב שכיבה תחת סטראו כירורגי לאשר הרדמה עמוקה באמצעות צביטה הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את הכפות ידי מקליט אותם לעטוף כירורגית ולחטא את הבטן עם חיטוי פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את עור הבטן ללא שכבת השריר הבסיסית עם מספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו פיום קו האמצע עם מספריים לנתיחה ו רוחבית נפרשים סגר היטב את דופן הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בילטרלי לזהות האשכים, יותרת האשך ואת כרית שומן epididymal באמצעות מלקחיים עדינים (איור 1). אל תפגעו מבני המעיים כדי למנוע זיהום צואתי של רפידות השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר רפידות שומן epididymal עם מספרי הכנה קטנים מלקחי הקנס תחת סטראו. שמור מרווח ביטחון של כמה מ&quot;מ בין יותרת האשך ואת השומןלהפחית את הסיכון של קצירת epididymal בשוגג. הערה: הליך זה יכול להתבצע גם ללא סטראו. עם זאת, זה עלול להגביר עוד יותר את הסיכון של פגיעה בשוגג של יותרת האשך ואת מיתרי הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רפידות שומן epididymal לתוך צלחת פטרי המכילה 15 מיליליטר של DMEM מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס להובלה למעבדת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה על ידי חתך של אבי העורקים בבטן או נקע בצוואר הרחם. </li></ol> בידוד 4. של אד-MVF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלוש מנות סטרילי פטרי עם 15 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS), פוליפרופילן 14 מ&quot;ל סטרילי (PP) צינורות, בקבוק 50 מ&quot;ל Erlenmeyer סטרילית, צינורות microcentrifuge חרוטי 1.5-מ&quot;ל סטרילי מספריים קנס מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש פעמים לשטוף את רפידות שומן בצלחות פטרי עם 15 מ&quot;ל של PBS מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השומן לתוך צינור 14 מ&quot;ל PP. לקבוע את עוצמת הקול של רקמת שומן שנקטפה (ב מיליליטר) באמצעות tהוא בהיקף הצינור. לרכך את רקמת השומן מכאני עם המספריים בסדר עד השעית רקמה הומוגנית מתקבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה טחון עם שני כרכים של collagenase NB4G (0.5 U / mL PBS) לתוך בקבוק 50 מ&quot;ל Erlenmeyer באמצעות 10 מ&quot;ל מדידת פיפטה. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את נפח רקמת שומן נמדדה צעד 4.3. בצע לעיכול רקמה באינקובטור במשך 10 דקות תחת בחישה נמרצת באמצעות בוחש אוטומטי (בגודל של בר ומערבבים מגנטי: 25 מ&quot;מ) ב- 37 ° C ותנאים אטמוספריים humidified עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו שבריר קטן (10 μL) של הרקמה מתעכל תחת מיקרוסקופ כדי לשפוט האם ניתן לעצור את תהליך העיכול. שיבטיח כי העיכול בעיקר מכיל &quot;חינם&quot; אד-MVF ליד תאים בודדים, המציין את הנקודה המתאימה כדי לעצור את תהליך עיכול אנזימטי (איור 2). הערה: שלב זה דורש ניסיון עם ההליך הוא קריטי לאיכותשל אד-MVF מבודד. ממושכת תוצאות עיכול שומן השעית תא בודד ללא פרסומות MVF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את האנזים עם שני כרכים של PBS / 20% FCS. הנפח הכולל הופך שלוש פעמים את עוצמת הקול של השעית תא-כלי בשלב 4.4. מעביר את השעית תא-כלי בחזרה לתוך צינורות PP חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס להפריד אד-MVF מן הנותרים שומן על ידי כוח הכבידה. אז בזהירות להסיר את supernatant השומן העיקרי עם טפטף דיוק 1-מיליליטר. חזור על מחזור זה כמה פעמים עם טפטף דיוק 100-μL עד ההשעיה שנראית ללא שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מסנן 500 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ&quot;ל. מעבירים את ההשעיה-כלי התא עם טפטפת מדידה 10 מ&quot;ל מן הצינורות PP 14 מ&quot;ל על הממברנה הסינון כדי להסיר הנותרים קרישי שומן. מעבירים את ההשעיה מסונן לתוך צינורות חדשים 14 מ&quot;ל PP לפי מספר מודעה-MVF הפרט מבודד עבור הניסויים המתוכננים. הערה: ב vitrמבחני o התמקדות ביצירת רשת כלי הדם, זה עשוי להיות מועיל יותר כדי לטהר את ההשעיה-כלי התא כדי לשפר את איכות ההדמיה במהלך ניתוחים מיקרוסקופיים. לשם כך, על השעיית ניתן לסנן גם פעם עם מסנן 20 מיקרומטר להסיר תאים בודדים מהמודעה-MVF שנאספו על המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה-כלי התא (600 XG, 5 דקות, בטמפרטורת החדר) כדי להשיג גלולה המכילה אד-MVF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant עד 1 מ&quot;ל שנשאר. Resuspend גלולה עם אד-MVF ב 1 זה מ&quot;ל ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל חרוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה אד-MVF בצינור microcentrifuge (600 XG, 5 דק &#39;) כדי להשיג גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה בהיקף הסופי הנדרש של PBS / 20% FCS. הערה: מספר המודעה-MVF לכל לבודד ניתן להעריך על ידי ספירה מיקרוסקופית. לשם כך, 1/10 של התא-vesse הסופיl ההשעיה היא מדוללת 1:10 ב PBS ו 100 μL של דילול זה מועברים לתוך באר של צלחת 96-היטב. המספר השלם של אד-MVF מציג מורפולוגיה כלי דמוי נספר אז אקסטרפולציה לבודד כולו. ריכוז אד-MVF נדרש וטיהור ניתן להתאים באופן אישי את המתאימים במבחנה או ביישום vivo של אד-MVF. זה יכול לכלול את וההטבעה של MVF המודעה ג&#39;ל קולגן לניתוח במבחנה של היווצרות רשת כלי דם או הזריעה של אד-MVF על פיגומים להשתלת in vivo לתוך פגמים ברקמות. </li></ol>

<ol>
	<li>Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering.">Tissue engineering.</a> Science. 260 (5110), 920-926 (1993).</li><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+progress+in+tissue+engineering.">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li><li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering.">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li><li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+and+Angiogenesis+in+Tissue+Engineering:+Beyond+Creating+Static+Networks.">Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks.</a> Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+in+tissue+engineering:+angiogenesis+versus+inosculation.">Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation.</a> Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).</li><li>Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+vascularisation+within+tissue+engineering+constructs.">Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).</li><li>Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+emerging+vascularization+strategies+in+skin+tissue+engineering.">Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering.</a> Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).</li><li>Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+time+series+microscopy+of+neovessel+growth+during+angiogenesis.">Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis.</a> Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevascularization+in+tissue+engineering:+Current+concepts+and+future+directions.">Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions.</a> Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).</li><li>Baiguera, S., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialization+approaches+for+viable+engineered+tissues.">Endothelialization approaches for viable engineered tissues.</a> Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).</li><li>Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+and+cytochemical+localization+of+a+catecholamine-sensitive+adenylate+cyclase+in+isolated+capillary+endothelium.">Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).</li><li>Wagner, R. C., Matthews, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+culture+of+capillary+endothelium+from+epididymal+fat.">The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat.</a> Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments:+natural+vascularization+units+for+regenerative+medicine.">Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine.</a> Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).</li><li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularisation+of+porous+scaffolds+is+improved+by+incorporation+of+adipose+tissue-derived+microvascular+fragments.">Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments.</a> Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).</li><li>Frueh, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+improve+vascularization,+lymphangiogenesis+and+integration+of+dermal+skin+substitutes.">Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).</li><li>McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+multilineage+potential+of+cells+derived+from+isolated+microvascular+fragments.">Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments.</a> J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+autotransplantation+of+microvessel+fragments+on+experimental+random-pattern+flaps+in+the+rat.">Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat.</a> Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).</li><li>Nakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+autotransplantation+of+microvessel+fragments+into+the+rat+heart.">Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart.</a> Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).</li><li>Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+transplantation+after+acute+myocardial+infarction.">Microvascular transplantation after acute myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).</li><li>Pilia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+perfusion+of+microvascular+fragments+in+a+rodent+model+of+volumetric+muscle+loss+injury.">Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury.</a> Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).</li><li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+from+aged+donors+exhibit+an+impaired+vascularisation+capacity.">Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity.</a> Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).</li><li>Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Green+mice'+as+a+source+of+ubiquitous+green+cells.">'Green mice' as a source of ubiquitous green cells.</a> FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).</li><li>Honek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+age-related+insulin+sensitivity+by+VEGF-dependent+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-Derived+Stromal+Vascular+Fraction+Cells:+Update+on+Clinical+Utility+and+Efficacy.">Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Porcine+Subcutaneous+Adipose+Tissues.">Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues.</a> J Vis Exp. (109), e53886 (2016).</li><li>Guillaume-Jugnot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+in+patients+with+systemic+sclerosis:+12-month+follow-up.">Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up.</a> Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).</li><li>Tissiani, L. A., Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Prospective+and+Controlled+Clinical+Trial+on+Stromal+Vascular+Fraction+Enriched+Fat+Grafts+in+Secondary+Breast+Reconstruction.">A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction.</a> Stem Cells Int. , 2636454 (2016).</li><li>Calcagni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+treatment+of+SVF-enriched+fat+grafting+for+painful+end-neuromas+of+superficial+radial+nerve.">The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve.</a> Microsurgery. , (2016).</li><li>Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+potential+of+microvessel+fragments+established+in+three-dimensional+collagen+gels.">Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).</li><li>Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+collagen+remodeling+during+angiogenesis.">Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ומבוסס על הבידוד של אד-MVF. קבלת פרסומות MVF מרקמות שומן בעכברים היא הליך פשוט עם כמה צעדים קריטיים. עכברים להפגין תת עורית שונה ופיקדונות שומן intraabdominal. כפי שתואר לעיל עבור חולדות, מקור שומן המתאים ביותר עבור בידוד של אד-MVF הם רפידות שומן epididymal בשל גודלם, מבנה הומוגני זיהום מינימלי עם כלי דם גדול 11, 12. לעומת זאת, מצבורי שומן תת עורי בעכברים הם הרבה יותר קטנים יותר חסיד אל הרקמה שמסביב. עם זאת, כריתה של רפידות שומן epididymal נושא בסיכון של פגיעה בשוגג של יותרת האשך ואת מיתרי הזרע, וכתוצאה מכך זיהום של הרקמה שנקטפו עם זרע. לכן, זיהוי של יותרת האשך, האשכים ואת מיתרי הזרע הינה בעלת חשיבות רבה בהליך זה. יתר על כן, ריפוד השומן צריך להיות rapidly מעובד לאחר הקטיף כדי למזער לשעבר vivo נזק לרקמות. לבסוף, יש לשקול את זה כי יש וריאציות עיקריות תלוי גיל כלי הדם של רפידות שומן epididymal בעכברי 23. מניסיוננו, השימוש 6 ל- עכברים תורמים זכרו 12 חודשים ישנים מספק כמויות מספיקות של אד-MVF עבור במבחנה במחקרי vivo. עם זאת, זה יכול להיות גם אפשרי לבודד את המודעה-MVF מעכברים צעירים, אשר מציגים קטנות אבל מאוד vascularized רפידות שומן 24. העיכול אנזימטי של רפידות שומן epididymal שנקטפו מכריע קובע את האיכות הסופית של MVF מודעה המבודד. אקספוזיציה קצרה מדי כדי collagenase מובילה חוסר הפרדת אד-MVF מ adipocytes שמסביב. מצד השני, תוצאות עיכול ממושכי חורבן אד-MVF כדי השעית תא בודדת, שבר כלי הדם שנקראת סטרומה (SVF). SVF הוא מטר המכיל אוכלוסייה הטרוגנית תאתאי גזע esenchymal, תאי אנדותל, pericytes, מקרופאגים סוגי תאים רבים אחרים עם פוטנציאל ההתחדשות באמצעות מנגנונים paracrine והבחנה 25. השימוש אד-MVF מציג יתרונות משמעותיים בהשוואה גישות מבוססות SVF. מורפולוגיה microvessel הפונקציונלית המלא של אד-MVF מאפשרת ההשתלה המיידית שלהם בניסויי vivo בלי זמן רב ומורכב בטיפוח במבחנה. יתר על כן, את הבידוד של SVF בדרך כלל דורש עיכול של רקמת עם collagenase עד 90 דק &#39;26. לעומת זאת, ניוון רקמות לא יעלה על 10 דקות לבידוד של אד-MVF. זה תומך ברעיון של יישומי צעד אחד תוך ניתוחיים של אד-MVF 9. לשם כך, אד-MVF ניתן לבודד אוטומטית lipoaspirates אוטולוגי והועבר בחזרה פגם רקמות של המטופל מבלי לעזוב את תיאטרון הפעולה. זהו גואה מציאותיl בהתחשב בעובדה הבידוד האוטומטי של SVF מן lipoaspirates הוא כבר הליך הוקם קלינית ניתוחים פלסטיים 27, 28, 29. לאחרונה, אנו הדגמנו השפעה חזקה של אד-MVF על כלי דם in vivo של 14 עצם ועור 15 תחליפים. מעניין, מצאנו שזה מועיל שלא להסיר תאים בודדים מהמודעה-MVF לבודד, משום שהם עשויים לספק סביבה פיזיולוגית יותר שתורמת ליכולת כלי הדם הגבוהה של 13 אד-MVF. לכן, אנחנו רק השתמשנו במסנן 500 מיקרומטר במהלך הבידוד של אד-MVF להסרת קרישי שומן בלתי מעוכל גדולים. יתר על כן, מצאנו כי ad-MVF לגרום lymphangiogenesis בעור מושתל תחליפי 15. לפיכך, מודעות-MVF יכול להיות גם מבטיח אבני הבניין lymphatהנדסת רקמות IC וטיפול בצקת לימפתית. על התרגום המוצלח של ממצאים הניסיוניים אלה לתוך פרקטיקה קלינית, הצעד ההגיוני הבא הוא לברר האם רקמת שומן אדם מתאימה באותה מידה עבור הבידוד של אד-MVF כשומן מכרסם. בהקשר זה, נושא קריטי הוא כמות השומן הנדרשת כדי לבודד כמויות גדולות של אד-MVF. בזאת המתואר בפרוטוקול הביא כ 40,000 אד-MVF לכל רקמות שומן מ&quot;ל. לפיכך, 3 מ&quot;ל שמן רקמות יהיה צורך prevascularize 1 ס&quot;מ 2 של תחליף עור עורי 15. לפיכך, גישה זו עשויה להיות לא ריאלית לטיפול בפצעים גדולים או חולים קשים בשל כמות מוגבלת של רקמות שומן זמינות עבור בידוד אד-MVF. לצד קשת רחבה של פוטנציאל ביישומים vivo בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, אד-MVF מתאימים גם הדוגמנות במבחנה של proc אנגיוגנזהesses. לדוגמה, מודעה-MVF חולדה כבר בתרבית הידרוג&#39;ל קולגן תלת ממדי כדי לחקור היווצרות רשתות כלי הדם החדשים 30. בדומה לגישות שמשו להעריך טכניקות הדמיה מתוחכמות להדמיה של צמיחת neovessel 13 או שיפוץ מטריצת ביניים במהלך אנגיוגנזה 31. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על כך אד-MVF אינו מבטיח רק כלי דם ויחידות lymphangiogenic לאסטרטגיות טיפוליות בעתיד, אלא גם למחקר בסיסי בתחום אנגיוגנזה ופיזיולוגית כלי דם.

הנדסת רקמות מתמקדת הייצור של תחליפי רקמה ואיבר מקיימים, לשחזר או להגדיל את הפונקציה של שמיש ב עמיתיהם vivo 1, 2. גורלם של מבני רקמות מהונדסים תלוי באופן מכריע על כלי דם הולם 3. רשתות כלי דם בתוך המבנים האלה צריכים להיות מאורגנים באופן היררכי עם arterioles, נימים, ו venules לאפשר טפטוף דם יעיל אחרי inosculation אל כלי הדם של הנמען 4. הדור של רשתות כאלה הוא בין האתגרים המרכזיים בתחום הנדסת רקמות. לשם כך, קשת רחבה של אסטרטגיות כלי דם ניסיוני כבר הציגה במהלך שני העשורים האחרונים 5, 6. גישות אנגיוגנזה לעורר את ingrowth של microvessels הנמען Tiss מהונדסיםUES באמצעות שינוי פיגום מבני או physicochemical, כגון השילוב של צמיחת גורמי 7. עם זאת, עבור כלי דם של המבנים התלת-ממדי גדול, אסטרטגיות תלויי אנגיוגנזה מוגבלים במידה ניכרת בשיעורי צמיחה איטית של פיתוח microvessels 8. לעומת זאת, מושג prevascularization שואף עבור הדור של רשתות כלי דם פונקציונליות בתוך רקמת הבונה לפני ההשתלה שלהם 9. Prevascularization הקונבנציונלי כרוך לתרבות המשותפת של תאים מייצרי כלי, כגון תאי אנדותל, תאי ציור קיר או תאי גזע 10, בתוך פיגומים. לאחר היווצרות רשת כלי דם, מבני prevascularized לאחר מכן ניתן מושתלים לתוך פגמים ברקמות. ראוי לציון, גישת prevascularization זה קשה ליישם במסגרת רפואית, משום שהיא מבוססת על קומפלקס זמן רב במבחנה &lt;/ em&gt; נהלים, אשר מוגבלים על ידי מכשולים רגולטוריים מרכזיים 9. בהתאם לכך, יש עדיין צורך לפיתוח אסטרטגיות prevascularization רומן כי הם יותר מתאימים יישום קליני רחב. אסטרטגיה כזו prevascularization עשויה להיות היישום של שברי כלי דם נגזר רקמה שומני (ad-MVF). אד-MVF מייצג יחידות של כלי דם חזקים כי ניתן לקצור בכמויות גדולות מרקמת השומן של חולדות 11, 12 ו עכברים 13. הם מורכבים arteriolar, נימים, ומגזרי כלי venular, אשר מציגים מורפולוגיה microvessel פיזיולוגית עם לומן ותאי perivascular ייצוב 14, 15. תכונה ייחודית זו מאפשרת ההשתלה המיידית של פיגומי אד-MVF זרע לתוך פגמי רקמות ללא precultivation. יש, במודעה-MVF במהירות להרכיב מחדש בלרשתות כלי דם פונקציונליות. יתר על כן, אד-MVF מייצג מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal 16, אשר עשוי גם לתרום יכולת ההתחדשות הבולטת שלהם. בהתאם לכך, אד-MVF משמש יותר ויותר בתחומים שונים של הנדסת רקמות 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21. בידודו של אד-MVF כבר נקבע במקור בחולדות 11, 12. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול, אשר מאפשר בידוד הסטנדרטי של MVF מודעה בעכברים מן רפידות שומן epididymal. זה עשוי לספק תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פונקציה אד-MVF באמצעות מודלים עכבר מהונדס.

<table><tbody><tr><td>1.5-mL conical microcentrifuge tube</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;micro;L precision pipette</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>4920000059</td><td></td></tr><tr><td>10-mL measuring pipette</td><td>Costar, Corning Inc., New York, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>14-mL PP tubes</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>1-mL precision pipette</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>500-&amp;micro;m filter (pluriStrainer 500 &amp;micro;m)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>50-mL conical centrifuge tube</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>50-mL Erlenmeyer flask</td><td>VWR, Kelsterbach, Germany</td><td>214-0211</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>65518</td><td></td></tr><tr><td>cell detachment solution (Accutase)</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Charles River, Cologne, Germany</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice</td><td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>CD117-FITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553354</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase NB4G&amp;nbsp;</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>17465.02</td><td>Lot tested by manufacturer for enzymatic activity</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Braun Aesculap AG &amp;amp;CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BC 601</td><td></td></tr><tr><td>DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>PAN Biotech, Rickenbach, Germany</td><td>P04-03600</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>S&amp;amp;T AG, Neuhausen, Switzerland</td><td>FRS-15 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>Dermal skin substitute (Integra)</td><td>Integra Life Sciences, Sain Priest, France</td><td>62021</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp;</td><td>Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany</td><td>7005294</td><td></td></tr><tr><td>M-IgG2akAL488&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-4724-80</td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm (disinfecting solution)</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp;amp; Mayer, Norderstedt, Germany</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Lonza Group, Basel, Switzerland</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20-&amp;micro;m (20 &amp;micro;m filter)</td><td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akFITC</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553988</td><td></td></tr><tr><td>Rat-IgG2akPE</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Small preparation scissors</td><td>S&amp;amp;T AG, Neuhausen, Switzerland</td><td>SDC-15 R-8S</td><td></td></tr><tr><td>Surgical forceps</td><td>Braun Aesculap AG &amp;amp;CoKG, Melsungen, Germany</td><td>BD510R</td><td></td></tr><tr><td>Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm</td><td>Fink &amp;amp; Walter GmbH, Mechweiler, Germany</td><td>1671801</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&amp;nbsp;</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td><td>1320422</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-SMA-AL488</td><td>eBioscience, San Diego, CA USA</td><td>53-9760-82</td><td>Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)</td></tr></tbody></table>

isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering

רשת כלי דם פונקציונלית היא בעל חשיבות המרכזית להישרדות והאינטגרציה של מבני רקמות מהונדסים. לשם כך, מספר אסטרטגיות אנגיוגנזה ו prevascularization הוקמו. עם זאת, רוב הגישות מבוססות תאים כוללות גוזלת זמן במבחנת צעדים ליצירת רשת כלי דם. לפיכך, הם אינם מתאימים נהלי צעד אחד תוך ניתוחיים. רקמת שומן הנגזרת שברי כלי דם (ad-MVF) מייצג יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות בקלות לבודד מרקמות שומן ולהציג מורפולוגיה microvessel פונקציונלית. יתר על כן, הם להרכיב מחדש במהירות לתוך רשתות כלי דם חדשות לאחר השתלת in vivo. בנוסף, אד-MVF הוכח לגרום lymphangiogenesis. לבסוף, הם מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal, אשר עשוי לתרום לפוטנציאל כלי הדם הגבוה שלהם. במחקרים קודמים אנו הדגמנו את vascularizati המדהיםעל יכולת של MVF מודעת תחליפי עצם ועור מהונדסים. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על פרוטוקול סטנדרטי עבור הבידוד אנזימטי של אד-MVF מרקמות שומן בעכברים.

במחקר הנוכחי ביצענו שש פרוצדורות בידוד אד-MVF עם רקמת השומן בין 7 ל wild-type זכר בן 12 חודש C57BL / 6 עכברים (משקל הגוף הממוצע: 35 ± 1 g). איור 1 מדגים את הקצירה של רפידות שומן epididymal בעכברים עם בידוד מכנים האנזימטית שלאחר מכן אד-MVF. הזמן הדרוש קצירת השומן היה 30 דקות ו לבידוד של אד-MVF היה 120 דקות. בסך הכל, ההליך לקח 150 דקות. אנו קוצרים 1.2 ± 0.1 מיליליטר של רקמת שומן לכל חיה תורמת. סכום זה של שומן אפשר הבידוד של 42,000 ± 2000 אד-MVF לכל מיליליטר. אורכו הממוצע של-MVF המודעה הבודד היה 42 ± 1 מיקרומטר (איור 2 א). משך עיכול אנזימטי נקבע על ידי אמצעי השליטה מיקרוסקופית כפי שמוצג באיור 2B. אד-MVF הציג מורפולוגיה microvessel טיפוסית עם Ves ההיררכימגזרי SEL (איור 2C). אנחנו גם שאפיינו את המודעה-MVF באמצעות cytometry זרימה. לשם כך, אד-MVF היה מתעכל נוסף לפתרון ניתוק תא למשך 30 דקות לתוך אחד תאים 15. תזרים cytometric הניתוח גילה כי ad-MVF לכלול 26 ± 2% תאי אנדותל חיובי CD31, 17 ± 2% יקטינו שריר α-חלקה (SMA) תאי perivascular -positive, ו 9 ± 1 תאי% חיוביים עבור הסמן בתאי גזע mesenchymal CD117 (איור 3A-C). לאחר זריעת על תחליף עור עורי, אשר היה קבוע מחולק באופן מיידי עבור ניתוחים היסטולוגית, גדול אד-MVF היו נקודתיים בעיקר על פני השטח של השתל (איור 3D). עם זאת, פלחי כלי נימים יכולים גם להתגלות בתוך הנקבוביות שלה. מכתים immunohistochemical-MVF מודעה זורע עוד חשף תצורת microvessel פיסיולוגי עם arteriolar, venularושברים דמויי נימים (האיור 3E). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig1.jpg" /> איור 1: בידוד אד-MVF. א) בעקבות פיום קו האמצע, ריפוד השומן epididymal (כוכביות) מזוהים. רקמת השומן היא שנקטפה עם מספרי הכנה קטנים החי הוא הקריב ידי חתך של אב העורקים בבטן (חץ). B) מִצטַעֲצֵעַ מכניות של רפידות שומן עם מספריים בסדר עד השעית הרקמות מופיעה הומוגנית. ג) עיכול אנזימטי, collagenase מתווסף השעית הרקמות. ד) השעית תא-כלי מודגרות ואת שומן supernatant השכבה נמחקת. לאחר צנטריפוגה E), גלולה המכילה אד-MVF הוא resuspended והוא יכול לשמש עבור יישומים שונים, כגון ניתוח חוץ גופית של microvascהיווצרות רשת ular או הזריעה של אד-MVF על פיגומים להשתלת in vivo לתוך פגמי רקמות (F). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig2.jpg" /> איור 2: מאפיינים מורפולוגיים של אד-MVF. א) חלוקת אורך-MVF מודעה המבודד טרי. ± ממוצע סטיית התקן של הממוצע (n = 6). B) תמונה מיקרוסקופית של משטח השעית תא-כלי עם גדול (חץ), בינוניים (חצים כפולים) וקטן (ראשים חץ שחור) אד-MVF כמו גם תאים בודדים (ראשי חץ לבנים). סרגל קנה מידה = 110 מיקרומטר. הגדלה גבוהה מגלה כי התערוכה אד-MVF מורפולוגיה microvessel בוגרת עם פלחי microvessel היררכית (C, <strong&gt; הבלעה של B). בר סולם: C = 50 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig3.jpg" /> איור 3: תזרים Cytometric, היסטולוגית מאפייני אימונוהיסטוכימיים של אד-MVF. AC) זרימה cytometric מנתח של תא האנדותל CD31 חיובי הממחישות-MVF מודעה מבודדים טרי (א), α-SMA-חיובי תא perivascular (B) ו CD117 חיובי תאי גזע mesenchymal (C שברים). שולט אלוטיפ זהה מתאים שמשו להתאים רמות סף. ± ממוצע סטיית התקן של הממוצע (n = 6). D) Hematoxylin וסעיף מוכתם eosin של תחליף עור עורי זרע. כמה מגזרים כלי נימי ממוקמים השתל &amp;# 39; s נקבובית (ראשי חץ). גדול microvessels עם venular (חץ כפול) או arteriolar (חץ) מורפולוגיה הם נקודתיים על פני השטח שלה. בר סולם = 40 מיקרומטר. קו שבור = גבול שתל. E) אפיון של אד-MVF באמצעות זיהוי אימונוהיסטוכימיים של הסמן תא האנדותל CD31 (אדום) ואת α-SMA סמן תא perivascular (ירוק). גרעין התא הוכתמו פלורסנט לצבוע מחייב-DNA (כחול). אד-MVF arteriolar (חץ) מאופיינים עבה שכבת התאים α-SMA-חיובי בהשוואה venular שברי עם לומן גדול (חץ כפול). ראשי חץ = נימי אד-MVF. בר סולם = 25 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55721/55721fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering at JoVE.com

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

isolation-murine-adipose-tissue-derived-microvascular-fragments-as

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  Saarland University.  אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות. 

Video: Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Biology

בידוד והפרדה מגנטית של תאי גזע מסוג +Murine CD34 מדופן כלי הדם

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

מחבר זרקור: בידוד ואפיון משופרים של תאי גזע מסוג Murine CD34+ תושב דופן כלי הדם באמצעות ציטומטריית זרימה מצומדת להקרנת חרוזים מגנטיים

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

Medicine

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

בידוד חצי אוטומטי של רקמת שומן לבנה מורין

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

מחבר זרקור: בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה מרקמת שומן לבן מורין באמצעות דיסוציאטור רקמות  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34⁺ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34⁺ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34⁺ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות