Microwell 배열은 미국 에너지 부 기본 에너지 과학 사무실의 Nanophase Materials Sciences 사용자 시설 부문 센터에서 제조 및 특성 분석되었습니다. 이 연구에 대한 재정 지원은 Oak Ridge 국립 연구소의 연구 개발 기금을 통해 제공되었습니다. 저자들은 또한이 연구에 사용 된 P. aeruginosa 균주의 공급에 대해 J. Mougous Laboratory (Washington, Seattle, WA)에 감사 드리고자 합니다.

<ol>
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이 기사에서는 박테리아 공동체 개발에 대한 높은 처리량 및 고감도 생체 이미징 기반 분석을 가능하게하도록 설계된 마이크로 웰 어레이 장치 및 실험 프로토콜을 발표했습니다. 여기 시위의 초점은 지역 사회 개발에 접촉 매개 형 VI 형 분비의 효과를 연구하는 것이었지만, 배열은 유연하고 다양한 미생물 군집 및 미생물 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 수용하도록 설계되었습니다. 여기에서의 작업은 구성원의 풍부함과 위치를 쉽게 추적 할 수 있도록 형광성 마커를 구성 적으로 표현하는 박테리아의 사용에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 화학 환경을 변화시킴으로써 성장 또는 섭동 후에 개별 우물에서 생물학적 물질을 샘플링 할 수있는 기회는 원칙적으로 지역 사회 조성 및 유전자 발현을 확인하는데 사용될 수있다. 각 실리콘 장치는 다양한 웰이있는 마이크로 웰을 포함하는 수십 개의 어레이로 구성됩니다.직경은 2x, 3x 또는 4x 직경 피치로 구성되며 3 &amp; 3.5μm 사이의 깊이로 에칭됩니다. 양분 및 이차 대사 산물은 아가로 오스 덮개를 통해 자유롭게 확산 될 수 있기 때문에 마이크로 웰 사이의 신호 전달이나 지역 영양염 고갈이 지역 사회 개발에 미치는 영향을 조사하기 위해 다양한 피치 하위 배열이 포함되었습니다. 이 시연에서, 성장 및 지역 사회 개발은 마이크로 웰 간격이나 배열 내의 위치에 의해 영향을받지 않는 것으로 보입니다. 얕은 깊이는 모든 미생물 성장 및 발달을 단일 이미지 평면으로 제한하여 이미지 분석을 단순화하기 위해 선택되었습니다. 그러나 깊이가 깊은 우물 (20μm 깊이)은 이전에 사용되어 실리콘 에칭 프로세스의 지속 시간을 변경하여 깊이를 쉽게 조절할 수 있습니다. 웰의 종횡비를 증가시키는 것은 본질적으로 웰의 내부에서 세포가 겪게되는 감금의 정도를 변경하여 총 웰 볼륨의 비율을 효과적으로 변화시킨다양분이 우물의 꼭대기로 확산되는 영역으로. 이러한 다양한 배열 구성은 well-to-well 또는 intra-well 신호의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 마이크로 웰을 제조하기 위해 실리콘을 사용하는 한 가지 한계는 가시광에 불투명하다는 것입니다. 따라서 빛의 전달 ( 예 : 명 시야, 위상 또는 미분 간섭 조영 이미징)에 의존하는 일상적인 분석은 성장을 모니터하는 데 사용할 수 없습니다. 우리 그룹의 지속적인 연구 및 개발은이 실리콘 마이크로 웰 구성과 투명 어레이 작업을위한 실험 프로토콜을 적용하여 모니터링 및 정량화를위한 ​​고해상도 형광 및 명 시야 이미징을 가능하게했습니다. 유리 커버 슬립에 SU-8 에폭시와 같은 제조용 투명한 물질을 사용함으로써 짧은 작동 거리에서 작동하는 목표로 명 시야 및 형광 이미지를 모두 얻을 수 있습니다.이를 통해 실리콘 어레이의 경우처럼 한천 레이어를 통한 이미징의 어려움없이 ≥ 40X 배율의 수침 또는 오일 목표물을 통해보다 최적의 해상도를 얻을 수 있습니다. 우리 선행 연구에서 설명한 바와 같이, 파종 조건과 우물 구조는 웰 어레이 내의 세포 파종에 영향을 미친다. 낮은 파종 밀도 또는 작은 우물에서 개별 우물에로드되는 세포의 수와 유형의 높은 수준의 변화로 실험 매개 변수 공간을 광범위하고 신속하게 탐사 할 수 있습니다. 보다 높은 파종 밀도 및 / 또는 큰 웰을 이미징하는 것은 세포 유형 및 총 접종 물 수준의보다 일정한 비율을 산출하여 많은 실험 복제물의 분석을 가능하게한다. 초기 성장 단계의 이미지를 간략히 살펴보면 세포가 주로 우물의 가장자리를 따라 부착되고 성장한다는 것을 알 수 있습니다 ( 그림 5a ). 이것이 s와 관련된 유물인지는 명확하지 않다.씨앗을 뿌리는 동안 증발 건조 또는 여러 가장자리에 세포 부착 선호를 제안합니다. 결정적 방식으로 우물의 지형 또는 표면 화학을 의도적으로 변경하면 어떤 요소가 세포 부착 및 생물막 형성에 가장 큰 영향을 미치는지 알 수 있습니다. 이러한 우물에서 박테리아의 성장은 R2A 매체가 주입 된 아가로 오스 겔 코팅 유리 coverslip의 사용에 의해 지원됩니다. 이 아가로 오스 코팅 coverslip을 만드는 방법은 이미지를 통해 균일 한 z- 위치를 보장하여 여러 개의 실리콘 칩을 동시에 이미지화 할 수 있습니다. 겔화 제로 초 고순도 아가로 오스를 사용하고 완전한 배지가 아닌 최소 배지를 사용하면보다 깨끗하고 자체 형광성이 적은 백그라운드를 생성하여 전반적인 신호 대 잡음비를 높일 수 있습니다. 미생물 군집의 양적 추적을 위해 형광에 의존 할 때,일관된 조건과자가 형광, photobleaching 및 비 균일 조명에서 기여를 잘 알고 있어야합니다. 또한, 긴 시간 경과 이미지 획득을 필요로하는 실험을 위해, 여기서 사용되는 것과 같은 아가로 오스의 두꺼운 층이 바람직하다. 고배율 이미징을 가능하게하기 위해 더 얇은 층 (~ 100 μm 두께)을 만들 수 있습니다. 그러나 얇은 층이 마르지 않도록 습기를 충분히 유지하는 것은 어렵습니다. 성장 매개 변수 및 초기 접종 수준에 대한 초기 분석이 여기에 설명 된 단순한 시스템에 대한 중요한 상관 관계를 아직 밝히지는 않았지만, 제시된 프로토콜 및 데이터는 시간이 지남에 따라 지역 사회 개발의 이미지에서 추출 할 수있는 정보의 깊이를 강조합니다. 우물 내부의 공간적 구성은 단일 종 (single-species)의 식민지가 최초의 &quot;핵 형성 (nucleation)&quot;사이트로부터 확장됨에 따라 진화한다. 따라서, 초기 부착 밀도와 관련된 요소 ( 즉, 페밍 형태우물 표면에 대한 한 종의 선호도가 다른 것보다 높은 ps) 또는 개별 패치의 성장률은 지역 사회 개발에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 성장 과정에서 매우 늦게 수립 된 종 (패치) 간의 접촉으로 중재 된 것과 같은 더 복잡한 상호 작용은 이미지 데이터에 대한 심층 분석을 요구할 수 있습니다. 여기에 제시된 마이크로 웰 어레이 플랫폼 및 프로토콜은 미생물 군집 개발 및 미생물 - 미생물 상호 작용의 신속한 조립 및 고 - 내용 분석을 용이하게합니다. 한천 뚜껑 내의 배지 구성을 변경하거나 통합 된 미세 유체 장치를 통해 직접 변조 및 샘플링함으로써 지역의 화학 환경을 제어 할 수있는 미래의 연구는 자연적 감금 및 틈새 크기를 모방 한 것 이상의 실험적 프로토콜을 허용해야합니다. 자연에서 발견되는 것과 유사한 동적으로 변화하는 환경의 영향을 탐구하십시오. 미래의 일은 증가 할 것이다.지역 화학 환경을 동적으로 조절하고 개별 우물에서 시료를 채취하는 데 사용할 수있는 통합 마이크로 유체 장치를 갖춘 어레이 설계. 커뮤니티 성장의 고해상도 및 명 시야 추적에 사용할 수있는 광학적으로 명확한 마이크로 웰 어레이의 개발에 대한 추가 작업은 다른 곳에서 설명되었습니다 27 .

미생물 군집은 환경의 구조, 세포 사멸, 분열, 단백질 농도, 세포 소기관 수 및 돌연변이와 관련된 확률 적 과정과 같은 결정 론적 요인에 의해 형성된다. 자연 환경에서 이러한 영향이 지역 사회의 구성과 활동에 미치는 영향을 분석하는 것은 거의 불가능합니다. 자연 구조에 의해 가려지고 화학 및 생물학적 환경에 묻혀 지역 공동체 구성원을 확인하고 자연 환경 내에서 시공간적 분포를 해결하는 것은 매우 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 노력은 지역 사회 기능에 대한 공간 조직의 중요성을 강조하고 진행중인 연구 2 , 3 , 4 에서 회원 수와 조직 모두를 설명 할 필요성을 지적했다. 그것( 예 : 토양 구조, 식물 뿌리, 해양 입자 또는 장 미세 덩어리), 산소의 존재 또는 부재, 그리고 미생물의 도입과 같은 화학적 환경 ( 즉 , 영양소와 이차 대사 산물의 이용 가능성) 병원성 종은 모두 미생물 군집의 구성, 구조 및 기능에 영향을 미친다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 그럼에도 불구하고 이러한 요소를 포착하는 것을 게을리하는 전통 문화 기술은 계속해서 널리 퍼집니다. 공동체 구성 ( 예 : 공존하는 종의 존재), 물리적 부착, 신호 분자 농도 및 직접 세포 - 세포 접촉은 모두 미생물 군집 형성에 중요한 요소이며 c예방 적 문화 조건. 이러한 특성은 대량 액체 배양 또는 한천 플레이트에서 복제하기가 어렵습니다. 그러나 자연 환경의 주요 물리적 및 화학적 특성을 복제 할 수있는 미세 유체, 미세 패터닝 및 나노 제작 기술을 이용할 수있게 됨으로써 많은 연구자들이 박테리아 공동체를 구축하여 상호 작용을 연구하고 상호 작용을 연구하고 합성 환경을 개발할 수있었습니다. 자연 조건 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20을 모방한다. 이 프로토콜은 microwell 배열 장치를 조작하는 방법을 설명하고 th 기능화하는 데 사용할 수있는 자세한 실험 절차를 제공합니다e 웰을 배열하고 박테리아를 단일 종의 식민지와 다중 구성원 공동체로 성장시킬 수 있습니다. 이 연구는 또한 형광 리포터 단백질을 생산하기 위해 변형 된 박테리아가 시간이 지남에 따라 웰 내의 박테리아 성장을 모니터링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. 유사한 배열이 이전에 제시되었고 마이크로 웰에서 녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa) ( P. aeruginosa) 의 단일 종 콜로니의 성장을 추적하는 것이 가능하다는 것을 보여 주었다. 웰 크기와 파종 밀도를 조절함으로써 초기 접종 조건이 박테리아의 성장 능력에 어떻게 영향을 주는지를 결정하기 위해 수 천 번의 성장 실험의 시작 조건을 병렬로 변화시킬 수 있습니다 21 . 현재 연구는 다중 배열의 동시 비교를 가능하게하고보다 견고한 실험 프로토콜을 사용함으로써 이전 연구를 기반으로하는 마이크로 웰 어레이의 약간 수정 된 버전을 사용합니다. 이 저작물에 사용 된 배열은 여러 개의 하위 배열 또는 배열 ensem을 포함합니다.(직경 2x, 3x 및 4x의 우물 직경)로 배열 된 직경이 15 - 100 μm 인 다양한 크기의 우물을 포함하고 있습니다. 어레이는 실리콘으로 에칭되고, 실리콘 어레이에 시드 된 박테리아의 증식은 매체 주입 아가로 오스 겔로 코팅 된 커버 슬립으로 어레이를 밀봉함으로써 가능해진다. Type Ⅵ 분비 시스템을 연구하기 위해 설계된 P. aeruginosa 돌연변이 체는이 시연에서 사용됩니다. 여기에 제시된 결과는 마이크로 웰 어레이 내에서 다중 구성원 커뮤니티를 분석하는 궁극적 인 목표를 향해 만들어졌으며 연구원은 화학 환경을 제어 및 프로빙하면서 현장 에서 박테리아의 풍부 성과 조직을 모니터링 할 수있었습니다. 이것은 궁극적으로 지역 사회 개발과 승계를 지배하는 &quot;규칙&quot;에 대한 통찰력을 제공해야합니다.

<table><tbody><tr><td>Parylene N</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>CAS NO.:1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>Parylene coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>WRS Materials</td><td>100mm diameter, 500-550&amp;mu;m thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&amp;lt;100&gt;,</td><td></td></tr><tr><td>adhesion promoter</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 adhesion promoter</td><td></td></tr><tr><td>postive tone photoresist</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow)</td><td>Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>Reactive Ion Etching Tool</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher</td><td></td></tr><tr><td>R2A Broth</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Automated Stage</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top environmental control chamber</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 coverslip</td><td>Nexterion</td><td>High performance #1.5H coverslips</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Reference Slides</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>Physical Stylus Profilometer</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>lab wipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td><td></td></tr><tr><td>commercial software</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filter cubes</td><td>Nikon</td><td>Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform

미생물 군집의 개발은 공동체 구성원의 공간 분포와 활동을 극적으로 바꿀 수있는 복잡한 결정 론적 요인과 확률 론적 요인의 조합에 달려있다. 우리는 수천 개의 세균 공동체를 신속하게 조립하고 추적하는 데 사용할 수있는 마이크로 웰 어레이 플랫폼을 개발했습니다. 이 프로토콜은 플랫폼의 유용성을 강조하고 플랫폼 내의 배열 앙상블 내에서 간단한 2 인 커뮤니티의 개발을 광학적으로 모니터링하기위한 용도를 설명합니다. 이 시연은 유형 VI 분비 병원성을 연구하기 위해 개발 된 일련의 돌연변이 체의 일부인 Pseudomonas aeruginosa 의 두 가지 돌연변이 체를 사용합니다. mCherry 또는 GFP 유전자의 염색체 삽입물은 각 마이크로 웰 내에서 커뮤니티 구성원의 풍부 성과 위치를 모니터링하는 데 사용할 수있는 별개의 방출 파장을 지닌 형광 단백질의 구성 적 발현을 촉진합니다. 이 프로토콜은 상세한 메토d 어레이의 우물에 박테리아의 혼합물을 조립하고 시간 경과에 따른 각 구성원의 상대적 성장을 측정하기 위해 시간 경과 형광 이미징 및 정량적 이미지 분석을 사용합니다. 마이크로 웰 플랫폼의 파종 및 조립, 어레이 내 미생물 군집의 정량 분석에 필요한 이미징 절차 및 모두 논의 된 미생물 종간의 상호 작용을 밝힐 수있는 방법.

여기에 제시된 실험 플랫폼은 박테리아 공동체에 대한 높은 처리량과 높은 함량의 연구를 위해 고안되었습니다. 이 설계로 인해 다양한 크기의 우물에서 자라는 수천 개의 공동체를 동시에 분석 할 수 있습니다. 이 마이크로 웰 어레이 디자인을 사용하면 초기 종자 밀도, 우물 크기 및 화학적 환경에 대한 최종 커뮤니티 구성의 의존성을 결정할 수 있습니다. 이 작업은 마이크로 웰 어레이에서 2 인 커뮤니티의 성장을 보여주고 커뮤니티 구성 및 조직을 분석하는 방법을 제시합니다. 모델 시스템은 P. aeruginosa의 VI 형 분비를 연구하기 위해 Mougous 실험실에서 설계되었습니다. 이 시스템은 GFP 또는 mCherry 형광 기자를 포함하는 몇 가지 돌연변이 균주로 구성됩니다. 이 작품에서는 2 가지 다른 변형을 사용했습니다. 첫 번째는 GFP로 표지 된 ΔretS 돌연변이이며,y는 타입 Ⅵ 분비와 관련된 독성 이펙터 단백질을 발현하여 감수성 세포에서 세포 사멸의 수준을 높입니다. 두 번째는 RFP로 표기된 ΔretSΔtse / i1-6 균주로서, 여섯 개의 알려진 이펙터 단백질을 모두 결실 한 결실 돌연변이이며, 제 6 형 병원체 22 , 23 , 24 에보다 민감한 것으로 나타났다. 각 종의 성장 궤도는 개별적으로 그리고 두 회원 커뮤니티 ( 즉 , 어레이 플랫폼 내의 공동 문화) 내에서 추적되었습니다. ΔretS 및 ΔretSΔtse / i1-6 돌연변이 체를 3 개의 어레이에 각각 시딩하고 또한 1 : 2 비율로 함께 혼합 한 다음 20 시간 동안 매 30 분마다 이미징 하였다. 우물에서의 박테리아 성장은 6, 12 시간 사이에 중단되었다. 형광 이미지 데이터의 예가 도 2 및 도 3 에 도시되어있다. 그림 2 는 직경이 45 μm 인 우물에서 ΔretS 및 ΔretSΔtse / i1-6 균주의 시간 경과에 따른 성장을 보여 주며, 그림 3 은 다양한 크기의 우물에서 약 6 시간의 해독 후 (hps) 동일한 두 구성원 사회의 상태를 보여줍니다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig2.jpg" /> 그림 2 : 시간 경과에 따른 공동 문화 성장 실험의 샘플 이미지. mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (적색) 또는 GFP (ΔretS) (녹색)를 발현하는 P. aeruginosa 의 2 가지 돌연변이 체를 마이크로 웰 어레이에서 2 : 1 mCherry : GFP 비율로 함께 시딩한다. 여기 사진은 45μm 직경의 우물에서 postseeding의 3 번 다른 시점에서 찍은 합성 이미지입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>이 그림의 <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig3.jpg" /> 그림 3 : 마이크로 웰 어레이 장치에 포함 된 웰 직경 범위. 8 시간 동안 성장한 2 인조 사회의 대표 이미지. 일반적으로 mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (적색) 또는 GFP (ΔretS) (녹색) 콜로니는 최소한의 공편화를 나타내며 마이크로 웰의 구별 된 영역 내에 남아 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 측정을 획득하기 전에 미끄러지는 파라볼로이드 배경 빼기가 수행되었습니다. 주어진 실험에서 이미징 된 각 마이크로 웰로부터의 신호가 정량적으로 비교 될 수 있도록 조명 보정 단계가 채택되었다. 이 방법들은 p25를 설명 했다. ImageJ에서 microarray 플러그인을 사용하여 보정 된 이미지에서 국소 백그라운드 신호와 함께 적색 및 녹색 박테리아의 평균 강도를 측정했습니다. 국부적 인 배경 신호를 웰 신호에서 뺀 다음, GFP 신호를 조정하여 P. aeruginosa 공존 배양액 (mCherry ΔretSΔtse / i1-6-only 배열로부터 결정된 자기 형광)의자가 형광을 보정 하였다 . 일단 이러한 모든 보정이 수행되면, mCherry- 및 GFP- 발현 박테리아의 양적 성장 궤도가 그려 질 수 있습니다. 20 및 50 μm 직경의 우물에서의 성장 궤적 예제가 그림 4 에 나와 있습니다. <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig4.jpg" /> 그림 4 : P. aeruginosa 타입 VI 분비 변이체의 단일 및 공동 배양의 성장 곡선.( a 및 d ) 20 μm의 및 50 μm의 우물 각각 GFP - ΔretS monoculture 성장 곡선. ( b 및 e ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 단층 성장 곡선은 각각 20 및 50 μm 웰에서 나타났다. (c 및 f) GFP (녹색) 및 mCherry (적색) P. aeruginosa 균주의 1 : 2 비율 혼합물의 공동 배양. 성장 곡선은 이미지 수집이 시작된 시점부터 약 2 시간 후 (hps) 플롯됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> P. aeruginosa 균주의 단일 및 공동 배양으로부터의 성장 궤적은 웰에서 웰까지의 성장에 약간의 가변성이 있으며,이 가변성은 더 작은 치수의 웰에서 증가한다는 것을 나타낸다. 그러나 평균 강도는 우물에 큰 영향을받지 않습니다ze. ΔretS 균주가 존재할 때 감수성 균주 (ΔretSΔtse / i1-6)의 성장에 극적으로 또는 명백한 부정적 효과가있는 것으로 보이지 않는다. 각 균주의 전체 강도는 감소했지만 이것은 균주의 개별 OD가 아닌 실험을 통해 총 OD가 일정하게 유지되므로 웰의 각 균주의 시작 농도가 더 낮기 때문입니다. 그러나 단순히 성장 궤적만을보고 이러한 우물에서 박테리아의 성장을 이해하는 데 가장 중요한 요인을 파악하는 것은 어렵습니다. 따라서 각 궤도는 수정 된 물류 기능 26 ( 그림 5a )에 적합하여 관련 매개 변수를 추출하여 세균 증식 데이터를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 각 궤적은 초기 신호로 나누어 진 신호의 자연 로그를 취하여 변형되었습니다. 수정 된 물류 기능으로 최대 신호 (A), 최대 신호속도 (μ) 및 지연 시간 (τ)은 각 궤도에 맞추기 위해 사용되었습니다. GFP-ΔretS와 mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 균주 사이의 알려진 상호 작용을 감안할 때, mCherry 균주의 성장이 GFP-ΔretS 균주와의 공존 배양에서 억제 될 것이라는 가설이있을 수있다. 추출 된 매개 변수를 사용하여 GFP 및 mCherry 궤적에서 추출 된 매개 변수 간의 양의 상관 관계 또는 음의 상관 관계를 찾을 수 있습니다. 초기 매개 변수 분석은 이들 종의 공생 배양이 전체 성장에 미치는 영향을 무시할 수 있음을 시사했다. 성장 곡선에서 볼 수있는 가변성은 초기 시딩 밀도와 같은 환경 요인에 기인 할 가능성이 있으며, 작은 시추 직경에서 더 가변적입니다 ( 그림 5b ). 존재로 인한 mCherry 균주에 대한 심각한 부정적인 영향<html> GFP-ΔretS는 관찰되지 않았다. 예를 들어, 최대 mCherry 신호 대 초기 GFP-RFP 신호의 비율을 플로팅 할 때 웰에 GFP-ΔretS의 비율이 더 높았을 때 mCherry 발현이 감소하지 않았습니다. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig5.jpg" /> 그림 5 : 수정 된 물류 방정식을 이용한 형광 성장 궤적. ( a ) 예제 곡선을 정규화 한 다음 최대 강도 (A), 최대 속도 (μ) 및 지연 시간 (τ)의 세 가지 매개 변수를 조정하여 수정 된 논리 방정식에 맞 춥니 다. ( b ) 다양한 직경의 개별 웰에서 초기 mCherry 신호 대 초기 GFP 신호. ( c ) 최대 mCherry 리포터 신호 대 RFP- 발현 박테리아에 대한 GFP- 발현 박테리아의 초기 강도의 비율.ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Mougous 연구실의 이전 연구는 Type VI 분비의 효과가 분비 세포와 감수성 세포 사이의 직접적인 세포 간 접촉을 필요로하고 더 긴 접촉 기간은 더 많은 세포 용해를 초래한다는 것을 나타냈다. 따라서, 우리는이 배열에서 두 돌연변이 체의 기하 급수적 인 성장이이 모델 시스템에서 접촉 매개 된 병원성 효과를 단순히 능가한다고 믿는다. 그러나 모든 크기의 우물에서 GFP와 mCherry를 발현하는 박테리아는 독특한 패치로 자랍니다 ( 그림 2 와 3 ). 따라서 성장률에 초점을 맞추기보다는 접촉 매개 성 병원성 인자를 함유 한 세균 공동체가 공간 분석을 사용하여 더 잘 연구 될 수있다. 예를 들어, focusi보다는웰의 적색 또는 녹색 셀의 총 수를 나타내는 적분 강도에 따라,이 마이크로 웰 형식은 적색 및 / 또는 녹색 픽셀의 수와 위치를 계산할 수있게합니다. 적색 및 녹색 신호가 겹치는 경계에 초점을 맞추어 이들 웰 내의 개별 콜로니 또는 패치의 성장을 분석하는 것이 가능합니다 ( 그림 6a ). 패치 된 패치 크기, 패치 증가율 및 개별 우물 내에서의 패치 중첩과 같은 속성을보다 면밀하게 살펴보기 위해 공동 지역화 이벤트와 가장 가까운 이웃 분석을 수량화 할 수 있습니다. 공간 분석은 고배율 이미징 및 공 초점 현미경에 의해 도움이 될 것이다 ( 그림 6b ). <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig6.jpg" /> 그림 6 : 다른 종의 공간 조직은 Epifluorescent 및 Confocal Microscopy를 사용하여 분석 할 수 있습니다. ( <st롱 (aong)&gt; a) 공 초점 현미경을 사용하여 20 배의 배율 및 0.8의 NA를 갖는 1 개의 100 ㎛ 웰로부터 얻어진 일련의 이미지. 흰색 화살표는 빨강 및 녹색 콜로니가 겹치거나 섞여있는 노란색 영역을 가리 킵니다. 이 지역에서 어떻게 식민지가 성장하는지 분석하면 접촉 기반 병원체를 연구하는 데 흥미로울 것입니다. ( b 및 c ) ~ 15 μm 직경, ~ 7.5 μm 깊은 우물의 공 촛점 이미지 (배율 20 배, NA = 0.8). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55701/55701fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

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8.9K 조회수.  Oak Ridge National Laboratory.  미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다. 

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

연구

생체공학

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

공학

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

생물학

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...