This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).

인간 PBMC를 1. 분리 <ol><li> 헤파린 혈액 수집 튜브를 사용하여 혈액의 30 ~ 50 ml를 수집. 주 : 사용 된 혈액의 양이 관심 항원 특이 적 B 세포의 혈액에서 특정 실험 질문 빈도에 의존한다. 헤파린 혈액은 즉시 처리 또는 처리 다음날, 실온에서 밤새 부드럽게 흔들 수있다. 처리 지연 농축 효율에 거의 영향을 미치지과 생존을 최소의 손실과 관련된다. </li><li> 전혈 1 믹스 : 1 무균 실온 마그네슘과 칼슘없는 인산 완충 식염수 (PBS)로. </li><li> 50 mL의 멸균 원추형 튜브에 실온 밀도 구배 용액 10 ㎖를 추가한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 개방 밀도 구배 병을 저장하지만, 사용 전 실온이. </li><li> 가능하면 느린 설정으로 피펫 총을 설정 및 / 또는 천천히에 아주 작은, 그러나 일관성, 트리거 압력을가두 가지를 혼합하지 않도록주의, 밀도 구배의 상단에 희석 된 혈액의 30 ~ 35 ml의 레이어. 참고 : 희석 된 혈액을 추가하는 것은 일관성있는 꾸준한 흐름을 보장 도움이 될 것입니다 동안 50 ㎖의 가장자리에 피펫의 팁을 배치는 원뿔. </li><li> 브레이크와 20 ° C에서 30 분 동안 400 XG에 원심 분리기이 꺼져. </li><li> 아래의 단핵 세포층을 방해하지 않도록주의, 혈장과 혈소판을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. </li><li> 멸균 피펫을 사용하여 단핵 세포 층 (버피 코트)를 수집하고 별도 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치했다. </li><li> 50 ㎖의 부피로 세포 현탁액을 PBS를 추가한다. 브레이크와 20 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS 10ml에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 카운트하고, 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 생존을 결정합니다. </li><li> 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 10 7 세포 / ㎖와 얼음에 장소를 Resuspend 세포.</li></ol> 세포의 2. 염색 <ol><li> 각 형광 보상 / 해당하는 경우, 필요 FMO 제어 1-2 × 10 6 세포를 제거합니다. 브레이크와 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 나머지. </li><li> 3-6 X 107 세포 / ml의 무균 여과 차가운 FACS 완충액 (PBS + 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.01 %의 아 지드 화 나트륨)에 재현 탁 된 세포 (1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 제거). FACS 버퍼가 찬 것을 확인하고 염색 과정을 통해 얼음에 보관하십시오. <ol><li> 분석을 최적화 할 때 사분로 세포 인구 (AD)를 나눕니다. 농축 / 염색의 특이성을 결정하는데 관심을 이용 분획 B 및 C의 항원 특이 적 B 세포를 풍부 분획 A를 사용하여 항원 특이 적 세포의 빈도 수를 결정하고, 사용 분획 D (2.5 이하 2.6 참조) 농축되지 않은 인구는 수익률의 계산을 가능하게하고 배 농축을합니다. </li></ol></li><li> 인간 FcγR 차단 다시 추가얼음 분수 AD에 에이전트는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합을 방지합니다. 주 : 적절한 조건에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 교차 자성 나노 입자에 결합 된 항 멀리 붉은 형광 염료 항체와 반응 형광 색소를 포함하지 않도록주의, 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 분수의 AD 관심의 표면 항원을 세포에 형광 색소 - 복합 항체를 추가합니다. 참고 :이 근적외선 형광 염료, Cy5에, Cy5.5 및 Cy7 항체 복합체를 포함한다. 추가 된 생존의 얼룩은 고정액의 사용과 호환되어야합니다. 하나 ELISPOT에 의해, 예를 들어, FACS를 이용하여 세포를 분석하고 있지만, 항체 분비 주파수를 결정하고자하지 않는 경우, 항체 표면 염색은 불필요하다. </li><li> 상기 분석의 특이성을 시험 얼음에 30 분 동안 표지 된 항원의 충분한 양 분획 B를 배양 등 그 친 화성을 가진 수용체의 대부분은 적어도10 -6 M이 차단됩니다. 주 : 일반적으로 좋은 출발 농도는 항원의 양의 50 내지 100 배 과량 (예 50-100 μM) 2.6 이하로 충분하다고 판단된다. 비 표지 항원 따라서 풍부한 세포 특이성의 확인을 가능하게하기 단계 2.6에 첨가되는 비오틴 항원에 결합하는이 높은 친화력 모든 B 세포를 차단한다. 이 단계는 상기 단계 2.4과 함께 완료 될 수있다. </li><li> 30 분 동안 얼음 분수 A, B, 및 D 품어에 바이오틴 항원을 추가합니다. 주 : 비 오티 닐화 항원의 농도는 충분한 검출 및 비특이적 와키 세포로부터 세포를 결합 분리를 보장하기 위해 필요한 최적 량을 결정하기 위해 적정한다. 일반적으로 시험에 좋은 시작 농도는 1-5 μM이다. 참고 : 분획 A와 D의 경우,이 단계는 상기 단계 2.4와 동시에 수행 될 수있다. 분수 B의 경우,이 단계는 betw 단계 2.5 (세탁 후 수행해야EEN 단계)는 불필요하다. </li><li> 그러한 streptavidin- 원적외선 형광 염료 및 자성 비드 프로토콜 다른 시약으로 B 세포의 결합을 측정하기 위해 분획 C에서 비 오티 닐화 항원을 생략합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리의 1 ml의 세포 현탁액에 의해 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 후, 5 × 10 7 세포 당 1 ml의 2 % 포름 알데히드에 집중 세포 현탁액을 희석하고 5 분 동안 얼음에 어둠 속에서 앉아 보자. 주 :이 시점에서 세포의 고정은 비 오티 닐화 항원이 절차의 나머지를 위해 BCR 바인딩 유지되도록. 생존 세포 - 예컨대 ELISPOTs 또는 대체 전송에서와 같이 하류 분석을 위해, 정착 단계를 생략. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에 두 번 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기 1 ml의 세포를 씻으십시오. 1 용액에 재현 탁 차가운 FACS는 5 × 10 당 버퍼7 세포. </li><li> 1-2 μg의 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료 / ㎖ 추가 어둠 속에서 20 분 동안 얼음에 품어. 각 애플리케이션에 대한 스트렙 타비 딘의 양을 적정한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 FACS의 5 × 10 7 세포 당 버퍼와 원심 분리기로 두 번 세포를 씻으십시오. 는 자성 비드를 이용하여 농축을 일으키지 않음으로 분획 D 제제는이 시점에서 종료된다. 주 :이 표본은 샘플의 주파수 및 항원 특이 적 B 세포의 수를 결정하는 데 사용된다. 이는 농축에 의해 달성 농축 배 수율을 결정하는 데 사용됩니다. </li></ol> 3. 자기 나노 입자 기반 심화 <ol><li> 40 μm의 필터를 통해 차가운 분리 버퍼 (PBS + 0.5 % BSA + 2mM의 EDTA) 5 × 10 7 세포 당 패스 1 ㎖의 샘플 AC에서 재현 탁 세포는 열을 방해 할 수있는 덩어리를 제거합니다. </li><li> 안티 Cy5에 / 안티 멀리 붉은 형광 염료 나노 입자를 추가합니다. FO최적의 결과를 R, 나노 입자의 농도를 각각 사용 적정되어야하지만 좋은 출발점이 5 × 107 세포 / ㎖ 당 50 μl의 현탁액이다. 10 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 회전합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 1 ml의 차가운 분리 버퍼로 두 번 씻으십시오. 5 × 107 세포 당 냉 분리 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. </li></ol> LS 또는 LD 열을 사용하여 4. 자기 심화 <ol><li> 자기 분리기의 자기장에 세 LS 또는 LD 열을 놓고 열을 적시하는 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가 (열 유형이 가장 적합한 결정하기 위해 제품 설명을 참조). 3 ml의 컬럼을 통과하여 수집 한 후 폐기 할 수 있습니다. 주의 : 자성 나노 입자 표지 된 세포의 분리는 시판되는 자기 분리 장치의 어느 하나에 이용하여 달성 될 수 있지만, 기관은 TE에서 LS 컬럼의 사용에 가장 성공했다수율, 순도 및 농축 효율의 실효. </li><li> 열 아래에 부정적인 선택 세포 표지 세 15 ML 원뿔 튜브 &quot;분수 A / (B) / (C) 음&quot;을 놓습니다. 각각의 컬럼에 자성 입자를 표지 세포를 추가하고 전체 볼륨이 통과 할 수 있습니다. </li><li> 위에 차가운 분리 버퍼의 3 ㎖를 추가하고이 컬럼을 통과하여 2 ㎖로 반복 할 수 있습니다. 음으로 선택된 세포를 수집하고 얼음에 따로 설정합니다. </li><li> 자기장에서 열을 제거하고 긍정적으로 선택한 셀에 대해 &quot;분수 A / (B) / (C) 긍정적&quot;표시 15 ML 원뿔 튜브의 상단에 배치합니다. </li><li> 제공된 플런저를 사용하여 자기장에 결합 된 세포를 수집하는 컬럼을 통해이 체적을 뛰어 즉시 분리 완충액 약 6 ㎖의 상단에 열을 채우고. </li><li> 순도를 높이기 위해 적극적으로 선택된 셀은 상기 proce을 반복하는 초 청정 컬럼을 사용하여 농축 될 수있다틀리면. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에 음과 양으로 선택 분수를 모두 스핀 원하는 최종 부피에서 일시 중지합니다. 이러한 FACS, ELISPOT 또는 입양 전송 등 다운 스트림 분석을 진행합니다. </li></ol>

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	<li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells.">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li><li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers,+beads,+and+surfaces.">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li><li>Haas, W., Schrader, J. 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The authors declare they have no competing financial interests.

여기에서 우리는 고립과 인간의 말초 혈액에서 항원 결합 B 세포의 농축을 달성하기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생쥐 비장 및 림프절과 같은 다른 조직을 용이하게 적용 가능하며, 세포의 표현형 및 기능 (준비 원고)의 후 농축 분석과 호환된다. 사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수있는 변수의 수를 인식해야한다. 경험에서 죽은 세포가 아닌 특정 증가 배경을 선도, 자기 구슬에 충실하고 같은 스트렙 타비 딘 - 원적외선 형광 염료 형광 염료를, &quot;차지&quot;하는 경향이있다. 이 절차를 시작하기 전에 가능한 한 샘플에서 많은 죽은 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 분석에서 게이트 밖으로 사균 라이브 / 죽은 차별 활성화 얼룩의 사용은 유용 할 수 있지만, 사균의 존재가 셀에 주파수를 분비하는 항체 분석법 해석을 손상 할 수 있고입양 전송 다음 함수. 또, 추가 된 비 오티 닐화 항원에주의 적정 항원 특이 및 비 - 특이 적 결합의 구별에 필수적인 것을 발견 하였다. 너무 많은 항원이 거짓 긍정적 인 탐지 / 농축을 일으킬 수있는 반면 너무 적은 항원의 사용은, 항원 결합 세포의 주파수의 과소 평가로 이어질 것입니다. 너무 높은 일이다 항원 농도의 사용은 샘플 비 B 세포에 결합 명백 의해 표시 될 수있다. 또한, 과도하게 높은 주파수 항원 (&gt; 1 %)의 겉보기 검출 반응성 세포 특이성 문제를 결합하는 표시 일 수있다. 사용하는 항원의 최적 량을 결정하는 궁극적 인 목적은, 생리 학적 농도에서 이러한 본 것보다 조금 더 항원을 추가하는 것을 &lt;10-6 M의 친 화성, 예를 들면, 대와 B 세포 수용체의 대부분 항원 포화된다. 이 항원 특이 적 B 세포 (B)임을 보장병원성 잠재력을 가지고 친 화성 검출 eing입니다. BCRS의 항원 직업 감소에 또는 생리 학적 농도 이하, 즉 너무 적은 항원의 첨가로 인해 거의 항원 특이적인 B 세포의 검출 될 수 있습니다. 한편, 지금까지 생리 학적 농도를 초과 너무 항원의 첨가는 항원 (&gt; 10-6 M)에 대한 낮은 친 화성 B 세포를 포함하고 실제로 항원 무지되는 증가 된 비 - 특이 적 결합을 초래할 수 생체있다. 따라서, 먼저 유일하고 진정한 항원 반응 B 세포가 검출되고 있음을 확신하기 위해 몇 로그에 걸쳐 바이오틴 항원을 적정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 우리는 배경을 증가시킬 수 있습니다 너무 많은 스트렙 타비 딘 - 멀리 붉은 형광 염료의 사용을 발견했다. 이 항원의 바이오 틸는 항원 에피토프의 가용성에 영향을 미칠 수있는 유의하는 것도 중요합니다. 따라서, 다른 바이오 틸를 사용하여 최적화 충족hods은 중요 할 수있다. 대안 비오틴 차 아민, 삼차 아민, sulfhydryls 또는 카르복실기에 커플 링 될 수있다. 확장 된 스페이서 아암 길이의 사용은 입체 장애를 감소시킴으로써 에피토프의 유용성을 향상시킬 수있다. 이 기술의 한계 중 하나는 새로운 세포에 비해 냉동 보존에서 항원 - B 세포 농축에 대한 감소 된 효과이다. 이것은 큰 세포 사멸 및 냉동 샘플 연관된 &quot;끈적임&quot;관련 있었다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 고정 된 샘플들에 적용 할 수 있지만, 직접 신선한 냉동 세포 농축 및 분석 결과를 비교할 수없는 가능성 중요하다. 또 다른 한계는 농축 된 시료 중의 항원 특이 적 B 세포의 순도이다. 경험에서, 일부 셀들은 항상 존재하는 &quot;함께 태그&quot;되는 비특이적 B 세포와 T 세포를 모두 포함한다. 이 풍부하게하려고에 셀 인구의 희귀 주어진 예상한다. t의 그러나, 순도그 세포 또는 항원 특이 적 B 세포를 FACS 분류하여 단일 세포 현탁액은 새로운 열의 두 번째 농축, 컬럼에 셀을 추가하기 전에 얻어지는 것을 보장함으로써 증가 될 수있다. 조사의 유형에 따라 옵션을 결정할 수 연구원 최선인지 것이 필요하다. 우리는이 기술을 최적화 된 바와 같이 우리는 항원의 적정 또는 염색 강도에 따라 선호도가 낮은 항원 반응 세포에 비해 높은 친화력의 차별 의무가 될 것이라고 상상. 항원에 대한 친화도의 1000 배의 차이까지 동일하게이 방법을 사용하여 7로 농축 하였다 그러나, 이전의 연구에서, 우리는 항원 - 반응성 B 세포를 나타내었다. 선호도의 지식이 연구에 적절한 경우에 따라서 발현 재조합 항원 수용체의 표면 플라스 몬 공명 분석을 이용하여 농축 된 세포의 친화도의 형식적 측정이 요구된다. 이 기술에 내재 리터입니다비오틴 스트렙 항원의 첨가는 BCR 가교하여 세포를 활성화 할 수있는 모조. 이는 휴식 제어 자극 세포를 비교하기 위해 노력하는 것과 같은 특정 하류 기능 분석에 대한 문제를 제기 할 수있다. 이 문제는 신호의 전달을 방지하는 저온 제어 샘플들을 유지함으로써 완화 될 수있다. BCR 신호가 지속적 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 것도 가능하다. 시험 관내에서 세포를 T로 제시 세포 항원 및 마우스에 대체 전송 후에 ELISPOT 분석 (도 3b) 및 기능에 의해 표시된 바와 같이 환경에서 항원 - 농후 셀 (데이터는 도시하지 않음) 항체를 분비하는 능력을 유지한다. 이 기술에 대한 최종 제약 안티 fluorochome 항체의 사용은 항원 흡착 세포에 결합 된 나노 입자를 달성하는 것이다. 안티 멀리 붉은 형광 염료는 Cy7 및 Cy5.5 포함하여 특정 구조적으로 관련 형광 색소와 상호 반응한다. 이 O 옵션을 제한 할 수 있습니다표현형 마커의 측정에 사용할 수 F 항체 접합체. 그러나, 새로운 형광 색소의 증가 가용성,이 문제가 덜되고있다. 이러한 검출 및 농축 방법을 사용하여 용이하게 생체 외 말초 혈, 비장, 또는 다른 조직에 항원 - 결합 B 세포를 식별 할 수있다. 이 방법은 외부 항원에 대한자가 면역 질환의 설정에서 예방 접종 또는 노출 된 후 항원 반응 세포의 면역 반응을 연구에 특히 유용하다. 항원 반응성 B 세포를 검출 할 수있는 방법은 결점이없는 것으로 증명되지 않았지만, 이러한 방법은 빠르고 간단하고, 하류의 다양한 결합 될 수 항원 반응성 세포의 비교적 높은 순도, 수율 및 농축을 생산 분석. 또한,이 방법의 기본 원리로 인해이 절차에 쉽게 실험의 다양한 요구에 맞추어 질 수있다.

제한 희석하여 항체 - 분비 세포의 전구체 빈도 분석은 특정 항원에 대한 반응성 B 세포는 통상적으로 접종 상태 및 항원 상에 존재하는 항원의 크기 / 수에 따라, 통상의 레퍼토리 0.05 % 내지 0.005의 주파수에서 발생하는 것을 제안했다. 이러한 세포의 낮은 주파수는 어려운 등 외국 항원, 또는자가 면역의 개발 기간 동안 다음과 같은 예방 접종 또는 노출과 같은 면역 반응의 개발 기간 동안 자신의 상태 변화를 연구했다. 이전 연구자가 항원 - 코팅 된 적혈구 리셋 항원 코팅 된 플레이트 또는 열 흡착제로부터 레인 징 기술을 사용하여 항원 - 반응성 B 세포의 분리 맡은 1, 2, 3, 4, 5, 6 정렬 셀을 형광 - 활성화. Thoug이러한 기술은 항원 - 반응성 B 세포를 식별 분리에 성공했다 (H)는, 그 결과 수율, 순도 및 확장 성면에서 다양하다. 최근에 우리는 모두 감지하고 자기 나노 입자를 사용하여 희귀 한 B 림프구의 소집단을 풍부하게 할 수있는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법은 큰 시작 인구에서 상대적으로 높은 수율과 순도 농축 수, 항원에 대한 반응의 분석과 호환됩니다. 현탁액 중의 세포의 집단에서 농축함으로써, 상기 방법은 항원 - 코팅 된 플레이트 또는 열 및 제한 처리량의 구조와 관련된 제약을 제거한다. 농축 된 세포가 항원과 형광 리포터와 관련된 남아 보낸 마지막으로, 이들은 더 FACS 분류에 의해 정제 할 수있다. 여기에 설명 된 바와 같이 우리는 다양한 autoi와 과목에서이 전 말초 혈액 파상풍 톡소이드 반응성 B 세포의 연구와 인체의 다음과 같은 예방 접종에 대한 접근뿐만 아니라,자가 항원 반응 B 세포를 사용했다제 1 형 당뇨병, 그레이브스 병, 하시모토 병 (7)을 포함 mmune 장애. 상기 방법은 마우스 및 인간에서 동일하게 작동하며, 다양한 조직 (제조에서 원고)에서 항원 - 반응성 B 세포 분석과 호환된다. 기본적인 형태로, 말초 혈 단핵 세포를 제 표현형 분석에 필요한 표면 항원 셀하는 항체와 함께 비오틴 항원과 함께 배양된다. 이 라벨링 단계는 세척 및 고정을 한 세포를 결합 오티 닐화 항원 (도 1)의 검출 원적외선 형광 색소에 결합 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여된다. 이전 연구와 유사한 방식으로 항원 특이 적 B 세포를 확인했지만하여 항원 직접 형광 색소 8, 9, 10, 11에 접합. 이 가치이지만방법은 스트렙 타비 딘과 함께 오티 닐화 항원의 사용은 항원 12, 13, 14 작을 때 특히 큰 신호 증폭 (결합 및 비 결합 따라서 세포보다 분화)을 가능하게한다. 추가적인 고려는 스트렙 타비 딘 대신 스트렙 아비딘이 탈글 라이코 실화 때문에, 비특이적 결합을 감소의 사용이다. 또한, 우리는 때문에, 양자 수율 (밝기)의 광 안정성, 그리고 작은 크기 (~ 1.3 kD의)에 형광 색소까지 붉은 형광 염료를 사용합니다. 그들은 잠재적으로 많은 항원 에피토프를 포함하기 때문에 단백질 등의 피코 에리 트린과 같은 형광 색소 (~ 250 kD의)와 알로 (~ 105 kD의) (15)는 최적되지 않습니다. 이러한 원적외선 형광 염료 단일 에피토프로 구성된 작은 유기 형광 염료의 사용은 분리 된 세포 집단의 복잡성을 감소시킨다. 세포가되면 바이오틴-Antigen과 멀리 붉은 형광 염료 스트렙 타비 딘 흡착는, 그들은 안티 - 원적외선 형광 염료 복합 자성 나노 입자를 사용하여 농축된다. 단일 나노 입자는 대부분의 유동 세포 계측기에 의해 검출되지 않고, 따라서 정렬 하류 FACS 분석 (16)에 의해 정제하기 전에 제거 할 필요가 없다. 항원 특이 적 B 세포의 자기 선택은 시간 및 플로우 사이토 미터를 사용하여 희귀 이벤트를 분류 비용을 제거 관심 집단을 풍부. 우리는 이전과 칠일 파상풍 톡소이드 부스터 예방 접종 후 대상에서 파상풍 톡소이드 - 특정 B 세포의 농축 대표 결과를 보여 아래. 우리 생체 자극 급성 다음 항원 특이 적 B 세포 농축이 방법의 기능을 설명하기 위해 예로서, 특정 프로그램을 선택했다. 유동 세포 계측법에 결합하면,이 방법은 농후하고 분화 항원 특이 나이브 메모리 할 수 ​​있고,plasmablast B 세포와는 연구자가 시간이 지남에 따라 빈도의 변화를 수행 할 수 있습니다. 또, 예를 들면 세포가 농축 다음 항체를 분비하는 능력을 유지하는 것을 보여주는 ELISPOT 분석, 다른 가능한 하류 분석을 포함한다. 이 방법의 또 다른 응용 프로그램은 호스트에 풍부한 세포의 입양 전송을 포함 할 수있다. 우리는 이전에 세포를 분리 및 전송 다음 항원 특이 적 T 세포에 항원 제시 세포로 역할을 할 수있는 능력을 유지 보였다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 함께 항원 특이 적 면역 반응의 이해를 알리는 방법으로 결합 될 수있는 가능한 하류 분석법 수있다. 우리는 전체 수율, 순도, 세포의 특이성을 결정하고, 배 농축을하는 컨트롤을 포함하는 방법을 설명했다.

<table><tbody><tr><td>Antigen of interest</td><td>variable</td><td>variable</td><td>At least 100 &amp;mu;g to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier&amp;nbsp; protein free.</td></tr><tr><td>Biotin for labeling; &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>Biotin is available in different formulations, such as those containing&amp;nbsp; various length spacers, so the type used should be determined by the researcher</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Can obtain from other suppliers.</td></tr><tr><td>Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS manual separators</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>variable</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td></td><td></td><td>Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells</td></tr><tr><td>PBS without calcium and magnesium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Whole blood in heparinized collection tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT supplies, if needed</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

순도, 수율 분석 및 배 농축 유동 세포 계측법을 사용하여 필연적으로 streptavidin- 멀리 붉은 형광 염료를 결합하지 않은하지만 매트릭스에 갇혀있다 오염 세포를 포함하는 전술 한 바와 같이 풍부한 인구. 이러한 불순물은 FACS 정렬하여 풍부한 인구에서 제거 할 수 있습니다. 풍부한 인구의 순도를 평가하기 위해, 살아있는 세포에 게이트 앞으로 기반 및 측면 분산 및 / 또는 라이브 / 죽은 얼룩과 멀리 붉은 형광 염료 + 세포 주파수를 분석 할 수 있습니다. 후자의 게이트 내의 비율이 순도를 나타낸다. 이러한 세포의 특이성 항원 친화 추가 분석 클로닝 및 발현 된 면역 글로불린 유전자 서열의 재조합 항체 생산을 분석 하였다 단셀 FACS 정렬을 필요로한다. 수율 격리 antige의 개수를 나타낸다출발 인구 (분획 D)의 수에 대하여 분획에서 회수 된 B 세포를 N 결합. 동일한 수의 셀이 분획 A에는 분획 D에 있었던 이후 하나 직접 수율 (분획 항원 결합 B 세포 분획 D에서 항원 - 결합 B 셀 ÷ 번호 중 #)를 결정할 수있다. 접어 농축 (E)는 &quot;양&quot;풍부한 분획 원적외선 형광 염료 + B 세포의 비율이 값에 의해 달성 항원 특이 적 B 세포의 비례 증가를 나타내는 분획 D.있는 것과 대하여 반사되고 나노 입자 농축. 이 값은 다음 식을 이용하여 구할 수있다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55382/55382eq1.jpg" /> 이 기술을 보여주기 위해, 우리는 모델로 파상풍 톡소이드 (테트 - 독극물)을 사용하여 얻은 대표적인 결과를 보여항원을 감지하고 변화하는 시점에서 파상풍 예방 접종을 한 환자의 말초 혈액에서 테트 - 독극물 반응 B 세포에 대한 풍부합니다. 도 1에있어서, 상기 항원 흡착제의 개략도이다. 도 2a는 10 년 전보다 더 파상풍 예방 접종을 마지막으로 개인의 테트 - 독극물 반응 B 세포의 빈도를 보여줍니다. 도시 우리가 주위에서 결합 세포를 풍부하게 할 수있는이 예에서, 분수 A 및 따라서 분수 D.에서 테트 - 독극물 특정 B 세포의 기본 주파수에서 인구 ( &quot;음&quot;)이 풍부 ( &quot;긍정적&quot;) 및 고갈 7 배와는 농축 비율 4 %의 순도를 달성했다. 그림 2B 3 년 전 ~ 예방 접종을했다 주제의 혈액을 사용하여 반응의 특이성을 보여줍니다. 우리는 되어온 전에 셀에 레이블이없는 파상풍 톡소이드의 50 배 초과 (50 μM)를 추가 할 때비오틴 항원 (분수 B)의 이온은 우리가 결합 항원의 특이성을 보여, 83 %가 결합 차단할 수 있습니다. 우리는 절차 (분수 C)에서 바이오틴 항원, B 세포 여전히 바인딩의 작은 숫자 (~ 0.2 %)을 생략하는 경우; B 세포의 작은 부분이 아마도 예컨대 스트렙 타비 딘 원적외선 형광 염료, 항 원적외선 형광 염료 항체 또는 자성 비드, 흡착제에 일부 비 - 항원 결합 반영한다. 부스터 후 우리는 그림 3 순진, 메모리 테트 - 독극물 특정 B 세포의 주파수에 표시 항원 결합 세포 표현형 다음과 같은 예방 접종의 변화, 그리고 전에 그린 혈액 plasmablast 인구 7 일을 분석하는 방법의 사용을 설명하기 위해 건강한 환자의 예방 접종. 총 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 중에서 나이브 B 세포의 비율은 과급 후 64 %로 84 %로 감소하는 동안의 비율 memor총 구정 독극물 반응 세포 사이에 y를 plasmablast 인구는 각각 40 % 36 % 0 % 16 % 증가. 도 3b는 7 일 후 부스트 건강한 대상에서 말초 혈액 대표 ELISPOT 데이터를 보여줍니다. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 분리는 파상풍 톡소이드 항체를 분비하는 세포 주파수의 4 배 농축되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig1.jpg" /> 그림 1 : 탐지 및 B 세포 - 결합 파상풍 톡소이드 (구정 독극물)의 농축을위한 방법. 테트 - 독극물 결합 B 세포의 농축 및 분리를위한 (A) 프로토콜. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포를 식별하고 풍부하게 사용될 흡착제 (B) 다이어그램. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55382/55382fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> N-페이지 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig2.jpg" /> 그림 2 : 구정 인간의 말초 혈액에서 B 세포를 독극물이 결합의 농축을 보여주는 대표적인 cytograms. 농축의 (A) Cytograms 및 분수 A와 마지막 예방 접종&gt; 십년 이전에 정상적인 주제에서 분수 D에서 총 테트 - 독극물 반응 B 세포로부터 고갈 구정 독극물 반응 B 세포. 50 μM의 초과와 미리 배양 한 후 A (분수 A) 3 년 전 ~ 예방 접종과 같은 풍부한 주제에서 &quot;긍정적 인&quot;인구에서 PBMC를의 (B) Cytograms는 구정-TOX (분수 B)를 레이블이 지정되지 않은, 또는 농축 절차 (분수 C) 동안 생략 테트 - 독극물 비오틴과 함께. 모든 분석은 CD19 + 림프구에 문이 있었다. 백분율은 마지막 부분에있는 모든 B 세포 (CD19 +)의 테트 - 독극물이 결합 세포의 비율을 나타냅니다.ANK &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55382/55382fig3.jpg" /> 그림 3 : 항원 결합 세포의 후 농축 분석의 예. 테트 - 톡스 바인딩 B 세포 농축 다음 세포 표현형 (A) 주제 유세포 분석. 메모리 (CD27의 +)와 B 세포 전에 피사체의 소집단 및 파상풍에 대한 부스터 접종 후 7 일 plasmablasts (CD27 + CD38 ++) - Cytograms은 (CD27) 테트 - 독극물 반응 순진한의 식별 및 분석을 묘사한다. 모든 세포는 풍부한 &quot;긍정적 인&quot;인구에서 CD19 + 림프구에 문이 있었다. (B) 칠일 보 후의 건강한 환자의 말초 혈액으로부터 농축 고갈, 총 농축되지 않은 B 세포 분획의 세포 분비 된 항체의 대표적인 ELISPOT 분석OST. ELISPOT 분석을 위해, 96- 웰 플레이트의 웰 제 파상풍 톡소이드로 10 μg의 / ㎖의 용액으로 코팅 하였다. 세포 현탁액의 두 배 연속 희석는, 농축 고갈, 총 농축되지 않은 분수에서 동일 농도에서 세포로 시작 (접시에서) 우물에서 만들어졌다. 항 파상풍 항체를 분비하는 세포는 스트렙 타비 딘-AP 다음 바이오틴 안티 - 인간 IgG (H &amp; L)로 검출되었다. 플레이트를 ELISPOT 개발 완충액으로 개발되었으며 반응물 O. 선형 범위의 셀 희석 스폿의 수가 결정되었다 이중 증류 H 2 플레이트를 세 번 세척하여 정지시키고,의 ASC의 수를 계산 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55382/55382fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K 조회수.  University of Colorado School of Medicine.  기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다. 

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Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

생물학

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of antigen-specific T cells, B) probe the dynamics of antigen-specific responses, C) understand how antigen-specific responses affect disease state such as autoimmunity, D) demystify heterogeneous responses for antigen-specific T cells, or E) utilize antigen-specific cells for therapy. The tool is based on a magnetic particle that we conjugate antigen-specific and T cell co-stimulatory signals, and that we term as artificial antigen presenting cells (aAPCs). Consequently, since the technology is simple to produce, it can easily be adopted by other laboratories; thus, our purpose here is to describe in detail the fabrication and subsequent use of the aAPCs. We explain how to attach antigen-specific and co-stimulatory signals to the aAPCs, how to utilize them to enrich for antigen-specific T cells, and how to expand antigen-specific T cells. Furthermore, we will highlight engineering design considerations based on experimental and biological information of our experience with characterizing antigen-specific T cells.

Antigen-specific T cells are difficult to characterize or utilize in therapies due to their extremely low frequency. Herein, we provide a protocol to develop a magnetic particle which can bind to antigen-specific T cells to enrich these cells and then to expand them several hundred-fold for both characterization and therapy.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

공학

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and the use of four-arm, fluorescent PEG-antigen conjugates to selectively identify antigen-specific B cells through avid engagement with cognate B cell receptors. Using modular click chemistry and commercially available fluorophore kit chemistries, we demonstrated the versatility of preparing customized fluorescent PEG-conjugates by creating distinct arrays for proteolipid protein (PLP139-151) and insulin, which are important autoantigens in murine models of multiple sclerosis and type 1 diabetes, respectively. Assays were developed for each fluorescent conjugate in its respective disease model using flow cytometry. Antigen arrays were compared to monovalent autoantigen to quantify the benefit of multimerization onto PEG backbones. Finally, we illustrated the utility of this platform by isolating and assessing anti-insulin B cell responses after antigen stimulation ex vivo. Labeling insulin-specific B cells enabled the amplified detection of changes to co-stimulation (CD86) that were otherwise dampened in aggregate B cell analysis. Together, this report enables the production and use of fluorescent antigen arrays as a robust tool for probing B cell populations.

This protocol details the customizable production and use of fluorescent probes for labeling antigen-specific B cells.

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and ...

생체공학

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Isolation and Characterization of Antigen-Specific T cells in Mouse Lungs(마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포의 분리 및 특성 분석)

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

저자 스포트라이트: Tetramers를 사용하여 마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포를 검출하기 위한 최적화된 프로토콜

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...