Name: a protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (dipg)
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG at JoVE.com

저자는 기꺼이 맥 케나 클레어 재단, 신경 질환 및 뇌졸중 (NINDS K08NS070926 및 R01NS092597)의 국립 연구소의 지원을 인정, 국방부 (NF140075), 재생 의학 (CIRM RB4-06093 및 RN3-06510), 알렉스의 레모네이드에 대한 캘리포니아 연구소 재단 스탠드, 큐어는 피오나 페넬로페의 WAYLAND 빌라 DIPG 재단, 딜런 Jewett의 메모리 지금 재단과 DIPG 협력, Lyla Nsouli 재단, 해명 소아 암, 소아 뇌종양 재단, 마태 복음 라슨 재단, V 재단 실어 가족 기금 시작 , 소아의 코너 존슨, 조이 가네, 딜런 프릭, 아비가일 젠슨, 제니퍼 크란츠 기념 기금, N8 재단, 버지니아와 암 연구 DK 루드비히 기금, 스탠포드 앤 T.에서 아동 보건 연구소와 로버트 M.베이스 기부 학부 장학금 암 및 혈액 질환.

이 프로토콜은 모든 환자 데이터의 적절한 드 식별과의 제도적 검토 보드에서 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 승인을 수행하고있다. 이전에이 프로토콜 작업에 대한 환자의 가족에서 모든 해당 기관 검토위원회의 승인과 동의를 얻습니다. 1. 조직 샘플을 얻기 참고 :이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 부검시 즉시 시작하는 조직 기증의 적절한 처리가 필요합니다. 전체 샘플 가능성은 즉시 항생제 / 항진균제로 보충 적절한 냉각 매체로 조직을 전송의 사후 간격 (PMI)를 최소화하는 교통 전반에 걸쳐 젖은 얼음에 샘플을 유지하고, 프로토콜에 걸쳐 무균 기술을 유지에 크게 의존한다. <ol><li> 통지시임박한 기부의 샘플 채취 키트를 준비합니다. 다음의 재료는 직접 조직 샘플의 복귀 운송을 위해 사용될 수있는 단열 용기 운송 박스를 포함하여 : <ol><li> 멸균 장갑, 커튼, 그리고 메스를 포함하여 멸균 준비를위한 자료를 포함합니다. </li><li> 얼음이나 차가운 팩 단열 용기에 30 mL의 전달 매체를 포함하는 10 멸균 50 ML 원뿔 튜브 - (8)를 포함합니다. 주 : 표준 세포 배양 배지가 작동 할 수 있지만, 가장 가능성이 샘플 항진균제 / 항생제가 보충 절전-A로 구해진다. </li><li> 다른 분석 (예를 들어, 고정 제)에 대한 추가 샘플 튜브를 포함합니다. </li><li> 부검은 연구자의 사이트에서 수행하지 않을 경우, 명확하게 종양 샘플을 수집하는 방법을 내용의 문서를 포함한다. 이는 너와 같은 중뇌 및 수질에서 샘플을, 불임을 유지 젖은 얼음 샘플 튜브를 유지, 등 등의 세부 사항을 포함MOR 세포는 종종이 지역을 침공. </li></ol></li><li> 부검 동안 불임을 유지한다. 두개골 내부의 무균 뇌를 고려, 그래서 두개골이 열려 번 (변경 장갑 포함) 멸균 기술을 관찰합니다. 피부와 머리 오염을 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 복부 측면에서 종양 해부 (뇌교의 &quot;배&quot;를 보충 그림 1 참조). 멸균 메스로 종양에서 작은 1cm 덩어리를 잘라 즉시 차가운 배송 미디어 (단계 1.1.2의 주 참조)로 전송하고 젖은 얼음에 넣어. 40 mL를 각 튜브의 조직과 미디어의 최종 부피 결과, 각각의 튜브에 조직의 10 ㎖를 놓습니다. 주 : DIPG의 경우에는 종양이 확산 자주 뇌교 및 뇌간 나머지 침투. 뇌교에서 - (40㎖의 조직 30) 및 1-4 튜브 - 중뇌 및 골수에서 - (20 ㎖ 조직 10) 각각이 관과 같은 통상적으로 3 포함한 가능한 샘플만큼 수집한다. </li><li> 샘 수집중뇌 및 수질에서 PLES는 종종 많은 종양 세포를 포함하는 뇌교에 병치. </li><li> 샘플 수집 후, 단열 용기에 젖은 얼음 샘플 O / N를 제공. 동결 세포를 죽일으로, 드라이 아이스에 샘플을 제공하지 마십시오. </li></ol> 샘플 처리를위한 2. 준비 <ol><li> 이전 샘플 준비를 시작으로, 1 시간 동안 UV 광 하에서 면도날 곡선 지혈제, 기타 비 멸균 도구와 함께 조직 배양 후드 살균. 배양의 오염을 방지하기 위해 멸균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행한다. </li><li> 준비 및 살균 필터 솔루션을 제공합니다. <ol><li> 1.8 M 수크로오스 용액을 조제 증류수 300 ㎖의 308.07 g 자당을 녹인다. 추가 50 mL의 10 배 칼슘 또는 마그네슘없이 식염수 솔루션 (HBSS)을 Hank&#39;s은 버퍼 증류수를 사용하여 500 mL의 전체 볼륨을 가지고. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 소화 효소 용액을 제조, (5)을0 ㎖의 다진 조직마다 10 ㎖ 칼슘 및 마그네슘 HBSS 500 μL 5 ㎎ / ㎖의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (최종 농도를 50㎍ / ㎖) 500 μL 2.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제의 I / II 및 디스 파제 용액 (최종 농도 25 추가 μg의 / ㎖) 500 μL, 1 M HEPES 완충액. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 소화 솔루션입니다. </li><li> 종양 줄기 미디어 (TSM)베이스를 준비하려면, 250 mL의로 Neurobasal-A, 250 mL의 둘 베코의 수정 된 이글 매체를 혼합 : 식품 혼합물 F12 (DMEM / F12), 5 ㎖의 100 배의 항생제 항진균제, 5 ㎖의 200 mM의 L 알라 닐 L-를 글루타민 디 펩티드 (루타-A), 5 ㎖ HEPES 완충액 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨, 5 ㎖의 100 × MEM 비 필수 아미노산. </li><li> TSM베이스에 다음과 같은 보충제를 추가, 성장 인자와 전체 TSM을 준비하려면 다음을 50 배 B27 보충 마이너스 비타민 A (1시 50분), 인간 표피 성장 인자 (H-EGF, 20 NG / ㎖), 인간 섬유 아세포 성장 인자 (H- FGF 20 NG / ㎖), 인간 혈소판 유래 성장 인자 AA (H-PDGF-AA, 10 NG / ㎖)인간 혈소판 유래 성장 인자 BB (H-PDGF-BB, 10 NG / ㎖), 헤파린 용액 (2 μg의 / ㎖). </li></ol></li><li> 4 ° C까지 스윙 버킷 로터가 장착 된 실험실 원심 분리기를 사전 냉각. </li></ol> 3. 기계 해리 <ol><li> 높은 벽으로 둘러싸인 100mm X 20mm 세포 배양 접시에 조직을 전송합니다. 운송에서 미디어의 나머지를 제거하고 10로 교체 - 15 mL의 차가운 문화 미디어. </li><li> 만곡 지혈제를 사용하면, 면도날을 파악 명백한 혈관이나 수막을 제거하면서 미세 조직을 말하다. 주 : 최종 조직 절편 1mm보다 작아야한다 (도 1b 참조). </li><li> 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브로 조직을 전송합니다. 추가로 5 mL의 차가운 문화 매체와 세포 배양 접시를 세척하고 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 남은 조직을 전송하기 위해 필요한이 세척 단계를 반복합니다. </li><li> (- 5 회 4) 10 mL의 혈청 학적 피펫을 사용하여 부드럽게를 씹다. 큰 담배 마는 허용UE 단편은 튜브의 바닥에 침전한다. 필요한 경우, 간단히 1 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 샘플을 원심 분리기. </li><li> 기계적 해리 분수를 수집합니다. <ol><li> 상층 액을 제거하고 표시된 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 필터링 &quot;기계 해리.&quot; 원래 원뿔 튜브를 통해 필터 전환 및 조직 조각을 복구하기 위해 문화 미디어로 씻는다. </li><li> 5 분 (350 XG, 4 ° C)은 &quot;기계 해리&quot;부분을 원심 분리기. </li><li> 펠렛 &quot;기계 해리&quot;부분에서 상층 액을 제거하고 차가운 문화 매체의 조직을 재현 탁. 은 &quot;기계적 해리&quot;원뿔형 튜브 조직 이상 5 ㎖가있는 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할. </li></ol></li><li> (자당 그라데이션 원심 분리 단계까지 인트를 얼음에 기계적 해리 부분을 저장페이지 5). 또한, 기계적 해리 부분은 효소 해리 잠복기 (단계 4.4) 중 5 단계로 진행할 수 있습니다. </li></ol> 4. 효소 해리 <ol><li> 나머지 큰 조직편을 함유하는 튜브에 조직 이상 5 ㎖이 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할. </li><li> 5 분 (350 XG, 4 ° C)에 남아있는 조직 절편을 함유하는 원뿔형 튜브 (들)를 원심 분리기. </li><li> 데워진 효소 소화 솔루션을 뜨는을 제거하고 추가, 매 1 mL의 조직에 대한 5 ㎖ 소화 용액이되도록 (예를 들어, 5 ㎖ 조직 25 mL를 소화 용액). </li><li> 실험실 필름 원추형 튜브의 뚜껑을 밀폐하고 30 분 동안 37 ° C에서 회 전자에 반응을 배양한다. </li><li> 배양 후, (그림 1C 참조) 부드럽게 샘플을 씹다. <ol><li> 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여,피펫 샘플까지 6 다운 - 8 시간. 과도한 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 피펫의 마지막에 1,000 μL 피펫 팁을 추가하고 추가로 6 씹다 - 8 번. </li><li> 남아있는 덩어리가 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 제거하고 여전히 &quot;효소 해리&quot;이라는 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 정지 세포와 뜨는을 필터링하고 얼음에 저장합니다. </li><li> 큰 조직 조각이 남아 있으면, 조각에 칼슘과 마그네슘에 추가로 10 ㎖의 HBSS를 추가하고 반복 3.5.1와 3.5.2 단계를 반복합니다. 은 &quot;효소 해리&quot;튜브에 100 μm의 필터를 통해이 최종 솔루션을 필터링합니다. </li></ol></li><li> 5 분 (350 XG, 4 ° C)의 &quot;효소 해리&quot;튜브를 원심 분리기 및 자당 기울기 원심 분리를 계속합니다. </li></ol> 5. 자당 그라데이션 원심 분리 <ol><li> 샘플은 아직 용액 centrifu에 현탁하면5 분 (350 XG, 4 ° C)에 대한 GE의. </li><li> 칼슘과 마그네슘없이 20 mL의 차가운 HBSS에 뜨는 및 재현 탁 조직을 제거합니다. 차가운 HBSS 25 ML의 총 볼륨 업을 가져옵니다. </li><li> 천천히 25 mL의 1.8 M 자당 솔루션을 추가하고 혼합하는 튜브를 반전. 이것은 0.9 M 자당 기울기가 발생합니다. </li><li> 10 분 (800 XG, 4 °에 C)에 대한 더 브레이크 원심 분리기. 그라데이션을 방해하고 수율을 감소 (전 원심 분리 후 샘플의 예는 그림 1D 참조)하는 원심 브레이크를 사용. </li><li> 조심스럽게 수초의 파편과 가능한 한 많은 자당 솔루션을 기음. 칼슘과 마그네슘없이 30 mL의 차가운 HBSS를 추가하고 부드럽게 혼합하여 샘플을 씻으십시오. 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기. </li></ol> 6. ACK 적혈구 용해 <ol><li> 세척 뜨는을 제거합니다. 5 mL의 ACK 용해 완충액을 첨가하고 완만하게 RT에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이, 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 패를 끄다칼슘 및 마그네슘없이 30 ㎖ 차가운 HBSS를 첨가하여이 Analysis. </li><li> 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기. </li></ol> 7. 초기 문화의 유지 보수 <ol><li> 성장 인자 따뜻한 완전한 TSM 15 mL의 트리 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생존 세포 밀도를 정량화 - 10 최종 세포 펠렛을 재현 탁. 참고 : 가능한 세포의 범위는 광범위하게 조직 기증의 상황에 따라 달라집니다 및 정량 인해 남은 세포 파편이 초기 단계에서 어려울 수 있습니다. 이상적인 경우, 샘플 당 백만 살아있는 세포를 가지고하는 것을 목표로하고 있습니다. 과도한 파편은 T175 플라스크에 낮은 밀도로 남아 플레이트의 경우. </li><li> 새로운 T75 문화 플라스크에 최종 세포 현탁액을 전송합니다. 추가적인 성장 인자 스파이크 전반적인 성장 인자 수준을 유지하고, 종양 세포의 발달 neurosphere를 모니터링하는 격일는 (도 1E 및도 2 참조). </li><li>또한, 유동 세포 계측법 및 형광 활성화 셀 정렬을 포함하여 추가 분석을위한 공정 효소 해리 세포. </li><li> (평균 3 얻어 - 4 주되지만, 최대 2 개월 며칠 범위) neurosphere를 개발 한 결과, 이물질의 양을 감소시키기 위해 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터를 사용하여 샘플 필터 역방향. 주 : 여과 액을 실행 가능한 단일 세포 또는 작은 구체가 존재하는 경우에 문화에서 유지되어야한다. </li><li> 초기 환자 샘플을 비교, 계대 동안 DNA 지문을 수행하여 문화의 무결성과 순도를 확인합니다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 생체 외 다양한이나 생체 내 실험에 사용할 수있는 환자 유래의 세포 배양을 개발하기 위해 사후 종양 조직 기부의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다. 때문에 부검 샘플 작업의 특성, 샘플 생존을 유지하는 것은 상당한 도전을 포즈. 부검 할 사후 변화 나 조직의 반송에 필요한 시간 등 여러 가지 요인은, 가능한 한 많이 최소화하지만, 종종 조절하기 어렵다한다. 우리의 경험 미만 (6)의 사후 변화에서 - (조직이 냉담한 배송 및 운송 매체에 배치되는 시간에 죽음의 시간)에서 8 시간 내구성 세포 배양을 확립하는 가장 좋은 기회를 산출했다. 그 후 24 시간 내에 실험실에서 조직을 수신하고, 수신시 바로 문화를 처리하는 것이 가장 좋습니다. 이러한 드문 경우의 위치는 매우 다양하기 때문에과티슈 검색 단계의 품질이 크게 성공 확률에 영향을 부검을 수행하는 물류가 어려울 수있다. 대부분의 경우 6-8 시간 기간을 달성하기 위해서는, 학술 중심 조직 수확을 실시 가능하지 않다. 대신, IRB 승인 프로토콜에 따라 장례식 집에서 종양 조직을 복구하는 통화 조직 복구 서비스를 갖는 종종 조직 복구를위한 더 많은 편법이다. 죽음의 사전 동의를 얻기 권장 및 물류 계획을 용이하게한다. 조직 검색 (장갑, 커튼, 메스)에 대한 명확하고 철저한 지침과 멸균 공급 장치 자체에 포함 된 부검 키트를 준비하는 것이 좋습니다. 또한, 조사, 병리학 및 장례식장의 사이에 의사 소통의 명확한 지점을 설정하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 조사 전에 부검의 병리학 자와 프로토콜을 논의하고 일반적인 오류를 강조한다. 이러한 오류는 마이크로 포함조직 검색, 하룻밤 / 신속한 배송 thermoinsulated 용기에 충분한 젖은 얼음 샘플을 제공하기 위해 실패를 통해 발송 실패시 BIAL 오염 (일반적으로 효모). 마지막으로, 반송 시간을 최소화하기 위해 샘플의 선적 호별 택배 서비스를 이용하여 추천한다. 치료는 세포 생존을 유지하는 조직 분해시주의해야한다. 예를 들어, 설계 매체의 사용은 전송을 위해 신경 조직의 건강을 유지하기 위해 (하이버 네이트-A는 보충 항진균제 / 항생제) 성공적인 배양을 발생 가능성을 증가시킬 것이다. 항상 얼음에 샘플을 전송하여 프로토콜 걸쳐 차가운 온도에서 샘플을 유지하는 것도 중요하다. 두 단계는 세포에 외상 한, 프로토콜의 성공을 향상시킬 수 있습니다 분쇄를 최소화과 함께 모두 기계 및 효소 분해 분획을 수집. 우리의 경험에서 가장 성공적인 문화는 모두 분수에서 성장하면서우리는 두 제제의 하나의 잠재적 이들 샘플 민감한 특성을 반영하는 영구 문화를 확립 경우가 있었다. 프로토콜의 또 다른 외상 단계는 분쇄입니다; 필요한 분쇄의 정도를 줄일 수있는 하나의 전략은 샘플을 철저히 준비의 시작에 다진되도록하는 것입니다. 샘플 가능성을 개선하도록 설계된 프로토콜의 양태의 다른 예는 효소 분해에 특히 중요하다 프로토콜에 걸쳐 (예를 들어, HEPES) 버퍼를 추가 포함한다. 상기 세포 생존을 증가시키기이 프로토콜의 가능한 변형은 ACK 적혈구 세포 용해 단계의 제거이다. 그러나,이 경우에는, 적혈구를 제거하기 위해 배양 초기 주 동안 ACK 용해 단계를 수행 한 다음 종종 필요하다. 수정 될 수도 프로토콜의 또 다른 목적은 수크로오스 densit를 사용 미엘린 및 세포 파편의 제거이며y를 그라디언트. 특히, 미세 아교 세포의 세포 생존율을 개선하는 것으로보고 된 다른 전략은 불연속 퍼콜 밀도 구배 (18) 또는 자기 미엘린 제거 비드,이 단계에서 또한 가능하다. 마지막으로, 초기 조직 분리 및 neurosphere를의 모양 사이의 기간은 샘플 사이에서 변화 한 달 이상 일주일이 걸릴 수 있습니다. 초기 배양은 일반적으로 죽은 세포 및 세포 파편 상당한 정도 포함하기 때문에, 생세포 남아 있는지 여부를 결정하기 어려울 수있다; 8주 (도 2) - 배양 적어도 4 유지되어야한다. 여기에 표시되는 남은 잔해에서 성장 세포를 분리하기위한 하나의 전략 (즉, 새로운 미디어에 세포 클러스터와 재 도금을 필터링 역). 문화를 계속 유지할지 여부에 대한 결정은 궁극적으로 일을 주변 요소에 따라 사례 별 결정이다전자 부검 (예를 들어, 장기간의 사후 변화, 조직 운송 중 문제), 조직 해리 (예를 들면, 과도한 혈액이나 파편)하는 방법과 샘플 문화에 나타납니다. 문화가 확립되면, 신원이 목적을 위해 유지 원래 종양의 샘플에 문화를 비교, 짧은 탠덤 반복 분석 또는 유사한 방법을 사용하여 DNA 지문에 의해 검증되어야한다. 6개월 - 우리는 정기적으로 매 3 예를 들어, 다른 문화에 의해 더 오염이 발생하지 않았는지 확인하기 위해 DNA 지문에 의해 문화를 확인하는 것이 좋습니다. 이러한 환자 유래 DIPG 문화의 생성은 효과적인 치료의 성공적인 개발에 중요한 단계를 나타냅니다. 가능한 환자 유래 DIPG의 문화와 이종 이식 모델의 확장은 가장 효과적인 치료 전략을 파악하고 궁극적으로이 파괴적인 질병을 극복에 중요하다.

DIPG은 일반적으로 중간 어린 시절 1, 2시, 복부 뇌교에서 발생 공격적인 중추 신경계의 악성 종양이다. 임상 시험의 수십 년에도 불구하고, 현재의 치료는 일시적으로 개선 또는 증상의 안정화를 제공 방사선 치료, 제한되며 단지 3 개월 평균 평균 생존을 확장합니다. 심지어 방사선, 평균 생존율은 초기 진단 2 년 이내에 질병으로 죽어가는 어린이의 90 % 만 9개월입니다. 때문에 종양과 뇌간의 중요한 기능의 침윤성 특성, 수술 적 절제 할 수 없습니다. 조직 학적 분석은 일반적으로 단독으로 신경 영상으로 만들어 질 수 임상 치료 및 진단에 유도 전류 역할이 없기 때문에 또한, 미국에서, DIPG 수술 적 생검을 수득 역사적 3 수행되지 않았다. 종양 조직 (F)의 이와 같이, 가용성또는 연구는 후보 약물 분자와 기본 종양 생물학에 대한 연구를 수행하기위한 노력을 제한, 제한된다. 특히, 뇌 영상 및 정위 기술의 개선, 분자 생물학의 발전과 결합 될 때, 질병에 대한 우리의 이해를 변형 한 최근 4에 DIPG의 안전 생검의 개발을 허용했다. 현재 치료 계획을 개체화에 대한 선행 생검 및 DIPG의 분자 프로파일 링을 사용하여 여러 임상 시험 진행 (NCT01182350, NCT02274987) 5입니다. DIPG 및 기타 소아 고급 신경 교종은 성인 아교 모세포종 대응 6, 7에서 별개의 질병을 나타내고, DIPG의 따라서 충실한 실험 모델은 고유의 병태 생리를 이해하는 데 필요한 효과적인 치료 전략을 발견 할 수 있습니다. 최근 DIPG 종양 t를 획득하기위한 노력을 집중부검시의 연구에 대한 문제는 또는 덜 일반적으로 조직 검사는 우리의 이해와 DIPG을 연구하는 능력을 혁명을 일으켰다. 게놈지도의 노력은 H3 히스톤 가족 3A (H3F3A) 및 히스톤 클러스터 1 단백질 8, 9, 10, 11 부호화 히스톤의 돌연변이에 의한 인체 질병의 제 1 예를 나타내는 H3b (HIST1H3B)에서 재발 성 돌연변이를 밝혀 . 또한 DIPGs의 서브 세트는 이전에 암을보고하지만 선천성 소아 발달 장애 fibrodysplasia 골화의 progressiva 8, 9, 10, 11에서 발견되는 변이와 동일하지 않은 ACVR1 유전자의 돌연변이를 나타낸다. 뿐만 아니라, 첫 번째 환자 유래 DIPG 세포 배양 및 소성을 이종 이식 개월델 이제, 2, 12, 13, 14, 면역 결핍 마우스에 종양 세포의 이종 이식을 통해 직접 구축 마우스 모델 시리얼 이종 생성뿐만 아니라 3, 14, 15 일에 설립되었다. 이러한 환자 파생 모델을 사용하여 초기 약물 검사 노력은 임상 번역 4, 14 유망한 새로운 에이전트를 식별하고 적어도 하나의 임상 시험 (NCT02717455)을위한 토대를 마련했다. 진행으로이 첫 번째 단계는 시작에 불과하며, 많은 환자 유래의 조직 샘플과 문화 모델은 가장 효과적인 치료 전략을 질병의 하위 유형을 정의하고 개발하는 데 필요합니다. 유전자 엔진DIPG 겹의 마우스 모델은 또한 질병의 우리의 기본적인 이해를 증진 겨냥한 연구를 촉진 할 것이다. DIPG에 대한 유전 적 모델을 생성하기 위해 만든 노력은 위에서 설명한 기초 게놈 연구의 도움되지만 옵션의 현재 제한된 수의 사용할 수 있습니다. 조직 학적으로 유사한 고급 뇌간 신경 교종를 생성하는 하나의 모델은 신생아 마우스 (5), (16)의 후두에 네 스틴 양성 세포에 PDGF-B 과발현과 Ink4a-ARF 손실을 구동하기 위해 바이러스 RCA 단자 / TV-시스템을 사용합니다. 또 다른 방법은도 6, 7, 17 종양이 세포를 렌더링하는데 충분하다 인간 배아 줄기 세포 유래의 신경 전구 세포에서 여러 주요 DIPG 관련된 돌연변이 (히스톤 H3.3의 K27M 돌연변이 p53의 손실 PDGFRA 활성화) recapitulating 포함한다. 유전 적 방법과 환자 deriv의 조합ED 모델은 임상 시험을 사용하고 효과적인 치료제의 개발을 촉진 할 것이다. 위에서 설명한 DIPG 연구의 과제를 해결하기 위해이 급속 부검 프로토콜 조사 8, 9, 10, 11, 12, 14, 환자 유래의 배양 세포를 생성하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 조직의 생존을 보호하고 확장 사후 간격 반송 시간과 관련된 문제에도 내구성 문화를 생성하는 가능성을 극대화하는 것이다. 성공적으로 생성되면,이 DIPG 배양 환자 유래의 세포에 대한 잠재적 인 치료 분자의 평가를 허용 후속 시험 관내 및 생체 내 조작 이종 이식 실험에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with Calcium/Magnesium</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Collagenase/Dispase)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blades</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Curved hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gloves</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>100 micron mesh filter</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (dipg)

확산 내장 뇌교 신경 교종 (DIPG)는 보편적으로 치명적인 예후를 운반 어린 시절 뇌간 종양이다. 외과 적 절제는 가능한 치료 전략 아니며 생검 일상적으로 수행되지 않기 때문에, 연구 환자 샘플의 유용성이 제한된다. 따라서,이 질병을 연구하는 노력은 충실한 질병 모델의 소수에 의해 도전을 받고있다. 이러한 필요를 해결하기 위해 시험 관내 분석에서 또는 생체 동 소성 이종 이식 실험에 사용할 수있는 내구성 환자 유래의 세포 배양 모델을 생성하기 위해 여기 사후 부검 조직 샘플의 빠른 처리를위한 프로토콜을 기술한다. 이 모델은 잠재적 인 약물 표적을 선별하고 DIPG 내에서 근본적인 병인 학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 분석 및 유전자 전 후속 분석을 활성화 (FACS) 정렬 형광 - 활성화 된 세포를 사용하여 종양 세포 미세 환경을 격리하도록 확장 될 수있다Pression의, 단백질 발현, 또는 벌크 셀 또는 단일 세포 수준에서 DNA의 후생 유전 학적 변형. 마지막으로,이 프로토콜은 다른 중추 신경계 종양 환자 유래의 배양 물을 생성하도록 구성 될 수있다.

기술 된 프로토콜은도 1의 공정의 다양한 단계에서의 조직의 이미지와 함께 5 단계 흐름과 같이 요약된다. 샘플은 제 빠르게 멸균 부검을 통해 얻어진다. 시료로부터 혈관 수막을 제거하면서 기계적 해리 동안 조직 다진되고, 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터로 여과 하였다. 남은 조직 절편은 효소 온난화 오븐에서 분해된다. 다음으로, 파편 시료로부터 수초의 뚜렷한 층을 분리, 수 크로스 구배 원심 분리를 통해 감소된다. 또한, ACK 용해 가시적 샘플에 존재 적혈구의 양을 감소시킨다. 마지막으로, 세포를 성장 인자로 보충 된 무 혈청 배지에서 도금된다. 도 1은 기업 부검시에 종양의 일례이다. 종양은 뇌교의의 확산 침투로 성장뇌간의 D 인접 지역. 샘플 준비하는 동안, 작은 ~ 1cm X 1cm 덩어리 절단해야합니다 즉시 얼음에 차가운 배송 미디어에 배치. 그림 2는 샘플 내구성 문화 배양의 초기 단계에서 나타날 수있는 방법을 다양한 예를 보여줍니다. 처음에 도금 및 초기 문화 (A, B)는 종종 많은 생존 세포를 포함하는 표시되지 않습니다. 또한, 초기 셀 클러스터 (C, D)는 종종 neurosphere를 통상과 관련된 대조도를 나타내지 않는다. 특히, 문화의 이전 셀 클러스터의 모습에 시간의 기간은 몇 개월 주가 걸릴 수 있습니다. 그러나, 셀의 클러스터 역방향 필터링과 함께 이러한 셀 클러스터의 초기 통로, 구체 (F)을 형성 할 수있는 건강 종양 세포를 분리 할 수있다. 여과 액 (E)는 일반적으로 남은 파편을 포함, 그러나 도금하고, 여과 액을 유지하고 모니터링을 권장<html> 셀 클러스터의 개발. 이러한 환자 유래의 시료는 다음 배수 통로 (G, H)에 대한 배양 유지할 수있다. 도 3은 마우스에 이종 이식 될 이들 세포의 기능을 설명한다. 각 경우에서, DIPG 세포 생물 발광 (A)를 통해 종양의 발전을 모니터 할 GFP - 루시퍼 라제 리포터와 함께 형질 감염시켰다. 종양은 종양 생착 (B) 또는 특정 마커 (C)의 발현을 관찰하기 위해, 예를 들어, 조직 학적으로 관찰 할 수있다. 시험 관내 분석법 조합이 생체 내 모델은 다양한 약물 또는 유전자 조작의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다 (예를 들어, 8, 9, 10, 11, 14). 레 / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; 가공의 여러 단계에서 그림 1. 조직 샘플. (A) 무균 부검 절차 및 젖은 얼음에 야간 배송을 통해 샘플을 가져옵니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 (B) (행 1) 배송 미디어 종양 조직을 포함하는 튜브; 100mm X 20mm 세포 배양 접시에 신선한 조직; 조직의 초기 닦지; (행 2) 부분적으로 다진 조직; 수막 혈관의 제거; 다진 조직 조각의 최종 크기. 왼쪽에서 오른쪽으로 (C) (1 행)은 37 ° C의 오븐에서 회전 테이블 배양 조직; (행 2) 10 mL를 피펫에 부착 된 1000 μL 피펫 팁을 통해 조직의 분쇄; 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터를 통한 여과 해리 조직. 왼쪽에서 오른쪽으로 (D)는 : 조직 전에 원심 0.9 M 수크로오스 용액에 현탁 해리; 원심 분리 후, 자당 기울기를 통해 분리 해리 조직; 눈에 보이는 레이어 오자당 그라데이션의 상단에 f를 수초 파편; ACK 용해 및 세척 후 최종 세포 펠렛. (E) 최종 시료 배양에 배치 또는 다른 다운 스트림 분석에 사용될 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> 차 문화와 초기 통과 세포의 2. 이미지를 그림. (A - B) 문화가 (SU-DIPG-XXX, A) 분리 후 즉시 도금, 또는 아직 neurosphere를 재배하지 않은 (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) SU-DIPG-XXVIII (C)와 SU-DIPG-XXIX (D)의 차 문화 neurosphere를 초기 모습. Fi를 가진 (EF) 100 μm의 나일론 필터를 사용하여 D에서 차 문화의 제 1 통로,여액 (E) 및 역 여과 액 (F)는 도금. (G - H) 문화에서 성장 SU-DIPG-XXVII (G) 및 SU-DIPG-XXV (H)의 제 3 통로의 제 1 통로에서 성숙한 neurosphere를. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> 그림 3. 환자 유래 세포 배양 생착 및 마우스의 양식 종양 수 있습니다. GFP - 루시 페라 제 기자로 형질 네 가지 환자 유래 세포 배양의 (A) 생물 발광 이미지. 마우스 뇌교에 접목 종양 세포를 나타내는 (B)는 마우스 이종 이식에서 시상 섹션. 녹색 : GFP, 빨간색 : 미엘린 염기성 단백질. 스케일 바 = 1mm. (C) 예 immunofluores마우스 뇌에서 GFP 접목 종양 세포를 나타내는 cence 이미지. 블루 : DAPI, 녹색 : GFP, 빨간색 : IGF2R. 스케일 바는 40 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 그림 A 뇌교 종양의 1. 부검 샘플. 확산 고유 뇌교의 신경 교종의 즉각적인 사후 모습. 종양은 뇌교의 복부 표면에 큰, 수초 풍부한 대량으로 나타납니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">이 이미지를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다.

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

16.8K 조회수.  Stanford University School of Medicine.  이 프로토콜은 환자 유래의 세포 배양 모델 또는 종양 미세 환경과 세포의 직접적인 특성화 확립 사후 확산 극한 뇌교 교종 샘플들의 빠른 처리를위한 방법을 설명한다. 

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better understand the molecular mechanisms underlying glioma cell migration, an ability to study the interaction between hGCs and axons within the tumor microenvironment is essential. In order to model this cellular interaction, we developed a mixed culture system consisting of hGCs and dorsal root ganglia (DRG) axon-oligodendrocyte co-cultures. DRG cultures were selected because they can be isolated efficiently and can form the long, extensive projections which are ideal for migration studies of this nature. Purified rat oligodendrocytes were then added on purified rat DRG axons and induced to myelinate. After confirming the formation of compact myelin, hGCs were finally added to the co-culture and their interactions with DRG axons and oligodendrocytes was monitored in real-time using time-lapse microscopy. Under these conditions, hGCs form tumor-like aggregate structures that express GFAP and Ki67, migrate along both myelinated and non-myelinated axonal tracks and interact with these axons through the formation of pseudopodia. Our ex vivo co-culture system can be used to identify novel cellular and molecular mechanisms of hGC migration and could potentially be used for in vitro drug efficacy testing.

Here we present an ex-vivo mixed monolayer culture system for the study of human glioma cell (hGC) migration in real-time. This model provides the ability to observe interactions between hGCs and both myelinated and non-myelinated axons within a compartmentalized chamber.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

연구

암 연구학

Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models. To model WHO grades III and IV malignant gliomas in transplantation assays, human tumor cells are xenografted into an orthotopic site, the brain, of immunocompromised mice. In contrast to secondary xenografts that utilize cultured tumor cells, human glioma cells are dissociated from resected specimens and transplanted without prior passage in tissue culture to generate primary xenografts. The procedure in this report details tumor sample preparation, intracranial transplantation into immunocompromised mice, monitoring for tumor engraftment and tumor harvesting for subsequent passage into recipient animals or analysis. Tumor cell preparation requires 2 hr and surgical procedure requires 20 min/animal.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary orthotopic xenografts recapitulate the histopathological and molecular features of malignant glioma subtypes in preclinical animal models.

1차 성우 성안 성액 제노이식은 침투 성장을 재구성하고 탈수소 효소 I 돌연변이를 이소염시분해합니다.

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

의학

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Flexible Organic Electronic Devices for Pulsed Electric Field Therapy of Glioblastoma

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed electric fields (PEFs) are promising for the improvement of treatment efficiency. However, they rely on rigid electrodes that cause acute and chronic damage, especially in soft tissues such as the brain. In this work, flexible electronics were used to deliver PEFs to tumors and the biological response was evaluated with fluorescent microscopy. Interdigitated gold electrodes on a thin, transparent parylene-C substrate were coated with the conducting polymer PEDOT:PSS, resulting in a conformable and biocompatible device. The effects of PEFs on tumors and their microenvironment were examined using various biological models. First, monolayers of glioblastoma cells were cultured on top of the electrodes to investigate phenomena in vitro. As an intermediate step, an in ovo model was developed where engineered tumor spheroids were grafted in the embryonic membrane of a quail. Due to the absence of an immune system, this led to highly vascularized tumors. At this early stage of development, embryos have no immune system, and tumors are not recognized as foreign bodies. Thus, they can develop fast while developing their own vessels from the existing embryo vascular system, which represents a valuable 3D cancer model. Finally, flexible electrode delivery of PEFs was evaluated in a complete organism with a functional immune system, using a syngenic, orthograft (intracranial) mouse model. Tumor spheroids were grafted into the brain of transgenic multi-fluorescent mice prior to the implantation of flexible organic electrode devices. A sealed cranial window enabled multiphoton imaging of the tumor and its microenvironment during treatment with PEFs over a period of several weeks.

This work describes the development of flexible interdigitated electrodes for implementation in 3D brain tumor models, namely, in vitro culture, in ovo model, and in vivo murine model. The proposed method can be used to evaluate the effects of pulsed electric fields on tumors at different levels of complexity.

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

Glioblastoma is difficult to eradicate with standard oncology therapies due to its high degree of invasiveness. Bioelectric treatments based on pulsed ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Chopper-Processed Patient Tumors에서 3D Glioma Organoids의 유도

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing realistic ex vivo models remain challenging. Patient-derived 3-dimensional organoid (PDO) models offer innovative platforms that capture the phenotypic and molecular heterogeneity of GBM, while preserving key characteristics of the original tumors. However, manual dissection for PDO generation is time-consuming, expensive and can result in a number of irregular and unevenly sized PDOs. This study presents an innovative method for PDO production using an automated tissue chopper. Tumor samples from four GBM and one astrocytoma, IDH-mutant, CNS WHO grade 2 patients were processed manually as well as using the tissue chopper. In the manual approach, the tumor material was dissected using scalpels under microscopic control, while the tissue chopper was employed at three different angles. Following culture on an orbital shaker at 37 &#176;C, morphological changes were evaluated using bright field microscopy, while proliferation (Ki67) and apoptosis (CC3) were assessed by immunofluorescence after 6 weeks. The tissue chopper method reduced almost 70% of the manufacturing time and resulted in a significantly higher PDOs mean count compared to the manually processed tissue from the second week onwards (week 2: 801 vs. 601, P = 0.018; week 3: 1105 vs. 771, P = 0.032; and week 4:1195 vs. 784, P &lt; 0.01). Quality assessment revealed similar rates of tumor-cell apoptosis and proliferation for both manufacturing methods. Therefore, the automated tissue chopper method offers a more efficient approach in terms of time and PDO yield. This method holds promise for drug- or immunotherapy-screening of GBM patients.

저자 스포트라이트: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma(교모세포종 및 신경교종에 대한 환자 유래 3D 오가노이드의 향상된 생성)

This study introduces an automated method to generate patient-derived glioblastoma 3-dimensional organoids utilizing a tissue chopper. The method provides a suitable and effective approach to obtain such organoids for therapeutical testing.

Tissue Chopper를 이용한 Ex vivo 환자 유래 신경교종 오가노이드 배양

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

면역학 및 감염병학

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

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임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

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Tissue Chopper를 이용한 Ex vivo 환자 유래 신경교종 오가노이드 배양

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