Name: rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별 <ol><li> 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오. 주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하는 것이 중요하고, 따라서 영구 7이다. </li><li> 거즈 스폰지 또는 면봉에 70 % 에탄올로 발 패드를 면봉. </li><li> 면봉에 스킨 오일을 적용하고 부드럽게 발 패드 차례의 표면에 대한 팁을 누릅니다. 피부 오일의 소량만을 사용; 존재하는 경우 다량으로, 그것은 피부에 도달하는 문신 안료를 방지 할 것이다. </li><li> 직전 문신 잉크로 문신 바늘의 팁을 찍어문신에. 통증 및 감염의 가능성을 감소하고, 또한 문신 효율을 높이기 위해, 깨끗하고 선명한 무균 문신 바늘을 사용한다. </li><li> 발 패드 표면은 피부의 기름으로 덮여 있지만, 발 패드의 중앙에 수직으로 피부에 가볍게 문신 바늘 팁을 누르고, 여러 번 잉크를 분사. 전기 문신 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 부드럽게, 거즈 스폰지에 70 % 에탄올 스프레이 피부 표면에 여분의 문신 색소를 제거하는 발에 대해 그것을 누르고, 문신의 품질을 검사합니다. 발 패드의 중간 정상 피부 착색과 다른 어두운 둥근 반점을 가지고 있는지 확인하십시오. 문신 어둡거나 쉽게 볼 충분하지 않은 경우, 종래 문신 단계를 반복한다. </li></ol> 고속 PCR 유전자형 키트를 사용하여 2. 유전자형 신생아 마우스 <ol><li> 70 % 에탄올 마우스 꼬리의 말단부 소독 꼬리 5mm 이하 잘라팁 및 PCR에 사용 된 형태의 8 튜브 스트립의 튜브에 옮긴다. 시편 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 강아지 미사용 면도날을 사용한다. 대안 적으로, 가위를 사용하지만,이 경우에는, 빠짐없이주의 70 % 에탄올을 사용하여 블레이드의 나머지 조직을 제거. 출혈을 확인합니다. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지, 거즈 스폰지로 꼬리의 절단 부분에 압력을 적용합니다. </li><li> 표본을 포함하는 각 PCR 튜브에 DNA 추출 용액 200 μl를 추가합니다. 키트에 대한 조성 및 정보 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> PCR 서멀 사이 클러로 튜브 스트립을 배치하고, 다음 프로그램을 이용하여 DNA 추출을 시작하는 1 사이클을 55 ° C에서 10 분, 10 분 동안 95 ° C에서 1주기, 4 ℃에서 들고. 주 :이 나중에 PCR에 사용 된 것과 동일한 PCR 서열 증폭기이다. </li><li> DNA 추출이 완료되면, 유전자 증폭기의 튜브로부터 스트립을 제거차 5 번 반전. </li><li> 미사용 8 튜브 스트립의 튜브 및 혼합 각 시편의 전송 솔루션 (DNA 추출물)의 4 μL : 2X PCR 준비 믹스 II의 10 μL, 앞으로 및 역방향 프라이머를 혼합 2 μL (에 권장 0.5 μM, 각 시료에 대한 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 시퀀스 재료 / 장비의 표 참조), 4 μL. 탁상 형 원심 분리기를 사용하여 스핀 짧게 (예를 들어, 3 초). 처리하는 경우를 제외하고는 항상 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 열 순환을 수행합니다. 참조 열 프로그램에 대한 재료 / 장비의 표. </li><li> 증폭 된 DNA의 제품을 감지합니다. 직접 아가 로스 젤의 우물에 PCR (20 μL)에서 총 반응 액을 넣습니다. 별도의 우물에 분자량 마커를로드합니다. 전기장을 적용합니다. </li><li> 자외선 아래 밴드의 형광 이미지를 획득. </li></ol> 마우스 뇌 신경 세포의 3 차 문화폐해 세포층에의 참고 : 뇌 해부 및 세포 해리 (3.1)에 대한 절차는 모든 후속 절차에 공통입니다. 마우스 아교 세포 배양을위한 절차 (3.2), 쥐 아교 세포 배양 (3.3), 마우스의 연결을 문화 (3.4) 이후에 별도​​로 설명되어 있습니다. <ol><li> 뇌 해부 및 세포 Dissocaiation <ol><li> 신속하게 뇌를 제거하고 행크스 &#39;솔루션으로 배치, 잘린 하나의 마우스 또는 쥐 새끼를 희생 (조성은 표 1 참조) + 20 % (얼음에 보관) 35mm 접시에 소 태아 혈청 (FBS). </li><li> 두 개의 반구로 중간 선을 통해 뇌를 잘라. 뇌의 각 반구에서 관심 영역 (예를 들어, 대뇌 피질, 선조체 (striatum)와 해마)를 제거합니다. 표면의 수막 및 주요 혈관을 제거합니다. 수술 블레이드를 사용하여 4-10 얇은 조각으로 뇌 영역을 잘라. </li><li> 재치되면, 15 ML의 원심 분리 관에 뇌 조각을 씻어시간 행크스 &#39;솔루션 + 20 % FBS, 행크스와 다음 3 회&#39;(혈청이없는 즉,) 솔루션 (4 ° C에서). 린스 5-10 ml의 용액을 추가 슬라이스 튜브 바닥에 침전 뇌, 위에서 용액을 흡인하도록하고 신선한 용액을 첨가한다. 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 마칩니다. </li><li> 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 사용 트립신 - 함유 소화 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 여과하고 뇌 조각을 함유하는 튜브에 직접 여액을 추가한다. 트립신은 실온에서 13 분 동안 진행하자. </li><li> 그것의 대부분을 흡입하여 다음 7 ~ 10 ml의 행크스 &#39;솔루션 + 20 % FBS (4 ° C)의 추가하여 먼저 트립신 용액을 중화. </li><li> 행크스 두 번, 뇌 조각을 씻어 &#39;솔루션 + 20 % FBS 및 행크스와 3 회&#39;솔루션 (즉, 혈청없이) (4 ° C에서). 오디오 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 완료이온. </li><li> 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 해리 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 필터링 및 뇌 슬라이스 튜브에 직접 여액을 추가한다. </li><li> 기계적으로 보이는 조직 조각이 사라질 때까지 부드럽게, 10 ~ 20 시간을 분쇄하여하여 세포를 떼어 놓다. 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 분쇄하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 작은 조각이 정착을 위해 3 분을 기다립니다. </li><li> 용액의 대부분을 이동시켜 (~ 1.5 ㎖, 하단 일부 용액을 떠나)을 사용하여, 3 ㎖ 행크 용액 + 20 % FBS 용액 (39 °의 C)를 포함하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 목화 꽂혀, 방화 광택 파스퇴르 피펫. 맨 아래에있는 퇴적물의 포함은 일반적으로 문화의 저하를 초래하기 때문에 모든 솔루션을 전송하지 마십시오. </li><li> 4 ° C에서 ~ 185g (~ 1,100 RPM)에서 13 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음,추가 1 ml의 미리 예열 펠릿 중간 (37 ° C)을 도금, 부드럽게 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 여러 번 피펫 팅하여 재현 탁. 주 : 매체 도금 세 종류의 다른 배양 목적에 사용된다 : 마우스 뉴런 배지 -2- 도금, 마우스 신경교 세포 용 배지 -1- 도금 및 래트 뉴런 및 신경교 세포 배지 -3- 도금 (조성물은 표 1을 참조) . </li><li> 또는 자동 혈구 세포 계수기를 사용하여, 세포 현탁액 10㎕를 꺼내 0.4 % 트리 판 블루 용액 10 μL와 혼합하고, 생균의 밀도를 측정한다. </li></ol></li><li> 마우스 폐해 문화 <ol><li> 마우스 세포의 건강한 문화를 확립하는 데 도움이 된 커버를 세척 할 것. <ol><li> 유리 페트리 접시에서 70 % 질산에 커버 글라스 (원형, 12mm 직경)을 담근다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 진탕 기의 O / N에 놓습니다. </li><li> 유리 coversli을 씻어증류수로 페트리 접시에서 PS 세 번 이상. 증류 된 물에 담가. 진탕 O를 /의 N에 접시를 놓습니다. </li><li> 생물 안전 캐비닛 와트 150mm 필터 종이에 커버 슬립을 건조. </li><li> 커버 슬립을 압력솥. </li><li> 24 웰 배양 접시로 된 커버를 놓습니다. </li></ol></li><li> 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐. </li><li> 3.1 단계에 따라, 마우스 새끼의 뇌 세포를 얻습니다. 참고 : 대뇌 피질의 사용은 마우스 아교 세포층을 준비하기위한 전형이다. 그러나, 해마 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 조정 후 적절한 작동 할 것이다. </li><li> 미리 예열 최종 세포 현탁액 중간-1 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). 사전 온난화 문화 미디어의 경우, 문화 인큐베이터에서 솔루션 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C) O / N,에 배치온도와 산도 값이 안정 될 수 있도록. </li><li> 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. </li><li> 시험 관내 (DIV)에서 일일에서 두 번 도금와 T25 플라스크에서 배양 된 세포를 씻어 매체-1 (4 ° C). 인큐베이터로 플라스크를 놓습니다. 소용돌이 모션에서 여러 번 새로운 배지의 ~ 5 mL를 추가, 완전히 파스퇴르 피펫, 플라스크 내부 매체를 흡입 조심스럽게 플라스크를 기울여 세척 수행합니다. </li><li> 6-9 DIV에서 (즉, 하나의 트립신 전날과 3.2.8-3.2.13 단계에서, 된 커버에 도금), (세포 외 기질 단백질로 코팅 재료의 100 μl를 배치에 대한 의견을 재료 / 장비의 표를 참조 코팅 배양 접시에서 커버 글라스에 재료), 그리고 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. </li><li> DIV 7-10에서, 세포를 20-4 때0 % 합류 (공간적으로 연속)는 이들을를 Trypsinize. <ol><li> 플라스크 내의 모든 솔루션을 흡입하고 ~ 행크스 &#39;솔루션 (4 ° C)의 13 ml에 추가하여, 한 번 플라스크를 씻어 부드럽게 소용돌이 치는 동작으로 플라스크를 여러 번 기울 완전히 솔루션을 대기음. </li><li> 4 ml의 트립신 EDTA 용액에 DNase의 용액 (최종 농도 750 단위 / ㎖)의 40 μL를 추가 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 통과하고, 플라스크 내의 세포에 직접 여액을 추가한다. </li><li> 트립신은 인큐베이터에서 37 ° C에서 13 분 동안 진행하자. </li><li> 플라스크에 100 % FBS (39 ° C) 2 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 중화 용액. </li><li> 행크스 &#39;솔루션 + 20 %의 FBS (4 ° C)에서 원심 분리기 ~ 4를 가하여 5 ~ 10 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 트립신 세포로 이동 ~ 185g, 13 분 동안 4 ° C 상층 액을 대기음. </li></ol></li><li> 사전 warme 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁D 도금 매체-1. </li><li> 단계 3.1.13에 따른 세포의 밀도를 측정한다. </li><li> 커버 슬립에 재현 탁 ~ 신경교 세​​포의 50 μL를 도포 커버 글라스 완전히 재료 및 기음 플레이트. 참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다. </li><li> 인큐베이터 된 커버와 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 20 ~ 60 분 후, 미리 예열이 잘 각 매체-1 도금 1 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 배지 첨가 동안, 커버 슬립이 배지에서 부유하지 않도록, (어떠한 도금 세포가없는) 커버 슬립의 주연을 눌러 다른 피펫을 사용하는 것이 도움이 될 것이다. </li><li> (유리 커버 슬립에서 예) 폐해 세포층 1 DIV에서 1 ml의 배지를 교체 미리 예열 도금 중간 1 웰 모든 용액을 흡입 한 다음 신선한 배지로 채워서. </li><li> 아교 세포층의 2-3 DIV에서 때 CEL각 웰에 따라서 DNA 복제 및 행을 억제하기 위해, LS는 유사 분열 억제제 (81.2 및 204.8 μM의 최종 농도 각각 5- 플루오로 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 + 우리 딘의 혼합물을 10 μL)을 추가 80-100 %의 합류 아르 신경교 세​​포 증식을 억제. </li><li> 세포 90-100 %의 컨 플루 언트 (폐해 세포층에 뉴런 도금 전 1-2 시간) 7-9 DIV 경우에서와 배지를 교체 미리 예열 도금 중간이 (37 ° C). 주 : 뉴런 단계 3.4를 사용하여, 같은 날에 플레이 팅한다. </li></ol></li><li> 쥐 폐해 문화 <ol><li> 코트 같은 도료와 T25 플라스크 배양. 주 :이 단계 3.3.5 비 부착 세포의 제거 이후에​​ 필요하다. <ol><li> 플라스크에 코팅 재료의 2.0 ML을 추가하고, 문화 인큐베이터에서 플라스크를 배치합니다. </li><li> 2-3 시간 후, 플라스크의 바닥 건조가되도록 완전히 도료 대기음. </li></ol></li><li> 세포를 얻기래트 새끼로부터 3.1 단계에있어서. 주 : 해마 CA1-CA3 영역 래트 신경아 피더 층의 제조에 사용된다. 그러나, 대뇌 피질 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 차이를 보정 한 후에 작동 할 것이다. </li><li> 미리 예열 최종 세포 현탁액에 중간 3 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). </li><li> 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C)에서 플라스크를 놓습니다. </li><li> 2-3 DIV에서 세포 20-40 %의 컨 플루 언트 될 때, 단단히 뚜껑을 닫은 플라스크를 흔들어, 미부착 된 또는 약하게 부착 세포를 제거 격렬 ~ 10 배, 용액을 흡인하고, 도금 4-5 mL를 넣은 매체-3 (4 ° C에서). 한 번이 절차를 반복합니다. 예를 들어 (전체 플라스크 바닥에서 배양 된 세포를 검사,완전히 제거된다) 전지 본체의 외부 테두리가 위상 밝다 해당되는 즉 신경을 (나타날 것과 확인하는 위상차 현미경)을 사용. 이러한 세포를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환 할 필요 시마다 절차를 반복합니다. 참고 : 강도와 개별 실험자 다를 수 있습니다 필요한 &#39;쉐이크&#39;의 총 수. 중요한 것은 일련 번호 쉐이크의 총 수를 유지하는 것이 아니라 신경 세포 유사 세포를 제거하는 것을 확인하기 위해이 아니다. </li><li> 6-8 DIV에서, 세포 90-100 %의 합류 통로 단계 3.2.8에서 그들을 trypsinizing으로 아교 세포를 때. </li><li> 원심 분리 후, 코팅되지 않은 T75 플라스크에 트립신으로 세포를 전송 매체-3 (39 ° C)를 도금의 10 mL를 넣어 배양 이들을 매체에서는-3 (39 ° C)을 도금 한 ㎖에 펠렛을 재현 탁 인큐베이터. 참고 : 쥐 신경 교세포 두 번 계대됩니다; 대조 마우스 아교 세포는 아칸소그들은 여러 통로 후 건강에 해로운 될 수 있기 때문에 전자는 한 번만 계대. 쥐 신경교 세​​포는 임의의 코팅 재료로 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 계대 배양된다. 코팅은 쥐 아교 세포가 너무 빨리 성장하고 나중에 신경 세포의 배양 조건을 저하됩니다 많은 섬 모세포 (추정 뇌실막 세포)를 얻을 수 있습니다. </li><li> 플라스크에 아교 문화의 17-19 DIV에서 (즉, 십일일 계대 및 트립신 하루 전날과 3.3.9-3.3.14 단계로 된 커버에 도금 후), (씻지 않은 커버 글라스에 코팅 재료의 100 μl를 배치 라운드, 12mm 직경) 배양 접시에서 배양 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 참고 : 쥐 아교 세포 배양를 들어, 차이가 있거나 된 커버를 세척하지 않고 배양 결과에 발견되지 않았습니다. </li><li> 플라스크에 아교 문화의 18-20 DIV에서 (즉, 계대 후 12 일), 세인트에 따르면, 배양 된 세포를 trypsinizing하여 아교 세포층을 준비EP 3.2.8. </li><li> 원심 동안, 커버 글라스에서 완전히 도료 대기음. </li><li> 원심 분리 후, 단계 3.1.13 항에있어서, 중간 3 (39 ° C)를 1 ml의 도금에 펠렛을 재현 탁하고, 세포 밀도를 측정한다. </li><li> 라이브 104 세포 / ml로 폐해 농도를 조정하고 피복 된 유리 커버 슬립에 아교 세포 현탁액 100 μl를 접시. 참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다. </li><li> 20 ~ 60 분 동안 인큐베이터로 된 커버와 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 중간 3 (4 ° C)을 도금 한 ML을 추가하고, 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 커버 슬립에 세포 40-80% 합류 때 폐해 세포층 3-4 DIV에서, 상기 예열 된 증식 배지 1 ㎖를 추가 (시토신 β-D 아라 비노 푸라 노 시드를 포함하는 (조성물은 표 1을 참조) ARAÇ, 4 μM의 최종 농도)는 아교 세포 증식을 정지합니다. 플레이트 신경신경교 세​​포층의 7-9 DIV들에서 세포를 이용하여 단계 3.4 60-80 % 컨 플루 언트 (confluent) 상태 인 경우. </li></ol></li><li> 마우스의 연결을 문화 <ol><li> 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐. </li><li> 단계 3.1 마우스 새끼를 사용합니다. </li><li> 살아있는 세포 현탁액의 농도를 조절하기 ~하여 2.0 × 105 세포 / ml 미리 예열 매체 -2- 마우스 신경교 세포 도금, 또는 사용하는 금도금 매체 -3- 래트 신경교 세포상의 도금. </li><li> 부드럽게 각각의 배지에 균체 현탁액을 첨가하여 웰, 신경교 피더 레이어 상에 세포를 접시. 주의 : 첨가되는 세포 현탁액의 부피는 웰 배양 세포의 목표 수에 의해 결정된다. 예를 들면, 플레이트는 ~ 세포 현탁액 60 μL은 / 웰 12,000 세포를 달성했다. </li><li> 뉴런은 도금 후 해결책 변경이 필요하지 않습니다. 문화의 과정을 통해, 내부 O를 가습하여 우물에서 솔루션의 증발을 방지하기 위해주의문화 인큐베이터 바. </li></ol></li></ol>

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

The protocol presented here includes procedures for tattooing to label/identify mice, for genotyping mice from tail tips, and for culturing mouse brain neurons at low density. In one round of experiments using 6-8 pups, these procedures typically require ~0.5 hr, ~4 hr and ~2 hr, respectively, at a total of 6-7 hr. This makes it practical for a single experimenter to complete all the procedures necessary from the time of the pups&#39; birth to the plating of neuronal cultures &#8211; in less than a single working day (with the exception of prior preparation of glial feeder layers).
Tattooing
Long-term identification of animals is necessary for the purposes of breeding and scientific studies such as analyses of histology, cell function and animal behavior. Tattooing newborn animals is advantageous because it can be carried out rapidly and lasts for much of the animal&#39;s life 7,22-25. Tattooing on the paw pads can be better than toe clipping 23 with respect to preserving testable behaviors, for example in suspension or gripping 22,26, although some studies have not noted such deficiencies (e.g., 25). There were no instances of mothers rejecting or cannibalizing pups after tattooing. For other methods of long-term identification of animals, see recent reviews 7,23,24.
Genotyping
A critical feature in our protocol is the use of a fast genotyping method. Although similar genotyping methods were described in previous reports (e.g., 27,28), the system described here has at least two improvements. First, it can tolerate certain variations in the amount of starting tissue, age of animals, and amplicon length. Thus, successful genotyping can be achieved using mice as young as 1 day and as old as 6 months old, and can be carried out using a broad range of primer pairs. Second, this method does not require a stop solution for the DNA extraction step. This eliminates excessive tube handling and pipetting, and allows parallel multi-tube automation of the process with a PCR machine. The number of specimens can be scaled up (e.g., 96 samples) yet processed easily and simultaneously. Also the specimen type is not limited to tail clips; other sample types that could be used include ear punches, toe clippings, whole early embryos, and placenta tissues 2-4,29,30. Different animal species can also be used. Thus the genotyping procedures are reliable (repeatable with low intra-assay variance) and reproducible (low inter-assay variance between runs or between laboratories), and have the advantage of high scalability.
Note that some caution is required for achieving the expected quality of results. First, during DNA extraction, a large variation in the protocol can degrade the results. For example, a significant reduction in the volume of DNA Extraction Solution (e.g.,&#160;from 200 to 100 &#181;l in step 2.2) still allows genotyping, but it can reduce the reliability and result in variation in PCR results. Under such conditions, it is recommended to reduce the volume of the DNA extract from 4 to 2 &#181;l, and increase the volume of H2O from 2 to 4 &#181;l to compensate for the volume change during PCR reactions (step 2.5). Second, at the end of DNA extraction, the solution can be used for PCR immediately without centrifugation in most cases, although the tail will retain its overall structure and will not be completely decomposed. However, the described inversion of the tubes is essential for the purpose of dissociating genomic DNA from the tissue (step 2.4). It is also important to use the top, clear part of the solution, excluding the debris at the bottom of the tube, because inclusion of the latter will lead to inconclusive PCR results. These steps will be effective with minimal time and effort. Equally good results can be obtained by actively vortexing the specimen (in place of the inversions) followed by centrifugation and usage of the supernatant. Third, after the DNA extraction, the DNA can be stored for long-term (e.g., &#62;two weeks). It is recommended to centrifuge the solution using a microcentrifuge (e.g., 3,000-13,000 g at 4 &#176;C for 2 min), transfer the supernatants to new tubes, and store them at -80 &#176;C. When the stored extract is to be used for genotyping, briefly centrifuge the specimen after thawing, and use the supernatant.
Neuronal cultures
Another critical feature of our protocol is the use of a glial feeder layer to establish neuronal cultures at a low plating density. Typically, in primary cultures of mammalian brain neurons, the cells are plated with a relatively high density, on coated coverslips without a glial feeder layer (e.g.,&#160;31-39). When the plating density of neurons is reduced using this method, the initial lack of glial sheet leads to poor neuronal growth and dendritic extension (panels B, C in Figures 8-10), as reported previously 40-42, probably due to poor glial growth 43,44.
Successful, low-density neuronal cultures can be generated by at least three broad types of methods. In one approach, Neurobasal Medium is used as a culture medium. This makes it possible to culture neurons in the absence of a glial feeder layer, and can be used for low-density neuronal cultures 45,46. In a second approach (&#39;Banker-type&#39; and its modification), glial cells are co-cultured with neurons in the same well but are physically separated from them. In this context the glial cells provide &#39;trophic support&#39; to neurons without contacting them directly 1,41,42,47-49. In the third approach, neurons are plated on a pre-established glial feeder layer that supports neuronal growth (e.g., 50-53) (Figures 8-10). Specifically, mouse brain neurons are plated on a glial feeder layer prepared from mice 8,34,54 or rats 41,55,56.
We prefer the last of the three approaches to low-density culture, because the Neurobasal Medium can affect neuronal survival 57, the astrocytic glial cells will be essential in regulating neuronal functions 8,58, and the physical contact between neurons and glial cells may be important. The procedures for culturing the mouse and rat glial cells are similar 59,60, but we have modified them slightly to accommodate for the more rapid in vitro growth of rat vs. mouse glial cells. The procedures for the rat cell culture were modified from 61-63. The use of a glial feeder layer for low-density neuronal cultures makes it necessary to perform rapid genotyping, in order to match the genotype of the feeder layer to that of the neurons within the period between the pups&#39; births and the neonatal deaths or the end of culture window (1-2 postnatal days).
Low-density culture on a glial feeder layer is also an important method when one tries to culture neurons of small nuclei in the brain (e.g.,&#160;the norepinephrine-releasing locus coeruleus, and the dopamine-releasing substantia nigra). Those nuclei contain only a small number of neurons and would inevitably yield low-density cultures 64-67.
Primary cultures are routinely prepared in our laboratory from the CA3-CA1 region of hippocampus, the motor region of the cerebral cortex and the striatum of mice. The same procedures can be used to prepare neuronal cultures representing other brain regions, for example the whole hippocampus (including the dentate gyrus) and the whole cerebral cortex. Rat neurons from brain regions such as the hippocampus and the locus coeruleus are cultured in similar fashion, using the rat glial feeder layer. These cultured neurons are usually used at 1-4 weeks in vitro, with the exact age of the culture depending on the purpose of the experiment. It is of note that some neurons cultured on a glial feeder layer can survive for more than 10 weeks 34,68.
One potential problem of low-density neuronal cultures is that the neuronal properties can be different from those in high-density cultures or in neurons in situ. Comparison of these systems provides an interesting opportunity to study how neuronal development and maturation are affected by multiple factors, such as the neuronal density, the soluble factors secreted from neurons, neuron-to-neuron contact, and glial-neuronal interactions.
In summary, the tattooing-based mouse labeling is long lasting, the genotyping method is rapid, and the culture method allows for plating mouse neurons at low density. The protocol described here can be applied in its entirety to other animal species harboring other genetic mutations. Moreover, individual steps of the protocol can be used for other purposes. Thus the protocol can be used in a wide array of applications based on experimenters&#39; needs.

유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 한 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포. 아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 - 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 준비된 신경교 세​​포층의 것과 일치해야 할 때 속도는 특히 중요하다. 더 구체적인 예로서, 그 유전자형이 새끼 실험의 효율을 최적화하기 위해, 생성 배양에 사용할 것인지를 결정하는 것이 필요할 수있다. 여기에서 우리는 이전의 출판물 2-6, 빠르고 간단하고 신뢰할 수있는 마우스 유전자형에 사용 된 작업 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 꼬리와시중에서 판매하는 키트가 사용된다. 이 프로토콜은 조직으로부터의 단일 핵산 추출 단계를 포함하고, ( &#39;정지 용액&#39;), 핵산 정제 공정이나 종단 버퍼의 이용도를 필요로한다. 유전자형이 방법의 신뢰성은 차이 시험편의 개시 량, 동물의 연령 및 PCR 증폭 산물의 길이에 대하여 소개하는 경우 일련의 테스트의 결과를 제시하여 설명한다. 이 키트는 자동 추출 및 신뢰성의 이점을 제공한다. 포괄적 인 위해, 유전자형 생쥐의 장기 식별 문신의 용도도 설명된다. 문신 (표피 하) 피부의 진피 문신 잉크를 적용함으로써 달성된다 7. 절차가 이러한 꼬리 문신 발가락 등 신체의 다른 부분에 적용 할 수 있지만, 신생아 또는 1 일된 쥐의 발바닥 문신에 기술되고,하기 ANIM모든 연령의 루게릭 병. 또한 절차는 신경교 세포층 2,8의 다른 유형의 최적화에 기초하여 제조, 저농도 마우스 뉴런 도금 및 배양 입증 될 것이다. (; p.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 유전자 TOR1A의 돌연변이에 의해 발생하는 상 염색체 지배적 인 운동 장애 - 우리는 상속 된 신경 학적 장애 DYT1의 근육 긴장의 유전 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 단백질 전개, 단백질 복잡한 분해, 막 인신 매매 및 소포 융합 : 인코딩 된 단백질, torsinA는, 누구의 회원 일반적으로, 보호자와 같은 기능을 수행에서 지원 (단 +) 단백질의 가족, &quot;다양한 세포 활동과 연관 -ATPase를&quot;에 속하는 10-13. 돌연변이 글루탐산에 대한 코돈의에서 프레임 삭제하고 따라서 &#39;조기 발병 일반화 고립 된 근육 긴장 이상&#39;14, 15의 발현으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 경로이 질환에 대한 책임 ophysiological 메커니즘을 제대로 이해 남아있다. 녹아웃 마우스 모델에서, 돌연변이 대립 유전자 Tor1a ΔE로 이하 언급 Tor1a tm2Wtd이다. 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 DYT1의 근육 긴장 이상으로 실행 가능하고 유 전적으로 모방 인간의 환자이며, 반면에 동형 접합 노크에 쥐가 유전 적 배경 (18)에 의해 영향을받는 출생 후 사망에 대기 시간, 출생 16, 17 후 죽는다. 동형 접합 노크에서 마우스의 조기 사망은 동물의 유전자형과의 연결을 문화의 설립이 모두 빠르게 완료되었는지 필요로한다. 유전자형의 다른 예로서, Tfap2a (전사 인자는 AP-2α, 인핸서 2α 단백질 결합을 활성화하는) 사용될 것이다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 증식, 분화, 생존 및 사멸 (19) 같은 다수의 세포 과정을 조절하는 것이 중요하다.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS - tattooing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine Cleanser</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td></tr><tr><td>Machine Drying Agent</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Black Pigment</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Skin Prep Applicator</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Q-tip.</td></tr><tr><td>Skin Prep solution</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &amp;ndash; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &amp;ndash; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td></tr><tr><td>REAGENTS - genotyping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td><td>rpi</td><td>A20090-500&amp;nbsp;</td><td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &amp;micro;g/ml gel volume).</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&amp;nbsp;</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>We use either of these three molecular weight markers.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td></tr><tr><td>PCR tubes, Ultraflux Individual&amp;nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tor1a gene in &amp;Delta;E-torsinA knock-in mice</td><td></td><td></td><td>5&#039;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#039; (forward) and 5&#039;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#039; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&amp;micro;l (~0.16 &amp;micro;M) (reference 2).</td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td><td></td><td></td><td>5&#039;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#039; (forward), 5&#039;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#039; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#039;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#039; (forward), 5&#039;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#039; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#039;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#039; (forward), 5&#039;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#039; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>REAGENTS - cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>See comments section of uridine for more information.</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td><td>BD falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Growth Area, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Growth Area, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (cell number counter) chamber slides</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>Stock solution is prepared at 1,500 units/20 &amp;mu;l = 75,000 units/ml in distilled water.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &amp;micro;m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &amp;micro;m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&amp;ndash;0.12 mm, No. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;(7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), BioUltra, &amp;ge;99.5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 &amp;deg;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 &amp;deg;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Neuronal Supplement) 21&amp;nbsp;</td><td>prepared in the lab</td><td></td><td>Source: reference 69</td></tr><tr><td>Pasteur pipets, 5 &amp;frac34;&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Use this cotton-plugged 5 &amp;frac34;&amp;rdquo; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td></tr><tr><td>Pasteur pipets, 9&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 5 ml&amp;nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 10 ml</td><td>BD falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 25 ml</td><td>BD falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;(7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)), &amp;ge;99.99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, SigmaUltra, &amp;ge;99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, sterile, 0.2 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain, 0.4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td></tr><tr><td>Trypsin, type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#039;-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td></tr><tr><td>REAGENTS - immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - tattooing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&amp;#8211;9</td><td>This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; the toes, or if fine mechanical control is necessary, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting &quot;1&quot; out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.</td></tr><tr><td>EQUIPMENT - genotyping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini&amp;#8211;Sub Cell GT</td><td>BIO&amp;#8211;RAD</td><td>170&amp;#8211;4405</td><td>Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Our PCR reactions for the Tor1a gene in &amp;#916;E-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 &amp;#176;C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 &amp;#176;C for 30 sec, annealing at 58 &amp;#176;C for 30 sec, extension at 72 &amp;#176;C for 2 min. This is followed by final extension at 72 &amp;#176;C for 10 min, and holding at 4 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>Power supply, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated cell counter, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; to 4 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.</td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Clean Bench</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of &quot;Brain Dissection and Cellular Dissociation)&quot;.</td></tr><tr><td>Orbit LS Low Speed Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrifuge)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.

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Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

16.2K 조회수.  University of Iowa Carver College of Medicine.  우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다. 

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

연구

신경과학

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

발생학

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

유전학

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위한 배아 마우스 뇌 혼합 세포 배양

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

저자 스포트라이트: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 마우스 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교세포 배양 확립  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

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utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립