Name: measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum
Uploaded: 2017-03-01T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
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면제 승인 (3002-13)는 CFR 46.101 (45)의 (b) (4) 부여했다, 드 식별 보건부에 따라 조직 샘플 복지부 규정을 사용하여 연구를 수행합니다. 전층 피부 과목 수술로부터 수신된다. 이 기사에서는 조직 소스는 66 세의 백인 여성 유방이다. 엘라스토머 코팅 Coverslips는 1. 준비 <ol><li> 20 mL 유리 바이알에, 5.893 g의 염기 실 가드 184 경화제의 0.107 g을 혼합한다. 총 혼합물의 질량은 (55)의 에이전트 비율을 경화에베이스 6g : 1입니다. </li><li> 균일 성을 보장하기 위해 유리 막대로 혼합 한 후, 모든 기포를 제거하는 진공 탈기 실과 상기 유리 바이알을 놓는다. </li><li> 스핀 코터의 중심에 유리 커버 슬립 (55mm X 25mm)을 놓는다. 커버 슬립의 중심에 혼합물의 ~ 1 ML을 추가합니다. 가위로 잘라 끝으로 5000 μL 피펫을 사용합니다. 스핀 코팅 (60)의 2,000 rpm에서 커버 슬립. <ol><li> 이 페이지를 반복로웠 5-6 기판을 만들 수 있습니다. </li></ol></li><li> 60 ° C에서 12 시간 동안 오븐에서 커버 슬립을 치료. </li><li> 부분적으로 희생 기판으로부터 엘라스토머 필름을 제거하는 면도날을 사용한다. 엘라스토머 필름과 노출 된 유리의 윗면을 표시 씻을 마커를 사용합니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 샘플 마운트 두 마크의 초점 평면 사이의 Z 높이의 차이를 기록하는 원격 포커스 부속품을 사용한다. 이 탄성체 기판 두께, H에 대응한다. </li></ol> 각질층 2. 준비 <ol><li> 60 ° C의 탈 이온수에 반 (DW)로 채워진 유리 비커를 가열하여 수조 및 가열 교반 판을 사용한다. 생물 안전 캐비닛 내부, 4 분 동안 물에 전체 두께 인간의 피부를 체험. </li><li> 즉시 DW 4 분 동안 10 ° C &lt;냉각 넣은 비커에 넣고, 피부 샘플을 옮긴다. 비커를 작성 절반은 생물학적 물질의 튀는을 최소화. </li><li> 구부러진 코의 조직 핀셋을 이용하여 표피를 분리 부드럽게 페트리 접시 비커 장소로부터 피부를 제거. </li><li> 거즈 늘어선 페트리 접시에서 아래로 분리 된 표피에게 기부 쪽을 놓습니다. 기초 층이 완전히 거즈와 접촉해야합니다. <ol><li> 0.25 % (중량 / 부피) 실온에서 6-8 시간 동안 0.1 M 인산 완충 식염수에 용해 IX-S 돼지 췌장 트립신 솔루션을 입력에 거즈를 적시. 거즈 젖은 용기 만 충분히 트립신을 추가합니다. </li></ol></li><li> 조직 핀셋 거즈를 들어 올리고 부분적으로 DW로 채워진 용기에 떠. 조심스럽게 거즈에서 분리 할 수있는 SC 당깁니다. </li><li> SC에 부착 된 상태로 유지 잔류 표피 조직을 제거하기 위해 DW에 각질층을 3 ~ 4 회 반복한다. </li><li> DW에서 0.4 % 글리신 맥스 (대두) 트립신 억제제의 용액에 절연 SC 플로트. 10 분 동안 조직을 선동하는 판 쉐이커를 사용합니다. </li><li> 부분적으로 배양 접시에서 SC 플로트DW 가득합니다. 10 분 동안 조직을 선동하는 판 쉐이커를 사용합니다. </li><li> 실온에서 48 시간 동안 초 미세 플라스틱 메쉬 격리 SC 시트를 건조 (25 ℃, 40 % 상대 습도 (RH)). </li><li> 메쉬에서 SC를 분리하고 원형 구멍 펀치를 사용하여 개별 원형 R = 3mm 반경 샘플을 잘라. 마크 지워지지 않는 마커를 사용하여 작은 나선형 마크 최 얼굴의 중심. 이는 SC의 윗면을 인식하기위한 시각적 큐를 제공합니다. 주 : 씻을 수없는 마크가 건조 변형이 최소가 될 샘플의 중심에 적용되어야한다. 이것은 기록 된 건조 용량 프로파일에 대한 마커의 영향을 최소화한다. </li></ol> 3. 샘플 처리 및 증착 <ol><li> 90 μL 형광 마커 비드를 함유하는 15 mL의 DW에서 30 분 동안 SC 샘플 교반 (515분의 505 nm의 직경을 1 ㎛, 카르 복실 레이트 - 개질 된). 이 예금은 SC 표면에 비즈 참고 : 동안 리터의 증착SC의 비드 ARGE 번호, 그것은 계속해서 얻을 수있는 평면 변형 필드의 공간 해상도를 비드 (12)없이 본 샘플 가장자리 느린 건조 대해 최대화된다. 추가 비드 볼륨의 선택은 따라서 임시해야한다. </li><li> SC 샘플을 제거하고 부분적으로 DW 가득 페트리 접시에 배치합니다. </li><li> 부분적으로 15 ~ 30 °의 얕은 각도로 DW에서 기판을 담그지. </li><li> 기판과 물 계면의 접촉 선에서 플로팅 SC 샘플의 가장자리에 핀. 세로 자연스럽게 주름이나 기포 혼입이없는 기판에 대한 SC 샘플을 적층 할 물로 기판을 회수. </li><li> 단계를 반복 3.4 각 기판 상에 6 SC 샘플까지 배치합니다. 샘플 사이에 적어도 2 ~ 3 밀리미터 간격을두고 기판의 가장자리에 샘플 적층을 피하십시오. 이것은 또 다른 하나의 샘플에 영향을 미치는 건조 변위의 건조를 방지한다. </l난&gt; <li> 60 분 동안 실험실 조건에서 장착 SC 샘플을 건조시킵니다. 이는 SC와 기판 사이의 잔여 물이 증발 할 수 있으며, 전체 조직 유착을 보장합니다. 주 :이 시점에서, SC 샘플 필요한 시간 동안 소망하는 용액에 상하 기판을 배치하여 화학적 또는 화장품 제제 (7, 8)로 처리 할 수있다. 처리 단계 회 반복 단계 3.6 행한다. 건조 후, 기판 SC 샘플들의 불완전 접착 투과광 현미경을 사용하여 확인 될 수있다. 사우스 캐롤라이나 샘플 또는 박리 가장자리 아래에 갇혀 거품은 잘 정의 된 가장자리와 샘플의 명확한 대비 변동을 형성 할 것이다. </li><li> 부분적으로 밀폐 용기에 물이 가득 페트리 접시를 배치하여 습도 챔버를 만듭니다. </li><li> 24 시간 동안 챔버 내로 배치 기판은 99 %의 상대 습도로 평형화한다. 페트르에 기판을 배치하지 마십시오나는 접시. </li></ol> 4. 현미경 환경 제어 <ol><li> 현미경으로 장착 관류 챔버에 접속 된 조습 장치를 통해 환경 조건의 제어를 달성한다. 조습 장치 등의 상세 등 독일어로 제공된다. (2013) 7 리우와 독일 (2015) 8. </li><li> 현미경에 기판을 탑재 기판 위에 관류 챔버를 배치하고, 진공 그리이스를 사용하여 엘라스토머 관류 챔버의 가장자리를 밀봉. </li><li> 일단 장착, 사전 실험에 99 % RH 내부 공기를 평형. 이것은 이전의 실험에 물의 증발을 방지 할 수 있습니다. 섹션 5 또는 7의 영상이 시작되면, 원하는 값으로 내부 공기의 습도를 줄일 수 있습니다. 참고 :이 기사에서는 SC 샘플은 25 % RH에 건조 </li></ol> 비행기 건조 변위 5. 이미지 <ol><li> 반전 microsco을 사용하여 SC 샘플의 이미지를 수집1X 대물 렌즈로 퍼가기. FITC 필터 (503-530 nm의 방출 대역 통과)와 광 엔진을 사용하여 형광 구슬을 자극. 여러 샘플을 자동 XY 스테이지를 사용하여 건조 걸쳐 순차적으로 묘화 될 수있다. </li><li> 기록 형광등 1392 X 1040 픽셀의 해상도로 디지털 CCD 카메라를 사용하여 투과광 화상. 각 이미지의 시야는 전체 SC 샘플을 캡처하는 하나의 이미지를 허용 8.98 X 6.71 mm이다. 16 시간 동안 10 분의 주파수 이미지를 가져 가라. </li></ol> 두께 측정 6. 기판 준비 <ol><li> 일부 작은 플라스틱 모자, 화학 흄 후드에서 1 mL로 실란 (≥98 % 3- 아미노 프로필 트리에 톡시 실란)를 배치합니다. 섹션 1과 5 시간 동안 밀폐 용기에서 뚜껑에서 엘라스토머 기판을 배치합니다. 기판 실란과 접촉 직접 제공 할 수 없습니다. </li><li> 1.5 ML의 튜브 (≥99 % N 다이이 미드 염산염 - - (3- 디메틸 아미노) N) 5 EDC의 밀리그램을 추가합니다. 50 추가EDC에 DW 0 μL. 볼텍스 믹서로 10 초 동안 용액을 교반한다. </li><li> 20 mL의 DW에 0.076 g의 붕산 나트륨 0.1 g의 붕산을 추가합니다. 70 ° C (1H)에 자기 교반기를 사용하여 혼합한다. pH가 7.4이 될 때까지 붕산을 추가합니다. </li><li> 50 ML의 원심 분리기 튜브에 붕산 완충액 20 mL를 넣고. 보레이트 버퍼에 1 ㎛ 구슬 (575분의 535 nm의, 카르 복실 레이트 수정) 60 μL를 추가합니다. 마지막으로, 200 μL EDC 솔루션은 병의 추가합니다. 10 센티미터 직경 페트리 접시에 부어 다음 비드 솔루션을 혼합하기 위해 튜브를 흔들어. </li><li> 컨테이너에서 silanated 기판을 제거하고 그들을 비드 솔루션들로 필름 측 엘라스토머 놓습니다. 포획되는 것을 거품을 방지하기 위해 천천히 마십시오. 두 기판은 각각의 페트리 접시에 맞게됩니다. </li><li> 45 분 동안 비드 용액에 떠있는 기판을 둡니다. </li><li> 다음, 비드 용액으로부터 기판을 제거 언 바운드 구슬을 제거하기 위해 DW에 씻어 핀셋을 사용합니다. </li><li> 공기는 기판을 건조. 를 통해 압축 공기를 불어엘라스토머 필름 표면은 물 반점의 형성을 감소시킨다. </li><li> SC 샘플 증착 될 때까지 구슬의 사진 표백을 방지하기 위해 불투명 한 상자에 기판을 밀봉합니다. </li></ol> SC 7. 이미징 두께 <ol><li> 그러나 부 (3)를 사용하여 기판에 예금 SC 샘플은 DW에 형광 구슬을 추가하지 않고 3.1 단계를 수행합니다. 또한 단계 3.6를 완료하기 전에 피펫 각 증착 SC 시료 표면에 희석 형광 마커 비드 용액 (515분의 505 내지 0.1 ㎛의 직경)의 5 μL 강하를 적용한다. </li><li> 40X 대물 렌즈와 현미경을 사용하여 SC 두께의 측정을 설정합니다. 는 SC-기판 계면에있는 2 개의 비드 층 초점 평면 및 SC의 윗면 사이 Z 높이의 차이를 기록하는 원격 포커스 부속품을 사용하여 시간에 따른 SC 샘플의 두께를 측정한다. </li><li> 3 시간 건조 기간 동안 각 SC 샘플 3 영역의 두께를 측정한다. 두께SC 샘플들의 현재 프레임 (8) 내에서 정상 값에 도달한다. </li></ol> 8. 정량화 및 모델링 조직의 변형 <ol><li> 각 기록 시간 단계에서 형광 이미지에서 공간적으로 해결 평면 건조 변위를 얻기 위해 입자 영상 속도계 (13)를 사용합니다. </li><li> 각각의 방사상 대칭 SC 샘플의 변위 필드에서 방위각 평균 반경 방향 및 방위각 변위 프로파일을 얻기 위해 MATLAB을 사용합니다. 주 : 예를 들어 데이터 세트 (자격 &#39;d.mat&#39;)이 단계와 단계 8.3을 모두 수행 MATLAB 코드 (권리 &#39;PIV-processing.m&#39;)가 보충 정보를 제공하고있다. </li><li> 수축 선형 탄성 circula로 건조 SC를 설명하는 모델 7, 8, 14, 15, 16 방사상 변위 프로파일에 맞는, E.는 SC 가정 탄성률 변형 가능한 탄성 기판에 부착 두께 시간 SC, 반경 R, 및 탄성률 E의 SC를 시변의 R 디스크가 잘 정의 된 일정한 포아송 비를 가지며, ν SC = 0.4 7 8. 최소 최소 제곱 방법을 사용하여 가장 적합를 얻습니다. 참고 : 피팅에 사용되는 모델은 수정 된 베셀 함수의 관점에서 반경 방향 변위를 설명입니다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq2.jpg" /> (1) 와 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq3.jpg" /> , <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq4.jpg" /> 과 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq13.jpg" /> 용어 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq6.jpg" /> 주어진 침투 깊이에 대응 <img alt= &quot;식&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 55336 / 55336eq7.jpg&quot;/&gt;. <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq8.jpg" /> 기판 강성 파라미터를 나타내고; 유효 샘플 크기는 기판의 두께보다 큰 경우. 여기서, 파라미터 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq9.jpg" /> 과 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq10.jpg" /> 각각 기판 두께 포아송 비를 나타낸다. 실리콘 엘라스토머 기판 (17)의 푸 아송의 비 ν = 0.5이다. </li><li> 모델 파라미터는 방사상 변위 프로파일 식 (1)에 맞는 최소 제곱 각 시간 단계에서 α와 β 얻었다. <ol><li> 식을 사용하여 SC 탄성률 E의 SC를 얻을 피팅 파라미터 β를 채택 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq11.jpg" /></li><li> 수축 건조 헤어 구조 강화 시변을 얻었다 피팅 파라미터 α를 사용SS, PSC, 표현을 사용하여, <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55336/55336eq12.jpg" /></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 문서에서는 동적 건조 동작과 인간 SC의 기계적 성질을 측정하는데 사용될 수있는 기술을 설명한다. 이전의 연구는 이러한 기술은 일반적 SC (7, 8)의 동적 거동에 건조 화장품 클렌저 및 보습제로 사용되는 환경 조건 및 화학 제품의 영향을 정량화하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 프로토콜의 주요 단계가 있습니다. 우선, SC 물 함량, 특히 팽윤; 따라서, SC 두께뿐만 아니라 면내 변위 측정 정밀도 탄성률 예측 스트레스 정도 건조 필수적이다. 둘째로, 시료가 완전히 기판에 부착 할 필요가있다. 그들은 매우 건조 변형의 분포에 영향을 미칠 것이며, 반경 방향 변위 정보를 사용하기 때문에 불완전한 접착, 비 방사상 대칭 샘플 또는 작은 구멍이나 눈물 시료 피해야모델 피팅 라. 조습 장치를 사용할 수없는 경우,이 기술이 사용될 수있다. 환경 제어하지 않고, 조직 샘플은 실험실 조건 (12)에 건조합니다. 이와 같이, 실험실 환경을 지속적으로 모니터링하고 유지 건조 동작 같이 결과의 반복성은 온도 및 습도 모두 낮 계절 변동에 의해 영향을받을 것이다한다. 현재,이 기술은 단지 상기 기판에 부착 및 엘라스토머 필름 내의 변형을 유도 할 수있는 샘플로 제한된다. 이 기술이 용이하게 기판 (12)의 탄성률을 감소시켜 작은 면내 변위를 거쳐 시료에 적용 할 수 있지만, 단순히 기판 위에 미끄러 샘플의 결과는 의미가 부족한 것이다. 수많은 생체 내 및 생체 외 기술 평가할 수 건조 거동 및 기계적SC의 속성은 3, 8, 9, 10, 18, 19, 20, 21를보고되었다. 그러나 생체 내 기술은 완전히 기본 표피와 진피 층에서 SC 기계적 변화를 구별 할 수 없습니다. 또한, 전 생체 기술은 일반적으로 만 실험 당 하나의 샘플을 평가할 수 있습니다. 우리는이 문서에서보고 방법은 실험에 따라 평가하는 6 SC 샘플까지 할 수 있습니다. 기판과 환경 챔버의 크기는하지만 더 많은 샘플을 동시에 평가 될 수 있도록 확장 할 수 있습니다. 우리는 기판 경화 및 조직 평형을 제외한 N = 6 SC 샘플 ~ 13 시간이 준비와 테스트를 위해 필요의 시간 척도에 대한 예상하고있다. 비교하면, 우리는 더 필요 축성 tensometry 검사 견적두 번이 기간보다. 훨씬 적은 SC 조직은 tensometry 9 (2.5 cm 2)에 필요한 것들과 비교하여 각각의 샘플 (0.28 cm 2) 당 필요합니다. 이 기술은 상기 SC 조직의 하부에서 증발을 방지하여 더욱 중요한 생리 건조 할 수있다. SC에서 건조 동작 및 역학을 평가하는 것 외에도,이 기술은 또한, 건조시에 응집 막을 형성 중합체 또는 콜로이드 시스템의 연구에 적용 할 수 믿는다.

가장 외부 표피 층 또는 각질층 (SC)의 지질 풍부 매트릭스 (1, 2)에 의해 둘러싸여 응집 각질 세포의 세포로 구성된다. SC의 조성 및 구조적 무결성 미생물 침입을 방지하며, 기계적 힘 과도한 수분 손실 (4) 모두 정확한 저항 배리어 기능 (3)를 유지하기 위해 필수적이다. 유지 또는 피부 보호막 기능을 저하 퍼스널 케어 제품의 용량은 피부 건강 및 화장품 산업 5 중대한 관심사이다. 퍼스널 케어 제품의 일 출원은 SC 6, 7, 8의 기계적 특성을 변경하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 화장품 세정제에 포함되는 계면 활성제는 상당한 탄성률의 증가와의 축적을 일으킬 수조직의 성향을 증가 SC에서 건조 응력, 9, 7 균열합니다. 거의 모든 화장 용 보습제에 함유 글리세롤 SC 부드럽게 조직 파열 가능성을 감소 건조 스트레스 8, 10, 11의 형성을 감소시킬 수있다. 이 문서에 설명 된 방법은 동적 건조 동작 및 제어 환경 7 SC 건조의 기계적 특성, 8 정량화 할 수있다. 이전에, 이러한 기술은 동적 건조 행동 변화 및 SC 조직의 기계적 특성에 다른 화장품의 효과를 해명 할 수있는 것으로 입증되었다. 이것은 간단한 변위로 건조 피팅 부드러운 엘라스토머 기판에 부착 SC 인간 조직의 건조 - 유도 수축을 정량함으로써 달성된다수축성 모델 후 탄성률 추출 피팅 프로파일에서 건조 스트레스. 다중 SC 샘플 시험이 요구되는 경우,이 방법은 일축 tensometry에보다 신속한 대체가 훨씬 적은 조직을 이용하고 샘플 밑면에서 증발을 방지하여 더욱 중요한 생리 건조 제공 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer base</td><td>Dow-Corning</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>Silicone elastomer Curing Agent</td><td>Dow-Corning</td><td>1015311</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 0.1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m yellow green fluorescent 505/515&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8823</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylate 1 &amp;micro;m nile red fluorescent 535/575&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8819</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type II-s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0294</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-Dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer mixer</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>6 mm diameter hole punch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z708860</td><td></td></tr><tr><td>SOLA 6-LCR-SB&amp;nbsp;</td><td>Lummencor light engine</td><td>No.3526</td><td></td></tr><tr><td>Cfi Plan Achro Uw 1X Objective</td><td>Nikon Plan UW</td><td>MRL00012</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40X Oil Objective 1.3 na - 0.20&amp;nbsp;mm wd</td><td>Nikon Plan Fluor</td><td>MRH01401</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-U inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53200</td><td></td></tr><tr><td>Clara-E Camera</td><td>Andor</td><td>DR-328G-C02-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Remote Focus Attachment E-RFA Ergo Design</td><td>Nikon</td><td>99888</td><td></td></tr><tr><td>Ti-S-E Motorized Stage</td><td>Nikon</td><td>MEC56110</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring and modeling contractile drying in human stratum corneum

각질층 (SC)는 가장 표피 층이다. 외부 환경과의 접촉이 조직 층이 모두 클렌징 에이전트 및 주변 수분의 일일 변동에 노출되는 것을 의미한다; 이는 모두 조직의 수분 함량을 변경할 수있다. 심각한 장벽 기능 장애 또는 습도가 낮은 환경에서 수분 함량의 감소는 SC 강성을 변경 및 건조 스트레스의 축적을 일으킬 수 있습니다. 극한의 상황에서, 이러한 요인은 조직의 기계적 파열의 원인이 될 수 있습니다. 우리는 건조시 SC의 기계적 특성의 동적 변화를 정량화하는 고효율 방법을 확립했다. 이 기술은 건조 행동 변화 및 화장품 클렌저 및 로션 트리트먼트 SC의 기계적 특성을 정량화하기 위해 이용 될 수있다. 이것은 엘라스토머 기판에 부착 된 원형 조직 샘플의 공간 분해 면내 건조 변위의 동적 변화를 측정함으로써 달성된다. 면내 방사상 변위 ACQ건조시 uired은 방위각 평균 선형 탄성 수축력 모델에 기초하여 프로파일이 장착되어있다. 건조 스트레스와 SC 탄성률의 동적 변경 후 피팅 모델 정보로부터 추출 할 수있다.

도 1 (a) 형광 비드 (3 부)로 코팅 SC 샘플의 대표적인 형광 화상을 도시한다. 샘플의 상응하는 투과광 화상 (b)로 인해 샘플의 원형 대칭으로 25 % RH에서 16 시간 건조 후에 형성 공간 분해 건조 변위 떨림 플롯 겹쳐 1도에 도시되며,이 변위는 방위각 될 수 평균. 그림 1의 (c) 및 방위각 (U θ, 파란색 파선) 변위 프로파일은 차원 반경 위치, R / R에 대해 도시 (u는 R, 고체 레드 라인) 반경을 보여줍니다. 여기서, R은 R / R = 0 에지를 나타내며 샘플 중심 및 R / R = 1을 나타내고, 평균 SC 시료 반경을 나타낸다. 각 반경 위치에서의 표준 편차가 평균 주위에 음영 영역에 의해 표시된다. 이러한 변동은 주로 SC (3)의 구조의 이질성에 기인 &lt;SUP&gt;, 7, 12. 건조를 통해, 방위각 변위가 작은 남아있다. 방사상 변위 프로파일 단 가장자리와 평형에 도달 할 때까지의 크기로 성장하는 중심으로부터 단조롭게 증가한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig1.jpg" /> 도 1 : 원형 SC 샘플 (6.2 mm 직경)을 25 ± 1 % RH의 환경에서 15 시간 동안 건조시킨 후 탄성률 E = 16 ± 1 kPa의 탄성 중합체와 기판에 부착. 증착에 사용되는 형광 마커 비드 강조 SC 샘플의 (a) 형광 화상은 공간적으로 평면 건조 변위를 해결 트래킹을 행한다. SC에 샘플의 투과광 화상에 중첩 공간 분해 면내 건조 변위 (b) 떨림 플롯. (다) 방위각은 반경 평균 (유, 고체 레드 라인을 R) 및샘플의 방위각 (U θ, 파란색 점선) 변위는 차원 반경 위치, R / R 역모를 꾸몄다. 유의 양수 값은 변위를 수축에 대응 r에. 라인 음영 지역을 둘러싸는 각각의 반경 방향 위치에 대한 평균 표준 편차를 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55336/55336fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 30 분 간격으로 기록 된 정보는도 2 (a) 및 플롯 면내 변위의 시간 변화를 표시한다. SC 평균 두께 H의 SC는,도 2에 도시된다 (b). 처음 2 시간에 걸쳐 발생하는 주로 건조하는 동안 SC의 낮 춥니 다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig2.jpg" /> 도 2 (a)반경 방향 변위 프로파일 전형적인 SC 샘플에 대한 차원 반경 위치 R / R에 대해 도시 25 % RH 조건에서 15 시간 건조 기간 동안 30 분 간격으로 (유, 고체 레드 라인을 R)의 오버레이. 유의 양수 값은 변위를 수축에 대응 r에. (b) 평균 SC 샘플 두께 (시간 SC, N = 3), 건조 시간에 대해 플롯. (c) (a) 최소의 최소 자승 적합 겹쳐 방사상 변위 정보 식 (블루는 파선) (1)에 기록 된 첫 번째와 마지막 방사상 변위 프로파일. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55336/55336fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 피팅의 변위는 수식 (1) 건조 SC의 기계적 특성에 대한 추가적인 통찰력을 제공하여 설명한 선형 탄성 수축력 모델 프로파일. 변위 프로파일<html> 도 2 (c)에 나타낸 바와 같이 t마다 단계는, 최소, 최소 제곱 접근 방법을 사용하여 모델이 장착되어있다. 수축 건조 스트레스, P의 SC 및 탄성률 E SC는이어서 각 시간 단계에서의 모델로부터 추출된다. (3 SC 개별 샘플 기반으로) 이들 파라미터의 평균 변화는도 3에 각각 도시되어있다 (a) 및도 3 (b). 두 매개 변수는 제 2 시간 건조 걸쳐 급격히 증가하고 5 시간 내에 정체기에 도달한다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55336/55336fig3.jpg" /> 도 3 (a) 15 시간 동안 건조 시간에 대해 도시 된, SC 탄성률 E의 SC 평균. (b) 평균 건조 수축 응력 P의 SC는 15 시간 동안 건조 시간에 대해 플롯.&quot;_blank&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Measuring and Modeling Contractile Drying in Human Stratum Corneum

이 문서 공간적 엘라스토머 기판에 부착 된 원형 조직 샘플의 면내 건조 변위를 측정함으로써 확인할 동적 건조 거동 및 각질층의 기계적 특성을 정량화하는 방법을 설명한다. 이 기술은 건조 티슈 기계적 특성을 변경하는 방법을 다른 화학 처리 측정하는데 사용될 수있다.

측정 및 모델링 수축성 건조 인간의 각질층에

Stratum corneum (SC) is the most superficial skin layer. Its contact with the external environment means that this tissue layer is subjected to both ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K 조회수.  Binghamton University.  이 문서 공간적 엘라스토머 기판에 부착 된 원형 조직 샘플의 면내 건조 변위를 측정함으로써 확인할 동적 건조 거동 및 각질층의 기계적 특성을 정량화하는 방법을 설명한다. 이 기술은 건조 티슈 기계적 특성을 변경하는 방법을 다른 화학 처리 측정하는데 사용될 수있다. 

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Resolving Water, Proteins, and Lipids from In Vivo Confocal Raman Spectra of Stratum Corneum through a Chemometric Approach

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in human subjects. This information is very important for skin-related diseases and characterizing skin care product performance. This protocol illustrates a method for confocal Raman spectra collection and the subsequent analysis of the spectral dataset leveraging chemometrics. The goal of this method is to establish a standard protocol for data collection and provide general guidance for data analysis. Preprocessing (e.g., removal of outlier spectra) is a critical step when processing large datasets from clinical studies. As an example, we provide guidance based on prior knowledge of a dataset to identify the types of outliers and develop specific strategies to remove them. A principal component analysis is performed, and the loading spectra are compared with spectra from reference materials to select the number of components used in the final multivariate curve resolution (MCR) analysis. This approach is successful for extracting meaningful information from a large spectral dataset.

Here, we present a protocol for collection of confocal Raman spectra from human subjects in clinical studies combined with chemometric approaches for spectral outlier removal and the subsequent extraction of key features.

화학 측정 접근을 통해 지층 각막의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼에서 물, 단백질 및 지질을 해결

Development of this in vivo confocal Raman spectroscopic method enables the direct measurement of water, proteins, and lipids with depth resolution in ...

연구

화학

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

생체공학

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

건조 공기-LC 인터페이스에 Megamolecular 생체 고분자의 자체 통합을위한 방법

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

<meta charset="utf8"></head><body>유연한 연구 응용을 위한 효율적인 3D 피부 모델

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 비용 효율적인 3D 세포 모델을 통한 피부 모델 다양성 향상

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

의학

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

측정 및 모델링 수축성 건조 인간의 각질층에

요약

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이 비디오의 챕터

화학 측정 접근을 통해 지층 각막의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼에서 물, 단백질 및 지질을 해결

개선 2D 및 3D 스킨

건조 공기-LC 인터페이스에 Megamolecular 생체 고분자의 자체 통합을위한 방법

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화