This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

1. Macromolecular의 크라우 딩 2D 피부 세포 배양에 <ol><li> 종자 50,000 세포 (차 섬유 아세포 또는 기본 각질 세포 또는 기본 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화) 24 웰 플레이트의 웰 당. 대응하는 셀 타입 성장 배지 1 ㎖ 종자 세포. </li><li> 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. </li><li> 오래된 미디어를 취소하고 1 ml의 신선한 미디어는 거대 분자 crowders 100 μM의 아스 코르 빈산을 함유 교체합니다. 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 항생제로 보충 37.5 밀리그램의 DMEM으로 구성된 / ml의 피콜 70, 25 ㎎ / ㎖ 피콜 (400)를 사용하여 섬유 아세포 미디어 (FM)를 구성된 크라우 칵테일을 사용합니다. 무 혈청 미디어, KSFM 또는 CNT-57에서 각질 세포를 성장. FM 50 % 및 50 %의 혈청이없는 배지의 혼합물에 공동 배양을 유지한다. </li><li> 매 2 일 미디어 변화에, 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터 6 일 동안 문화를 품어. </li></ol>피부 세포 배양 2. 형광 면역 염색 <ol><li> 1X PBS로 두 번 세포 배양을 씻으십시오. </li><li> 메탄올 또는 파라 포름 알데히드 (항체 사양에 따라) 중 하나와 세포 배양을 수정합니다. <ol><li> 메탄올 고정하십시오 <ol><li> 나누어지는 500도 각으로 냉 메탄올 ㎕의 10 분 -20 ° C에서 품어. 대기음은 정착액 및 메탄올 폐기물을 폐기합니다. 층류 흄 후드의 공기 건조. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 고정하십시오 <ol><li> 분취 액을 각 웰에 2 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL 및 15 분 동안 실온에서 배양한다. 대기음은 정착액 및 파라 포름 알데히드 폐기물을 폐기합니다. </li><li> 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척. </li><li> 분취 액을 각 웰에 1X PBS 1 ㎖. </li></ol></li></ol></li><li> 항체를 사용하여 형광 면역 염색 <ol><li> 분취 액을 각 웰에 (1X PBS에 희석) 3 % 소 혈청 알부민 500 μl를. 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션0 분. 차단 솔루션을 기음과 폐기합니다. </li><li> 차 항체 <ol><li> 나누어지는 200 차 항체의 μL : 판에서 직접 영상의 경우 : 각 웰에 (1 100 희석 10 %의 염소 혈청) 용액을 실온에서 90 분 동안 품어. </li><li> 나누어지는 차 항체의 50 μL (1 : 100 희석 10 %의 염소 혈청) 솔루션을 파라 필름의 평면 조각 위에 커버 슬립하십시오. 솔루션에 직면 셀 사이드 (세포 커버 슬립의 일부)과 함께 파라 필름에 커버 슬립을 놓습니다. 아니 거품, 전체 셀 측을 커버. 실온에서 90 분 동안 인큐베이션. </li></ol></li><li> 대기음 차 항체 솔루션 및 폐기. </li><li> 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척. </li><li> 이차 항체 <ol><li> 나누어 차 항체 200㎕를 : 직접 플레이트를 영상화 : 각 웰에 (400 희석 한 10 % 염소 혈청) 용액 및 알루미늄 FO로 플레이트를 덮고, 실온에서 30 분간 부화<html> 위원장. </li><li> 나누어지는 차 항체의 50 μL (1 : 400 희석 10 %의 염소 혈청) 솔루션을 파라 필름의 평면 조각 위에 커버 슬립하십시오. 솔루션에 직면 셀 사이드 (세포 커버 슬립의 일부)과 함께 파라 필름에 커버 슬립을 놓습니다. 아니 거품, 전체 셀 측을 커버. 알루미늄 호일로 파라 필름을 덮고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li></ol></li><li> 대기음 차 항체 솔루션 및 폐기. </li><li> 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척. 분취 액을 각 웰에 1X PBS 1 ㎖. </li><li> 설치 <ol><li> 플레이트에서 직접 이미징의 경우 : 설치하지 않습니다. 현미경으로 진행합니다. </li><li> 장착 된 커버 유리 슬라이드에 미디어를 장착에서 : 커버 슬립의 이미징. 알루미늄 호일로 덮여 용기에 드라이 하룻밤. 현미경으로 진행합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 40 배 / 1.30 오일 목표와 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 이미지를 획득. </li></ol>전자 &quot;&gt; 3. 웨스턴 블로 팅 피부 세포 배양의 <ol><li> 1X PBS로 두 번 세포 층을 씻으십시오. </li><li> 나누어지는 각 웰 (6 웰 플레이트 형식)에 용해 버퍼 100 ㎕ (자료 목록 참조). 미세 원심 분리 튜브에 세포 스크레이퍼 전송 용액 세포층 긁어. </li><li> 4 ° C에서 30 분 동안 15,330 XG에 원심 분리기 솔루션입니다. 다른 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 샘플 버퍼 5 μl의 환원제 2㎕의 각 시료 13 μL를 혼합 (자재 목록 참조). 10 분 동안 95 ℃에서 가열 된 샘플. </li><li> 1 분 15,330 XG에 원심 분리기 샘플을 응축 물을 수집합니다. 로드 프리 캐스트 PAGE 겔에 샘플과 약 1 시간 동안 100 V에서 실행합니다. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 분리 전송할 종이 조각 (동일 크기의) 스펀지의 겔 막을 샌드위치. 겔, 멤브레인, 서류와 스폰지 사이에 기포가 없는지 확인에스. 샌드위치 카세트를 닫고 2 시간에서 70 V의 전송을 실행합니다. </li><li> 전송이 완료된 경우, 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 10 ml의 개양귀비 빛 S. 워시 막과 막 부화 확인하십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 10 mL로 차단. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오. </li><li> 90 분 10 ml의 차 항체 (1,000 희석 5 % 우유에 마우스 항 - 콜라겐 VII, LH 7.2, 1)에 품어. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오. </li><li> 30 분 동안 10 ㎖ 차 항체 (: 2000 희석 5 % 우유 염소 항 - 마우스 HRP, 1)와 인큐베이션. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오. </li><li> 카세트에 막을 전송하고 ECL 검출 시약 1 ㎖를 추가합니다. 멤브레인을 통해 명확하고 얇은 플라스틱 시트를 놓습니다. </li><li> 화학 발광을 검출하기 위해, 플라스틱 시트 위에 감광성 필름을 배치하고 카세트를 닫는다. 이 후-5 분, 카세트에서 필름을 제거하고 개발자에 배치합니다. </li></ol> 4. 만들기 및 세포 유래의 매트릭스를 사용하여 <ol><li> 종자 50,000 세포 (차 섬유 아세포 또는 기본 각질 세포 또는 기본 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화) 24 웰 플레이트의 웰 당. </li><li> 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. </li><li> 오래된 미디어를 취소하고 신선한 미디어는 거대 분자 crowders 100 μM의 아스 코르 빈산을 함유 교체합니다. 크라우 칵테일 10 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 보충 된 DMEM으로 구성 37.5 mg의 구성 / ml의 피콜 70 및 25 ㎎ / ㎖의 피콜 400 아세포 미디어 (FM). 각질 세포는 혈청이없는 미디어, KSFM 또는 CNT-57에서 재배된다. 50 % FM 50 % KSFM 또는 CNT-57의 혼합물에 공동 문화를 유지한다. </li><li> 2 일마다 미디어를 변경, 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터 6 일 동안 문화를 품어. </li><li> 세포 유래 마트를 얻을 세포층을 Decellularize× (F-매트 = 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화에서 유래 섬유 아세포 유래 행렬, K-매트 = 각질 세포 유래 매트릭스, 공동 매트 = 매트릭스). <ol><li> 1X PBS로 두 번 세포 층을 씻으십시오. </li><li> 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의 250 μl를 추가합니다. 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 흡인 세포 용 해물. </li><li> 단계를 반복 4.5.2 세 번. </li><li> 워시 증류수 H 2 O에 두 번 행렬을 세포 유래 1X PBS에서 세포 유래 행렬을 유지합니다. 매트릭스 1 주까지 4 ℃에서 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> (F-매트 위에 케 라티노 시드, 예를 들어) 2 차 세포 현탁액을 준비합니다. <ol><li> 대기음 1X PBS. </li><li> 셀에서 파생 된 매트릭스 (F-매트)의 상단에 50,000 각질을 시드. 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. 참고 : 분석 실험이 부착 세포에서 직접 수행 할 수있다. </li></ol></li></ol> 셀 - 5. 특성파생 매트릭스 <ol><li> 형광 면역 염색 : 프로토콜 2를 참조하십시오. </li><li> 간섭 반사 현미경 <ol><li> 프로토콜 4.1-4.5 다음 커버 글라스에에 씨앗 세포. </li><li> 세포 유래의 행렬을 획득 한 후, 프로토콜 2.2에 따라 샘플을 수정합니다. 참고 : 항체 염색는 선택 사항입니다. 필요한 경우, 프로토콜 2.3을 참조하십시오. </li><li> 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 화상 취득을 수행한다. 74mm에서 핀홀을 설정합니다. </li><li> 필터에 대한 빨강 채널 uorescence FL에 대한 간섭을 다시 FL ection 현미경 (IRM) 채널과 BP 575-615 IR에 대한 LP 505을 사용합니다. 사용 IRM 채널에 대한 NT 80/20 및 HFT 405/488/561, NFT (565), 빔 스플리터에 대한 빨강 채널 uorescence FL에 대한 판. 빨강 채널과 HeNe633 IRM으로 채널에 대한 5.0 %의 전력에서 (파장 633 ㎚) uorescence FL에 대한 DPSS 561-10 (파장 561 ㎚) 1.1 %의 전력에서 다음 레이저를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 6. 3D의 Organotypic 피부 공동 문화 <ol><li> 셀 문화 삽입 (6 웰 플레이트 형식), 섬유 아 세포 캡슐화와 콜라겐 젤을 캐스팅. <ol><li> 나누어지는 추운 비커에 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 I 10 ㎖. </li><li> 차가운 DMEM의 1 ML을 추가합니다. 산성 콜라겐을 중화하기 위해 1 M의 NaOH의 0.5 ML을 추가합니다. (1,200,000 섬유 아 세포를 포함하는) 섬유 아세포 현탁액의 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 6 웰 플레이트 내에서 세포 배양 삽입에, 감기 피펫에 솔루션을 전송합니다. 전체 솔루션의 12 ml를 균등하게 6 세포 배양 삽입으로 구분된다. </li><li> 1 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 젤을 품어. </li><li> 겔이 고체화 후, FM의 겔 잠수함. 거대 분자 crowders을 포함, 24 시간 후, 기존의 미디어를 버리고 새로운 용지로 교체합니다. 세포 배양 인서트의 외부로 세포 배양 인서트의 내부에 2 ㎖의이 용액의 부피를 추가한다. </li></ol></li><li> 24 시간 후,콜라겐 젤 위에 각질을 시드. <ol><li> 를 Trypsinize 37 ° C에서 5 분 동안 0.125 % 트립신 / 킬레이트 제를 사용하여 각화. 셀을 제거하고 혈청이 포함 매체와 트립신을 중화하기 위해 조심스럽게 플라스크의 측면을 누릅니다. 세포를 카운트하고 각질 세포 현탁액을 제조 (겔 당 30 만 각질 세포를 200 ㎕의 매체에 현탁). </li><li> 세포 배양 삽입에서 흡인 된 미디어. 젤 위에 각질을 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 젤을 품어. </li><li> 케 라티노 사이트는 겔 표면에 부착 한 후,이 용액에 KSFM 또는 함께 겔 잠수함 CNT-57 세포 배양 인서트의 외부 FM의 세포 배양 삽입물 내부에 2 ㎖의. </li></ol></li><li> 거대 분자 crowders을 포함, 24 시간 후, 기존의 미디어를 버리고 새로운 용지로 교체합니다. </li><li> 침수 문화 7 일 후, 공기 - 액체 인터페이스 문화를 올립니다. <ol><li> 셀 문화 인 이동깊은 웰 플레이트에 ERT. 세포 배양 삽입의 외부에 10 ml의 성층화 미디어를 추가합니다. 세포 배양 삽입 건조의 내부를 유지합니다. </li></ol></li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 문화를 품어하고, 다음 14 일 동안, 3 일마다 미디어를 변경합니다. 주 : 공기 - 액체 계면에서 2 주 후에 피부 당량 (냉동 또는 포르말린 고정 스냅 어느) 성숙 및 수확 할 수있다. </li></ol> 7. 수확 및 특성의 Organotypic의 피부 등가물 <ol><li> 대기음 계층화 미디어. </li><li> 핀셋을 사용하여 종이 타월에 문화가 삽입 전송하고 삽입물의 기지에서 남은 용지를 멀리 줘봐. </li><li> 메스를 사용하여 배양 인서트의 내주면을 따라 절단. </li><li> (애완 동물 막과 함께)에의 Organotypic 피부의 공동 문화를 수정합니다. <ol><li> 스냅 동결 <ol><li> cryomold로 겔 구조를 전송합니다. 10월와 cryomold의 내부를 커버화합물. 10 초 동안 액체 질소에 cryomold를 놓습니다. </li><li> 핀셋을 사용하여, 액체 질소에서 냉동 cryomold을 제거 알루미늄 호일에 포장 및 -80 ° C의 냉동고에 냉동 샘플을 저장합니다. </li><li> 제 7 ㎛의 단면 두께로하는 저온 유지 장치로 샘플을 동결. </li></ol></li><li> 포르말린 고정 <ol><li> &#39;생검 카세트&#39;로 &#39;조직 검사 스폰지 패드&#39;를 놓습니다. 젤 스폰지 패드로 구성 전송합니다. 겔 구조의 상단에 부드럽게 다른 스폰지 패드를 놓습니다. 카세트를 닫습니다. </li><li> 완전히 실온에서 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 카세트 잠수함. 카세트를 제거하고 포르말린 폐기물을 폐기합니다. </li><li> 먼저 에탄올 시리즈 탈수 한 후 점차적으로 왁스 샘플을 침투하여 왁스 블록에 고정 샘플을 포함. 제 마이크로톰와 왁스 블록. </li></ol></li></ol></li><li> 스킨 상당의 특성 <ol><li> 면역 염색 <ol><li> 냉동 섹션의 경우 : <ol><li> 실온에서 1 시간 동안 (1X PBS에 희석) 10 %의 염소 혈청에서 섹션을 인큐베이션. 1X PBS에 세척 부분은 염소 혈청을 제거합니다. </li><li> 일차 항체와 함께 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 100 희석), 실온에서 90 분 동안. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오. </li><li> 이차 항체로 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 400 희석), 실온에서 30 분 동안을 알루미늄 호일로 덮인 용기. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오. </li><li> 마운트는 커브 글라스에 미디어를 장착하여, 슬라이드. 알루미늄 호일 커버 샘플과 밤새 건조 할 수 있습니다. </li><li> 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol></li><li> 포르말린 고정 파라핀 포함 된 섹션의 경우 : <ol><li> 왁스 제거 섹션 (및 재수) 물과 에탄올의 비율을 내림차순 (크실렌 - 100 % 에탄올- 90 % 에탄올 - 80 % 에탄올 - 70 % 에탄올 - 물). 완벽한 솔루션 샘플을 잠수함. 각각의 탈 왁스 단계는 3 분이어야합니다. </li><li> 30 분 동안 1 % 과산화수소 중에서 섹션을 인큐베이션. 5 분 동안 1X PBS 섹션을 씻으십시오. </li><li> 20 분 동안 120 ° C에 구연산 용액 섹션 (10 ㎖ 시트르산 용액을 90 ml의 물에 용해) 부화. 슬라이드는 실온에서 하룻밤 냉각시킵니다. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 (1X PBS에 희석) 10 %의 염소 혈청에서 섹션을 인큐베이션. 1X PBS에 세척 부분은 염소 혈청을 제거합니다. </li><li> 일차 항체와 함께 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 100 희석), 실온에서 90 분 동안. , 1X PBS로 세 번 세척 당 10 분 섹션을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 30 분 동안 (희석하지 않은) HRP 표지 된 폴리머와 섹션을 인큐베이션. 1X PBS, 세 번 세척 당 10 분으로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 미세 원심 튜브에 1 ㎖의 결합원체 1 방울과 DAB 기판 (3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘). 15 초 동안이 솔루션 섹션을 품어 - 5 분​​ (갈색 색상 = 긍정적 인 신호). </li><li> 반응을 중지 흐르는 물에 섹션을 세척합니다. </li><li> 5 분 동안, 헤 마톡 실린과 핵 Counterstain과. 흐르는 물에 섹션을 씻어. </li><li> 1 분 산성 알코올 용액 섹션을 인큐베이션. 흐르는 물에 섹션을 씻어. </li><li> 2 분 동안, 스콧의 수돗물 용액에 섹션을 품어. 흐르는 물에 섹션을 씻어. </li><li> 옵션 : 1 분 동안 에오신 섹션을 품어하고 흐르는 물에 씻는다. </li><li> 크실렌 에탄올 상승 비율의 탈수 부 (- 80 % 에탄올 - 70 % 에탄올을 90 % 에탄올 - 100 % 에탄올 - 크실렌). 샘플이 완전히 스테이지 당 3 분 동안 침수되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마운트는 커브 글라스에 장착 미디어를 사용, 슬라이드. 공기 건조 하룻밤. </li><li> 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol></li></ol></li><li> 투과 전자 현미경 (앵커 피 브릴을 시각화하기 위해) <ol><li> 72 시간 동안 2.5 %의 글루 타르 알데히드에 샘플을 수정합니다. </li><li> 1X PBS에서 워시 샘플, 세 번 세척 당 10 분. </li><li> 작은 조각 (1mm 3)으로 잘라. 실온에서 1 시간 동안 1 % 오스뮴 테트 록 사이드, pH를 7.4에서의 포스트 픽스 샘플. 증류수에 세척 샘플. 주의 : 오스뮴 화이는 독성 및 독성 및 흄 후드에서 신중하게 처리해야한다. </li><li> (- 50 % 에탄올 - 75 % 에탄올 - 95 % 에탄올 - 100 % 에탄올 - 아세톤, 25 % 에탄올) 단계 당 20 분 동안 상승 에탄올 시리즈를 통해 탈수 샘플. </li><li> 100 % 아세톤에 시료를 침지하여 침투 : 아랄 다이 트 수지 (1 : 1)를 밤새 6 : 1이어서 1 시간 동안 3 일에 한 다음 실온에서 30 분, 대. 40 ° C에서 1 시간 동안 신선한 아랄 다이 트 수지의 제 2 변화이어서 실온에서 2 시간, 신선한 아랄 다이의 수지 샘플을 담근다. 세 번째 신선한를 남겨45 ° C에서 1 시간 동안 raldite 수지 변화는 50 ℃에서 1 시간 동안 네번째 신선한 아랄 다이 수지 변화를 떠난다. </li><li> 중합 가능하도록 24 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 유리 칼을 사용하여 단면 시료를 1 ㎛ 두께의 얇은 부분 반을 얻었다. 메틸렌 블루와 얼룩 부분은 조직 학적 관찰합니다. 제 70 nm 인 매우 얇은 섹션을 구하여 구리 그리드 상에 각 부분을 수집하는 샘플. </li><li> 10 분 동안 3 % 납 시트르산 용액을이어서 15 분 동안 5 % 우라 닐 아세테이트 용액으로 염색 섹션. </li><li> 30,000X의 확대 한 투과 전자 현미경 (100 kV의) 이미지를 획득. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+skin:+unique+structures+with+diverse+functions.">Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions.</a> Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).</li><li>Lane, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mutation+in+the+conserved+helix+termination+peptide+of+keratin+5+in+hereditary+skin+blistering.">mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering.</a> Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Niessen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions/adherens+junctions:+basic+structure+and+function.">Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function.</a> J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).</li><li>Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+molecules:+potential+targets+in+pharmacotherapy.">Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy.</a> Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).</li><li>Schaefer, L., Schaefer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteoglycans:+from+structural+compounds+to+signaling+molecules.">Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules.</a> Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).</li><li>Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+reconstruction+in+human+skin+equivalents+is+regulated+by+fibroblasts+and/or+exogenously+activated+keratinocytes.">Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).</li><li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Enhancement+of+Collagen+Matrix+Formation+and+Crosslinking+for+Applications+in+Tissue+Engineering--a+Preliminary+Study.">In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study.</a> Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).</li><li>Lareu, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+deposition+is+dramatically+enhanced+in+vitro+when+crowded+with+charged+macromolecules:+the+biological+relevance+of+the+excluded+volume+effect.">Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect.</a> FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).</li><li>Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulating+a+crowded+intracellular+environment+in+vitro.+dramatically+improves+RT-PCR+performance.">Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance.</a> Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).</li><li>Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+in+vitro+as+means+of+emulating+cellular+interiors:+when+less+might+be+more.">Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more.</a> Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Scar-in-a-Jar:+Studying+antifibrotic+lead+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well.">The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li><li>Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+crowded+interior+of+cells+stabilizes+DNA/DNA+and+DNA/RNA+hybrids-in+silico+predictions+and+in+vitro+evidence.">Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence.</a> Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).</li><li>Satyam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+meets+tissue+engineering+by+self-assembly:+A+paradigm+shift+in+regenerative+medicine.">Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine.</a> Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).</li><li>Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies.">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li><li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+for+Polyvinylpyrrolidone+as+a+Macromolecular+Crowder+for+Enhanced+Extracellular+Matrix+Deposition+and+Cell+Proliferation.">Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation.</a> Tiss Eng C. , (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+Architecture+of+3D+Collagen+Hydrogels+by+Physiological+Macromolecular+Crowding.">Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).</li><li>Dewavrin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Rate+Boosting+of+Collagen+Fibrillogenesis+in+Heterogeneous+Mixtures+of+Crowding+Agents.">Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents.</a> J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).</li><li>Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineered+skin+substitutes:+from+in+vitro+constructs+to+in+vivo+applications.">Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications.</a> Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+effect+on+cartilaginous+matrix+production:+a+comparison+of+two-dimensional+and+three-dimensional+models.">Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models.</a> Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).</li><li>Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+directs+extracellular+matrix+organization+and+mesenchymal+stem+cell+behavior.">Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior.</a> PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).</li><li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecularly+crowded+in+vitro+microenvironments+accelerate+the+production+of+extracellular+matrix-rich+supramolecular+assemblies.">Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies.</a> Scientific Reports. 5, 8729 (2015).</li><li>Ang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding+amplifies+adipogenesis+of+human+bone+marrow-derived+MSCs+by+enhancing+the+pro-adipogenic+microenvironment.">Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment.</a> Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).</li><li>Peng, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Fibroblast+Matrices+Bioassembled+Under+Macromolecular+Crowding+Support+Stable+Propagation+Of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells.</a> J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).</li><li>Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+More+Matrix:+Enhancing+the+deposition+of+dermal-epidermal+junction+components+in+vitro+and+accelerating+organotypic+skin+culture+development,+using+macromolecular+crowding.">Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding.</a> Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).</li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

피부는 수분 손실과 병원균 항목을 방지하여 보호 장벽을 형성한다. 그것은 세 가지 주요 구성 요소로 구성된다; 간질 풍부한 진피 (1), 층상 표피 그 위에 2,3,4와 5,6 사이의 더모 - 표피 접합부. 진피는 주로 콜라겐과 탄성 섬유로 구성되어 있으며 드문 드문 섬유 아세포 (7)로 채워집니다. 대조적으로, 세포가 풍부한 표피 각질 세포의 여러 층으로 구성된다. 가장 안쪽 층의 각질 세포는 증식하고 갱신 끊임없이 피부의 가장 바깥 쪽 층으로 이동 겪는 각질화 층 결과들은 핵 및 세포질 물질을 잃은 말기 분화 각화 세포를 대체 새로운 기저 세포를 제공한다 박리. 진피 - 표피 접합부 기저막의 특정 유형은 tethe 도통 매트릭스 분자로 이루어지는 복합 구조진피에 표피를 RS. 진피의 콜라겐 I 섬유는 콜라겐 VII는 콜라겐 IV 풍부한 라미 densa에 고정되어 미세 섬유를 고정으로 인터레이스. 차례로 정박 필라멘트 (라미닌 5, 콜라겐 XVII 및 인테그린)를 기초 각질 세포의 hemidesmosomes와 라미 densa를 연결합니다. 기저 각질 세포 (지층 basale)는 미분과 suprabasal 층을 형성 계층화뿐만 아니라, 증식 및 갱신 능력을 가지고; 환경과 피부 접촉면을 나타내는 계층 spinosum 등, 지층 granulosum, 마지막 각질층. 각질화 층 기저층에서 욕실 경로 각질 cytokeratins의 발현 패턴을 전환하고 결국 세포 사멸을 거치며 각질화 스스로 싸는 봉투, 공유 트랜스 글 루타 미나 제 활동에 의해 가교되는 특정 단백질의 껍질. 의 복잡한 구조를 포함, 피부와 체외에서의 레이어를 재 작성<html> 피부 - 표피 접합부 및 피부 세포 외 기질, 그리고 각화 과정을 모방하기는 어려운 작업 한 흥미 과학자와 생명 공학자가 있습니다. 예를 들어 피부 조직 공학에서 상당한 진보가 있었다, 환자의 조직 검사에서 피부 세포를 성공적으로 추출 및 환자 유래 피부 세포 (8)을 사용하여 피부의 Organotypic 문화의 생성. 그러나, 문제는 미해결 피부 세포 외 기질 단백질의 불량한 분비 자체와 관련된 차선 피부 모델의 결과를 유지. 또한, 시간은 잠재적으로 거대 crowders의 혼입으로 단축 할 수있는 기간을 현재의 프로토콜을 사용하여 3 차원의 Organotypic 피부 공존 배양을 생성하기 위해 요구되는 4 ~ 8 주 사이에서 변한다. 배양 시간을 줄이면, 시약 비용을 절감 세포 노화의 발생을 감소시키고, 환자의 대기 시간은 제품이 임상에서 사용되어야 줄인다. t &quot;&gt; 거대 분자는 (MMC) 크롤 배제 부피 효과. 이러한 표준 수성 배양 조건 9-13 하에서 지각 인 프로 콜라겐의 단백질 분해 절단을 포함한 효소 반응 속도에 영향을 미친다. MMC 하에서, 효소 반응을 생성하기 위해, 배지에 특정 고분자를 도입하는 것을 포함 혼잡 제어 (10)와 비교하여 프로 콜라겐 절단 혼잡 문화 I 분자 콜라겐의 양이 증가하는 경우에, (14, 15)가 발생 시약의 양을 증가시키지 않고 재촉된다. 콜라겐 프로 콜라겐의 전환으로 콜라겐의 형성을 허용 48 시간 동안 MMC 배양 어셈블리, 섬유 아세포는 최대 4 주 11,16,17 모니터링 솟아 섬유 아세포 배양에 비해 I를 훨씬 더 많은 콜라겐을 얻었다. ECM의 형성, 안정화 및 리모델링에 영향을 미치는 효소의 활동 또한 MMC에 효과 외에도 직접적으로 개선하고 콜라겐을 조절하는 것으로 나타났다섬유화 18,19. 우리는 특히 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포에 피부 세포에 의한 세포 외 기질 (ECM) 생산을 강화하기 위해 여기에 방법을 제시한다. 또, 단층 배양에서 생산 MMC 농축 ECM은 decellularized 순수한 세포 - 유래 매트릭스 (CDM)으로 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 시각화하는 비 전통적인 방법을 사용하고 완전히 MMC 배양 피부 세포에 의해 퇴적 된 ECM을 주셔서 감사합니다. 간섭 반사 현미경은 전형적으로 세포 - 매트릭스 상호 작용 또는 세포 간 유리 접점을 연구에 사용된다. 이 기술은 유리 표면 상에 증착 된 매트릭스의 총량을 확인하기 위해 시스템에서 사용 하였다. 간섭 반사 현미경 존재 및 MMC의 부재에서, 세포 외 기질 성분과 패턴의 측면에서 정보의 대부분의 양을 얻기 위해 면역 형광에 결합시켰다. OrganotypiC 피부 공동 배양 삼차원 환경에서 시험 관내에서 피부 모델에 전형적인 방법이다. 이차원 공동 배양 중요한 정보를 제공 할 수 있지만,이 데이터를 변환하고 다시 본래 입체 구조 인 생체 내 환경에 적용 할 때 한계가있다. 피부 각질 세포, 특히, 편광하고 항상성 및 세포 부착에 필수적인 혀끝과 기저 세그먼트를 포함한다. 또, 케라틴 1 케라틴 (10)과 필라 그린 등 기저층 상기 케 라티노 사이트, 일반적인 suprabasal 단백질의 발현 및 각질 층화 말단 분화 과정에만 존재한다. 말단 분화 전형적인 단층 배양 물에서 거의 존재로서 suprabasal 단백질 발현은 보통 이러한 배양 시스템에서 달성되지 않는다. 따라서,의 Organotypic 문화는 문화 매체에 빠져들 시작,하지만 keratinocyt 구동 공기 - 액체 인터페이스에 해제된다전자 차별화. 이 층화 마커, 심지어 각화 및 표피 생리 일반적으로 더 나은 반사의 발현을 초래한다. 다른 그룹은 이전에 성공적으로 피부의 Organotypic 공동 배양을 생성하고 있지만, 기능적 더모 - 표피 접합 영역의 설정이 문제가되고있다. 여기, 우리는 압축 된 시간 내에, 향상된 기저막과의 Organotypic 피부의 공동 문화를 배양하고 이러한 구조의 성숙을 손상시키지 않고 새로운 방법을 제시한다. 이 체외 모델링을위한 피부 모방 체, 피부 생물학의 연구와 심사 분석의 구색을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Wako</td><td>013-12061</td><td>Cell culture media additive</td></tr><tr><td>Cell culture inserts&amp;nbsp; (6-well format)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td>Organotypic cultures</td></tr><tr><td>Citrate solution</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td>DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)</td></tr><tr><td>Collagen (rat tail)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Organotypic cultures</td></tr><tr><td>CnT-57</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-57</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>DAB Substrate + chromogen kit</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Histology</td></tr><tr><td>Deep-well plate (6-well format)</td><td>Corning</td><td>355467</td><td>Organotypic cultures</td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2106</td><td>Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent</td></tr><tr><td>Electron microscope (TEM)</td><td>&amp;nbsp;JEOL&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;JEM-1010 (100kV)</td><td>Transmission electron microscopy</td></tr><tr><td>Fibroblast media (FM)</td><td></td><td></td><td>High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin</td></tr><tr><td>Ficoll PM70</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0310-05</td><td>Macromolecular crowder</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0300-05</td><td>Macromolecular crowder</td></tr><tr><td>Keratinocyte serum-free media (KSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Cell culture media</td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td>Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).</td></tr><tr><td>Mounting media (Hydromount)</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Fluorescent staining</td></tr><tr><td>Mounting media (Cytoseal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Histology (HRP)</td></tr><tr><td>OCT compound (Tissue Tek)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Embedding for cryotomy</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin antibiotics</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td>Cell culture media additive</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Collagen I antibody</td><td>Abcam</td><td>#ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen Type IV</td><td>Novocastra</td><td>#NCL-COLL-IV</td><td></td></tr><tr><td>Anti-collagen VII</td><td></td><td></td><td>LH7.2 (in house)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Fibronectin antibody</td><td>Abcam</td><td>#ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Reducing agent&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Sample buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0008</td><td>Western blot</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Secondary antibodies (Immunostaining)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#D9542</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11037&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 goat-anti-mouse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;#A-11005</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21441</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat-anti-mouse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies (HRP)</td><td>Dako</td><td>Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse</td><td>undiluted</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Prodotti Chimicie Alimentari</td><td></td><td>Decellularization</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Stratification media&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>10% fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>0.4 mg/ml hydrocortisone</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>5 mg/ml insulin</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>1.8&amp;middot;10-4 M adenine&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>5 mg/ml transferrin</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>2&amp;middot;10- 11 M triiodothyronine&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biopolis Shared Facilities</td><td>0.125% Trypsin/Versene&amp;nbsp;&amp;nbsp; pH 7.0 + 0.3&amp;nbsp;</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr></tbody></table>

improving 2d and 3d skin in vitro models using macromolecular crowding

콜라겐의 당 단백질 패밀리는 현대 조직 공학에서 사용되는 생체 물질의 주요 성분은 인체의 주요 구조 단백질을 나타내고있다. 그것은 특히 피부 모델에서, 결합 조직 및 후속 조직 응집력 차선의 형성의 결과로 악명 느린으로하는 기술 병목 시험관 안의 콜라겐 침착이다. 여기서는 콜라겐 침착의 극적인 향상을 초래 고분자 크롤 (MMC)을 생성하는 피부 배양 물을 차등 적 규모 자당 공중 합체의 첨가를 포함하는 방법을 설명한다. 특히, 피부 섬유 아세포는 컨트롤과 비교하여 MMC하에 콜라겐 I / IV / VII 및 피브로넥틴 상당한 양의 증착. 프로토콜은 또한 immunocy 의해 입증 배양 표면에 유지 된 세포 외 기질 (ECM)의 상당량이 노출 혼잡 세포층을 decellularize하는 방법을 설명tochemistry. 전체 매트릭스 질량 분포 패턴은 반사 간섭 현미경을 사용하여 연구 하였다. 구성과 형태를 변화의 흥미롭게도, 섬유 아 세포, 각질 세포와 공동 배양 생산 세포 유래 매트릭스 (CDM). CDM 따라서 더 많은 임상 적 응용 프로그램으로 이동, 코팅 또는 비계의 현재 사용은 일반적으로 이종 동물 소스에서 피할 수 이차 전지의 파종을위한 &quot;바이오 인공 지지체&quot;로 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 특히 더모 - 표피 접합부 (DEJ)에 ECM 증착을 강화하기에 충분 하였다는 3D-의 Organotypic 피부 공동 배양 모델 콜라겐 VII, 주성분의 침지 단계 MMC의 적용을 설명 의 원 섬유를 고정. 전자 현미경 대조군에 비해, MMC 개발 문화 브릴 고정구의 존재를 확인했다. 고정 원 섬유가 표피에 진피를 밧줄로이, 따라서 중요하다미리 형성된 성숙한 DEJ가 이식 안정성과 전반적인 상처 치유의 관점에서 피부 이식받는 사람을 도움이 될 필요. 또한, 배양 시간은 비용 절감, MMC를 사용하는 경우, 성숙한 구조물을 구하는 3 주 5주에서 응축시켰다.

고분자 쇄도 특히, ECM 증착을 향상시킬 수 있었다 섬유 아세포 배양 제어 비해 더 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴 증착 (도 1, 세포층을도 1a, 콜라겐 I, 1B, 콜라겐 IV, 1C, 피브로넥틴). 탈세 포화되면, 각질 세포 (그림 1, 매트릭스)에 비해 섬유 아세포는 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴의 주요 예금자가 있다고 분명했다. </...

Watch this Scientific Journal Video about Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding at JoVE.com

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

improving-2d-and-3d-skin-in-vitro-models-using-macromolecular-crowding

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

12.4K 조회수.  National University of Singapore.  우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다. 

비디오: Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

연구

생체공학

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>유연한 연구 응용을 위한 효율적인 3D 피부 모델

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 비용 효율적인 3D 세포 모델을 통한 피부 모델 다양성 향상

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

개선 2D 및 3D 스킨

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터