Name: high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells at JoVE.com

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant n&#186; 32003B_127619).

1. 세포 배양 <ol><li> 배양 인간 간암 인 HepG2 세포 6cm (25) 인큐베이터 (5 % CO에서 37 ° C에서 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서이 세포 배양 플라스크 2, 95 % 공기) (시딩 밀도 : 1 × 10 6 세포 25 당 cm 2 세포 배양 플라스크, 37 ° C 배양기에서 배양 시간 : 48 시간, 포화 상태의 세포 밀도 : 25 cm 당 4-5 × 10 6 세포 2 세포 배양 플라스크). </li><li> 세포가 90 % ~ 95 %에 합류 할 때 실험을 수행합니다. </li></ol> 폴라로그래피 산소 센서 2. 높은 해상도 호흡율 교정 <ol><li> 피펫 2.1 oxygraph 챔버로 호흡 버퍼 용액과 연속적으로 안정한 산소 플럭스 신호까지 1 시간 동안 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 사용하여 상기 버퍼 교반폴라로 그래프 산소 센서를 얻을 수있다. 주 : 각 oxygraph 챔버 측정 산소 농도 내 폴라로그래피 산소 전극과 각 챔버 내에 산소 소비량 (유량)을 구한다. 산소 농도 및 산소 소모 속도 (광속)은 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 14 폴라 산소 센서의 공기 보정을 수행한다. 주 : 공기 포화 실험 온도에서 미디어 호흡 매체와 산소 농도 폴라 산소 센서의 교정 번만 매일 아침에 수행된다. 이후 미디어 챔버 및 호흡 신선한 배지에 재현 탁시키고 세포를 제거 할 수는 oxygraph 챔버에 첨가하고, 호흡 속도가 측정된다. 첫 번째 실험 후, 챔버는 세정 될 수 있으며, 추가의 실험 시리즈 t에서 수행 될 수있다추가 교정없이 그는 동일한 챔버. </li></ol> 부착 세포, 계산 세포의 3 트립신 <ol><li> 실험 날에, 25cm 2 세포 배양 플라스크에서 DMEM 대기음. </li><li> 인산 완충 식염수 5 ㎖ (PBS)로 배양 플라스크에서 세포 배양 단층을 헹군다. </li><li> 피펫 0.5 배양 플라스크에서 세포 단층에 (37 ° C의 물 중탕에서 37 ℃로 데워진) 트립신 용액 25 ㎎ / ㎖의 용액 및 인큐베이터 (5 % CO 2에서 37 ° C에서 5 분 동안 배양 95 % 공기). </li><li> DMEM이 세포 배양 플라스크에서 분리 된 세포에 10 % FBS를 함유하고 피펫 팅하여 세포를 정지 피펫 5 ㎖. </li><li> 전송 실온에서 350 × g으로 5 분에서 15 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 세포를 재현 탁시키고 상등액을 가만히 따르다. </li><li> 호흡 버퍼 (13) (T 수 1)의 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. </li><l<html> 난&gt; 세포 계수기를 사용하여 세포를 세어 1 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 호흡 버퍼에이를 재현 탁. 세포 호흡 속도가 휴대폰 번호로 정규화되기 때문에, 정확하고 정밀한 셀 카운터 세포를 계산합니다. </li></ol> 4. 고해상도 호흡율 <ol><li> 공기 교정 (만 회 실행이 2.1-2.2 단계) 후, oxygraph의 챔버로부터 호흡 매체를 흡인 챔버 단계 3.7에서 세포 현탁액 (1 × 106 세포 / ml) 2.1 ml에 추가한다. </li><li> 스토퍼를 삽입하여 oxygraph 실을 닫습니다. </li><li> 계속해서 37 ℃에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 이용하여 세포를 교반 안정된 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다. 주 : 산소 농도 및 산소 플럭스 신호는 데이터 수집 및 분석을위한 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시되는S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 14. </li><li> 그 후, 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 미토콘드리아 호흡 기질 및 억제제를 주입. </li></ol> 호흡율에 의해 본래 세포의 5 디기 토닌 적정 <ol><li> 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × 106 / ㎖)를 준비한다. </li><li> 주사기를 사용하여 챔버 스토퍼 티탄 주입구 세포 현탁액을 포함하는 oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) &#39;주의&#39;2 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡 기록 . 주 : 다음 단계에서의 모든 주사가 ​​주사기를 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 수행된다. 로테의 첨가는 선택적이다 (이것은 역 전자 흐름을 방지 함) 및 디기 토닌 적정 실험을 생략 할 수 있고, 볼6.3 단계. </li><li> oxygraph 챔버에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li><li> oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li><li> oxygraph 챔버 내로 2 mM의 디기 토닌 (2 μM) 2 μl를 주입하고, 산소 안정된 신호가 얻어 질 때까지 2-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li><li> 또 디기 토닌 oxygraph 챔버로 2 mm의 2 μL를 주입하고 안정된 산소 신호가 달성 될 때까지 2-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다. 주 : 세포 디기 토닌 단계적 첨가 셀룰러 산소 소비량의 증가 및 증가 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. </li><li> 챔버에 2 mM의 디기 토닌 단계적 (2-4 μm의 각 단계)의 2-4 μl를 주입 계속합니다. 각 단계 후, 2-5m에 대한 세포 호흡을 기록안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지이다. 주 : 산소 유량 신호가 최대 레벨에 도달 디기 토닌의 상기 주사 호흡 속도를 증가시키지 않는 경우 디기 토닌 분사 중지. 독자는 단계 6.2 및 실험은 다음 프로토콜 7.2 자신 시약 및 사용 얻어진 최적 디기 토닌 농도를 사용하여 실험실에서 디기 토닌 최적 농도를 결정한다. </li></ol> 미토콘드리아 외막 무결성 6. 평가 : 시토크롬 C <ol><li> 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × 106 / ㎖)를 준비한다. </li><li> 세포 현탁액 (1 × 106 / ㎖)를 함유하는 oxygraph 챔버에 8 밀리미터 디기 토닌 (8 μM) 2 μl를 주입하고 5 분간 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> oxygraph 챔버에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μl를 주입 한 세포 respirat 기록안정된 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 이온. </li><li> oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다. 주 : 세포 ADP의 첨가는 단지 I 자극 산소 소비량의 증가를 유발하고, 산소 유량 신호 증가 및 안정화 될 것이다. </li><li> oxygraph 챔버에 4 mM의 시토크롬 C (10 μM)의 5 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 ~ 10 분 동안 세포 호흡을 기록한다. </li><li> 마지막 4 ㎎ / ㎖ oligomycin (2 μg의 / ㎖) 1 μl를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 도달 할 때까지 세포 호흡을 기록한다. </li></ol> 7. 최대한 ADP 자극 호흡 투과성이 인 HepG2 세포의 (주 3) <ol><li> 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × 106 / ㎖)를 준비한다.</li><li> 세포 현탁액을 포함하는 oxygraph 챔버에 8 밀리미터 디기 토닌 (8 μM) 2 μl를 주입하고 5 분간 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 말산 0.8 M (5 mM)을 12.5 μL와 oxygraph 챔버로 글루탐산이 M (10 mM)을 10 μl를 주입한다. 안정된 산소 플럭스 신호까지 녹음 세포 호흡이 달성된다. </li><li> oxygraph 챔버에 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. 주 : 세포 ADP의 첨가는 산소 소비의 증가 및 증가 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. </li><li> oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) &#39;주의&#39;2 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li><li> 그 후, oxygraph 챔버로 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록및 안정화시킨다. </li><li> 그리고, oxygraph 챔버로 A (5 μM) &#39;주의&#39;antimycin 5mM의 2 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li><li> 이어서 0.8mm의 아스 코르 베이트 (1 mM)을 2.5 μl를 주입 한 직후 oxygraph 챔버로 0.2 mM의 TMPD (0.25 mM)을 2.5 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li><li> 마지막 oxygraph 챔버에 1 M 소듐 아자 이드 (5 mM)을 &#39;주의&#39;10 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li></ol> 본래 세포의 8 산소 소비 <ol><li> 단계 프로토콜 4.3-4.1에서 설명한 절차 후 oxygraph 챔버 함유 세포 현탁액 (1 × 106 / ㎖)를 준비한다. </li><li> oxygraph 챔버 포함하는 세포 현탁액의에 4 ㎎ / ㎖ oligomycin (2 μg의 / ㎖) 1 μl를 주입안정된 산소 플럭스 신호 D까지 기록 세포 호흡이 달성된다. </li><li> 나중에 oxygraph 챔버 내로 FCCP 0.2 밀리미터 (0.1 μM) &#39;주의&#39;1 μl를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li><li> oxygraph 챔버 내로 FCCP 0.2 밀리미터 (0.4 μM) 3 μl를 주입하고, 상기 산소 유량 신호가 증가 될 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다. </li><li> 산소 플럭스 신호는 다음의 최대 수준의 더 이상의 증가하고, 도달 할 때까지 oxygraph 챔버로 (챔버 내에서 0.1~2 μM 최종 농도) 0.2 내지 1 mM의 FCCP 중 1-3 μl를 주입하여 0.1 μM 내지 0.3 단계 FCCP를 적정 하락이 시작됩니다. 주 : 산소 신호가 최대 레벨에 도달 할 때 시작 감소 FCCP를 분사 중지. </li><li> 이어서, 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM)와 챔버로 A (5 μM)를 antimycin 5mM의 2 μL 2 μL를 주입. 녹음 호흡 t까지고 산소 플럭스 신호가 감소하고 안정화시킨다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

본 프로토콜의 목적은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 &#39;(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 측정하는 고해상도 호흡율을 사용 하였다. 본 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 세포 산소 소모 속도는 일반적으로 세포의 개수로 표준화되어있다 (pmol의 / [셀 초 X 참조). 따라서, 셀룰러 산소 소비를 모니터링하기 전에, 세포 수가 정확하고 신뢰성있는 측정을 가능하게하는 장치를 사용하는 것이 중요하다. 본 프로토콜에서 자동 세포 계수기 (단계 물질의 프로토콜과 표 3.7) 사용되어왔다. 특히 투과성이 셀에 두 번째 중요한 단계는, 셀 (스텝 프로토콜 3.6)에 재현 탁된다 투과성이있는 호흡 버퍼의 선택이다. 휴대 permeabilization는 intracellula의 손실을 유도 할 수 있기 때문에R 이온, permeabilization 중에 사용 된 배지는 세포 내 환경과 호환되는 것이 매우 중요하다. 따라서, 호흡 버퍼는 세포 내 및 세포 외 환경 (표 1) (13) 모두를 반사하는 조성물 및 삼투압을 함유한다. 또한, 최적의 효과적인 세포 permeabilization 들어, 최적의 최저 유효 농도를 식별하기 위해, 각각의 셀 타입뿐만 아니라 각각의 셀 밀도뿐만 아니라 적정 농도를 디기 토닌 것이 중요하다. 디기 토닌 농도가 너무 낮 으면, 세포 투과성이 될 수 없다. 반대로, 디기 토닌 다량으로 세포의 노출은 미토콘드리아 외막 손상된다. 따라서, 또 다른 중요한 점은 미토콘드리아 외막의 무결성을 조사하는 것입니다. 세포 호흡 능력을 과소 평가하지 않기 위해서는, 호흡율 실험은 생리적 온도에서 수행되는 것이 중요하다 (37 ° C). 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 최대 인해 호흡 광속을 얻기 위해 세포 투과성이 충분한 기판 레벨에서 산소 대 ADP의 확산 제한으로 ADP 양의 포화를 사용하는 것이다. 투과성이 세포의 일부 실험에서, 외인성 기판의 추가 발생할 수 있습니다 및 ADP는 호흡의 속도에 상당한 증가로 이어질하지 않습니다. 이것은 여러 가지 요인에 의해 야기 될 수있다. 예를 들어, 세포를 디기 토닌 Permeabilize 하시려면하는 고농도의 사용은 미토콘드리아 외막을 손상시킬 수있다. 따라서, 하나는 각각의 세포 유형 및 밀도에 대한 최적 농도를 결정 디기 토닌 적정한다. 또한, 디기 토닌의 순도도 매우 중요하고, 세포 permeabilization을위한 최적의 농도를 결정하기 위해 적정해야 순도와 구입 디기 토닌의 새로운 배치로 상당히 다를 수 있습니다 디기 토닌 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 기공 형성 세포 세포막의 여러 종류가있다서로 다른 특성을 가진 에이전트. 예를 들면, 사포닌 디기 토닌보다 온화한 세제이고, 세포의 종류에 따라 적절한 셀 permeabilization 시약이 선택되어야한다. 이러한 로테의 antimycin A와 호흡율 분석에 사용 미토콘드리아 기능의 대부분 억제제 만 에탄올에 용해와 세포 호흡 억제의 oxygraph 챔버와 스토퍼에 충실. 이 문제를 방지하려면 oxygraph 챔버와 스토퍼 각 분석 한 후 95 % 에탄올로 광범위하게 세척해야합니다. 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 모두 그대로과 투과성이 세포 호흡 분석을 위해, 세포 밀도, 유형 및 세포 배양 합류가 호흡 속도에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 예를 들어, 인 HepG2 세포, 우리는 일반적으로 챔버 당 2 백만 세포의 세포 밀도를 사용한다. 호흡율 동안 매우 낮은 세포 밀도를 사용하면 매우 약한 신호를 발생시킬 수있다. 또한 세포 배양 생장이 호흡 속도에 영향을 미칠 수 있다는 것을 관찰했다. 엑사에 대한인 HepG2 세포 (100 % 이상)를 매우 합류 성장 mple는, 그들은 훨씬 적은 산소를 소비한다. 실험 기간 동안 안정적이고 재현 가능한 산소 유량을 얻기 위해 고려해야 할 또 다른 중요한 점의 악기 즉, 폴라 산소 센서 멤브레인 및 경 음악 배경 수정을 정기적으로 교환 고해상도 호흡율의 유지이다. uncoupler FCCP 실험의 경우, 세포 호흡 및 최대 유속이 얻어지지 않고, 대신에 세포 호흡 저해 자극하지 않는 세포 FCCP의 첨가 일 수있다. FCCP의 추가에 따라 세포의 산소 소비의 억제는 FCCP 농도가 최적이 아니었다 너무 높은 것을 나타낼 수 있습니다. 이들 실험의 경우, 각 분석을 위해, 신중 최대 유속을 구하는 FCCP 농도를 적정하는 것이 필수적이다. 고해상도 호흡율의 한계가 수립 그 높은 - 처리량 스크리닝이고용량 - 반응 곡선과 생체 시료의 제한된 양의 시간 코스 실험은 가능하지 않습니다. 이러한 분석의 경우, 하나는 세포 외 유동 분석기와 같은 다른 수단을 사용할 수있다. 기타 제한 내가) 장치가 자동화되지이며, 운영자의 지속적인 존재를 필요로 ⅱ)이 시간 악기, ⅲ)은 한 번에 실행할 수있는 두 개의 챔버 만이 분석을 보유하고, ⅳ) 유지 보수 소요됩니다 이러한 멤브레인 및 교정을 변경하는 등, 많은 시간을 필요로하며, v)를 챔버는 단일 사용하지 않으며 억제제와 오염 될 수 있습니다. 전통적인 폴라 산소 극 장치를 통해 높은 해상도 oxygraph의 장점은 i)는 높은 감도, ⅱ) 생물학적 시료의 작은 수가 필요 III) 호흡 속도가 두 챔버에서 동시에 측정 할 수 있고, ⅳ) 장치 산소 누출을 감소시켰다이다. 외 플럭스 분석을 통해 고해상도 oxygraph 몇몇의 이점은 ⅰ) 낮은 비용이다장치 소모품 기판 uncoupler 억제제 적정 프로토콜 II) 가능성. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향, H 2 세포 호흡, 미토콘드리아 막 전위의 동시 측정 있습니다 O 2, 동일한 챔버에 광 센서를 사용하여 ATP 칼슘 수준.

미토콘드리아 특히 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하기 위해 산소를 사용하여, 세포 에너지 대사에서 중요한 역할을 수행. 그들은 세포 사멸에 여러 인간의 질병에 연루되어있다. 미토콘드리아의 산화 적 인산화 (OXPHOS)은 산소 소모와 ATP 합성과 전자 전달계 따라 전자 수송층을 결합한다. 미토콘드리아 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클은 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH)과 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오티드 등 에너지 풍부한 화합물 (FADH 2)에 단백질, 탄수화물과 지방의 변환에 참여하고있다. NADH와 FADH 2의 전자가 다음 호흡 전자 수송 체인 단백질 복합체로 전송됩니다 (I는 IV합니다) 미토콘드리아 내막에 있습니다. 또한, 두 개의 다른 산화 환원 경로가 전송 체인을 전자에 전자를 전송할 수 있습니다 : ⅰ) 미토콘드리아 전자 전송 flavoprotein (ETF)를 내부 미토의 행렬면에 위치지방산 β 산화에서 chondrial 막 및 소모품 전자; 및 ⅱ) 디 히드 록시 아세톤 포스페이트를 글리세로 산화하고, 미토콘드리아의 전자 전달계에 전자를 공급 글리세 미토콘드리아 탈수소 효소. 복합 IV (최종 전자 수용체)가 2 분자의 물에 산소를 변환 한 산소 분자에 전자를 전송한다. I는 IV로 호흡 전자 전달계 착체에서 전자의 이동이 미토콘드리아 내막에 걸쳐 전기 화학적 구배를 설정 막간 공간 미토콘드리아 매트릭스에서 양성자의 흐름으로 결합된다. 이후, 미토콘드리아 복잡한 V (ATP 신타) 위로 미토콘드리아 매트릭스 내로 수소 이온 및 ATP를 왕복 분자를 합성한다. OXPHOS 함수를 얻을 수있는 다양한 기술과 다양한 미토콘드리아 호흡 상태를 사용하여 생체 내 및 시험관 내에서 평가할 수있다. 격리 된 미토콘드리아 다음 respirato에서RY 상태가 측정 될 수있다 : ⅰ) 기부 미토콘드리아 호흡 (주 1) 미토콘드리아 호흡 쇄 단지 특정 기질을 첨가 한 후, ⅱ) 산소 소비량 (주 2) ⅲ) 최대 미토콘드리아 산소 소비량의 농도를 포화의 추가 후에 아데노신이 인산 (ADP) (주 3), ATP로 변환 ADP 소비 (후 ⅳ) 휴식 호흡) (주 4). 그대로 셀에 다음과 같은 호흡 상태를 측정 할 수있다 : ⅰ) 기저 세포의 산소 소비 내생 기판과 ADP의 존재, ⅱ) oligomycin의 존재 기저 세포의 산소 소비 (oligomycin를 구분 호흡) 및 oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) antimycin A 및 로테 논을 첨가 한 후, III) FCCP 비결 호흡 및 IV) 비 미토콘드리아 호흡. 투과성이 셀에서, 전자 전달계 착체와 ADP의 특정 기질을 첨가하고, 최대 복잡한 의존 호흡 등급의 수UCH와 같은 복잡한 I-은, II-및 IV-따라 호흡 속도는 측정 할 수있다. 세포 호흡의 측정은 단지 I-IV, 미토콘드리아 무결성과 에너지 대사 1, 2, 3에 특정 미토콘드리아의 호흡 능력에 중요한 통찰력을 제공합니다. 고정밀, 해상도 및 감도가 미토콘드리아의 산소 소비량의 측정을 가능하게하는 장치 중 하나가 고해상도 oxygraph 4이다. 고해상도 oxygraph 장치는 주입 포트와 두 개의 챔버를 포함하고, 각 챔버는 폴라 산소 센서가 장착된다. 셀룰러 또는 격리 된 미토콘드리아 현탁액은 호흡계에 지속적으로 교반된다. 미토콘드리아 복잡한 활동 미토콘드리아 기능, 기판 및 억제제를 평가하기 위해 표준 프로토콜 다음 추가 할 수 있습니다. 기질 및 억제제 주입 INT으로 적정 할 수있다상기 oxygraph의 실, 산소 소비 속도 O를 소프트웨어를 사용하여 계산하고 세포의 수를 초당 picomoles로 표시됩니다. 고해상도 호흡율이 증가 감도 및 손상 또는 투과성이 세포와 같은 생물학적 시료의 작은 숫자와 함께 작동하는 기능을 포함하여 전통과 기존의 폴라 산소 전극 장치에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 또한, 각 장치는 두 개의 챔버를 포함하고, 호흡 속도는 산소 농도의 비교를 동시에 기록 할 수있다. 고해상도 oxygraph는 전통적인 산소 폴라 전극 장치에 비해 장치의 챔버에서의 산소 환원 누설의 이점을 갖는다. 최근 셀룰러 산소 소비를 측정하기 위해 개발 된 또 다른 장치는 96 웰 세포 유동 분석기 5이다. 세포 외 플럭스 분석기 대신 폴라 센서의 형광을 갖추고 있습니다. 외의 장점고해상도 oxygraph I이다)은 II)가 24 및 고 처리량 스크리닝을위한 96 개의 웰 플레이트에서 산소 소비를 측정하는 것이 가능하고, 크게 자동화 된 장치에 비해 플럭스 분석 따라서 생물학적 샘플의 하부 양을 필요 및 ⅲ) 휴대 당분 플럭스의 추가 측정이 가능합니다. 고해상도 oxygraph에 비해 세포 외 플럭스 분석기의 단점) 장치와 같은 비 재사용 형광 플레이트와 같은 소모품의 고비용 I를, 그리고 ⅱ) 분석 당 네 화합물 / 웰 주사있다 따라서 시스템은 기판 uncoupler 억제제 적정 프로토콜 가능하지 않습니다. 본 연구에서는 미토콘드리아 호흡을 결정하는 고분해능 호흡율을 사용한다. 셀룰러 산소 소비 실험을 위해, 세포 complexe에 전자를 공급하기위한 외인성 ADP와 산화 미토콘드리아 기질의 진입을 허용하는 투과성이있다호흡기의의. 이 방법은 (많은 기판 세포 impermeant 있습니다) 손상 세포에 비해 뚜렷한 장점입니다 개인 미토콘드리아 단지 호흡 용량의 해부를 할 수 있습니다. 그러나, 세포막 permeabilization은 세포 외 배지로 평형화 세포질 및 세포 외 공간 매질 (세포질 용질 세척) 및 세포 내 공간의 조성물의 장벽을 방해 할 것이다. 손상 된 세포 투과성이 세포의 단점 중 하나는 세제 과량 셀 permeabilization 중에 사용될 경우 미토콘드리아 외막이 손상 될 수 있다는 것이다. 완전한 세포, 기저은 그대로 세포의 결합 및 비 결합 된 호흡을 측정 할 수있다. 이 방법은 통합 된 셀의 호흡 기능을 재생하며 최대 미토콘드리아 전자 견인에 대한 정보를 제공하는 외인성 기질 및 ADP의 첨가없이 그대로 세포의 산소 소비량을 평가RT 용량 6, 7. 투과성이 셀 위에 그대로 셀의 장점 중 하나는 셀룰러 환경이 파괴되지 않고, 미토콘드리아는 세포의 전체 성분과 접촉한다는 것이다. 세포 원형질막 Permeabilize 하시려면 위해 이러한 디기 토닌 세제 8을 사용 하였다. 디기 토닌 과도한 양이 이용되는 경우에는, 미토콘드리아 외막 완전성이 손상 될 수있다. 세포 투과성이 손상되지 않도록 미토콘드리아 외막의 무결성을 확인하기 위해, 디기 토닌 적정 셀룰러 ​​permeabilization 대한 최적 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이 실험을 위해, 세포 호흡 배지에 재현 탁하고 디기 토닌 농도를 측정하고 미토콘드리아 기질 및 ADP 및 호흡 비율의 존재하에 호흡율으로 적정한다. 본래 비 투과성이 세포 호흡 mitocho의 존재 하에서 자극되지ndrial 기판 및 ADP. 그러나, 이후 단계적 디기 토닌 적정 플라즈마 막 점진적 permeabilization 수율 것이고, 최적의 디기 토닌 농도가 얻어진다. 이는 전체 permeabilization에 호흡까지의 증가에 의해 표시됩니다. 품질 및 미토콘드리아 외막 무결성 외인성 시토크롬 C (2), (9)를 첨가하여 확인할 수있다. 시토크롬 C는 미토콘드리아 전자 전달계 10, 11, 12 및 12 kDa의 전자 운반 단백질이다. 이 미토콘드리아 막간 공간에서 지역화, 복잡한 IV 복잡한 III에서 전자를 운반, 산소 소비에 참여하고있다. 미토콘드리아 외막이 손상되면, 시토크롬 C가 해제되고, 미토콘드리아의 산소 소비량이 감소된다. 외인성 시토크롬 C를 첨가하면, 미토콘드리아의 호흡에있는 증가는 나타낸다미토콘드리아 외막을 중단. 투과성이 세포, 기질 및 미토콘드리아 복잡한 활동의 억제에서 다양한 프로토콜 3, 9 다음에 추가됩니다. 미토콘드리아 호흡 복잡한 구동 비율을 조사하기 위해, 예를 들어, 다음의 프로토콜을 사용할 수있다. 세포 투과성으로 한 후, 제 복합체 I은 호흡 사슬 기판으로서 NADH를 생성 한 이후, ADP는 ATP (주 3 중으로 전환 첨가 복잡한 I.의 활성화를 자극 기판 말산 및 글루타메이트에 의해 자극 복잡한 I-따라 호흡). 안정된 신호가 도달하면, 로테 논은 (미토콘드리아 복잡한 내가 억제제) 로테 논은 FADH 2 숙시 네이트 뒤에 복잡한 I.을 억제하고 복잡한 II (주 3, 활성 복잡한 II에 의존하는 호흡)을 활성화하기 위해 투여된다. 복잡한 IV 의존 호흡 제 복합체 III을 측정하기 위해,의존성은 호흡 antimycin의 A (미토콘드리아 복합 III 억제제)을 추가함으로써 억제된다. 그 후, 복잡한 IV에 의존하는 호흡은 아스코르브 산염과 tetramethylphenylendiamine (TMPD)을 투여하여 자극한다. TMPD 따라서 최대 복잡한 IV 의존 호흡률 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨, 미토콘드리아 복잡한 IV 억제제의 첨가 후 호흡 속도를 감산함으로써 계산되고, 호흡 버퍼에 자동 산화 할 수있다. 호흡 실험은 대조군 (자극되지 않은 세포)로서 병렬 하나의 oxygraph 두 챔버, 다른 함유 자극 세포에서 수행 될 수있다. 이들 산소 소비량이 oxygraph 챔버 측정 전에 물론, 세포는 미토콘드리아 기능에 영향을주는 약물, 예를 들면 다양한 방법으로 사전 처리 될 수있다. 이 프로토콜은 개별 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 기능 시험을 허용한다. 또한, 하나의 최대 ADP를 자극 측정 할호흡 팔미 형태 외인성 지방산을 이용하여 투과성이 세포의 (상태 3). (1 몰비 팔미 테이트 : BSA 6)이 프로토콜에서, 소듐 팔미 테이트의 농축 주식 울트라 지방산 자유 소 혈청 알부민 (BSA)와 접합된다. 이후, 제 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡으로 투과성이있다 세포 카르니틴의 첨가에 의해 평가되고, ADP (주 3 최대 호흡)을 첨가하여 팔미 테이트. 그리고,이 상태 oligomycin 4 (주 4O) 및 호흡 조절 비율 (RCR 값)을 모방하기 위해 추가 상태 3 / 상태를 40으로 산출된다. β 산화는 전자 전송 flavoprotein 및 β 히드 록시 - 부티 릴 CoA 탈수소 효소에 의해 전자 전달계에 전달되는 전자 어느 FADH 2 NADH의 (TCA 사이클에 진입) 아세틸 CoA를 제작 및 생성을 촉진한다. 미토콘드리아 팔미-BSA 프로토콜 지방 검사 연구자에 의해 사용될 수있다 지방산 대사의 중심이며 바와타이 산 산화. 그대로 세포에서 활성화 및 미토콘드리아 복잡한 활동의 억제제는 다른 프로토콜 6, 9 다음에 추가됩니다. 이들 실험의 경우, 외래의 기판 부재의 비 투과성이 셀들의 제 산소 소비량 (호흡률 인산화)을 측정한다. 그리고, 비 인산화 호흡률은 미토콘드리아 ATP 합성 효소의 억제제이다 oligomycin 첨가 후에 측정된다. 그 후, protonophore 보닐 시안화 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)을 다양한 농도로 투여하고 최대 비 결합 미토콘드리아 호흡 속도가 측정된다. 이러한 FCCP 같은 Protonophores는 chemiosmotic 그라데이션을 방출하는 양성자의 수동 이동을 허용, 내부 막의 수소 이온 투과성의 증가를 유도 할 수있다. 양성자 투과성의 증가는 산화 호흡 (NO ATP 생산)으로 분리 및 O의 증가를 유도xygen 소비. 이후, 로테 논 및 antimycin A는 미토콘드리아 호흡 억제 첨가하고, 비 미토콘드리아 호흡 다른 호흡 속도로부터 감산된다. 산소 소모 속도는 (닫힘 산소 실) 체적 고유 산소 유량을 나누어 계산 IO 2 pmol의의 X 초 -1 X 10-6 셀 (백만 셀 당 산소 유량) JV, O로 표현할 수있다 2 pmol의의 X 초 -1 X ml의 -1] 세포 농도로 세포 챔버 (볼륨 당 세포의 수 [10 6 세포 ∙ ml의 1]) 15. 셀 당 질량으로 나눈 셀 질량 특정 산소 플럭스 JO 2 pmol의의 X 초 -1 X 밀리그램 -1] 셀당 흐름이고, IO 2 pmol의의 X 초 -1 X 10-6 셀], [밀리그램 ∙ 10 6 셀] 또는 볼륨 별 플럭스, JV, O 2 pmol의의 X 초 -1 X ㎖의 -1], 부피 당 질량으로 나눈 값매화 [mg의 ∙ ml의 1]. JO이 세포 단백질, 세포 건조 중량 또는 부피당 산소 플럭스이다. 고해상도 호흡율을 사용하여, 본 연구에서는, III) 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체를 외인성 시토크롬 C를 사용하여) I를 전체 세포 세포막 permeabilization 최적 디기 토닌 농도 (디기 토닌 적정 분석), ⅱ) 미토콘드리아 외막 무결성 I를 결정하는 프로토콜을 기술 외인성 ADP 미토콘드리아 호흡 쇄 기판과의 존재 디기 토닌 - 투과성이 인 HepG2 세포에서의 II 및 IV 최대 호흡 속도 IV) 기저 외인성 기질의 첨가없이 결합되어 완전한 세포의 최대 비 결합 호흡 (최대 전자 수송 능력) 및 ADP는 일체형 셀의 호흡 기능을 재생.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Countess automated cell counter&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Automated cell counting instrument</td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Chemical, dissolve in DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td>Medium component</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>K-lactobionate</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>High-resolution respirometry instrument</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T 4674</td><td>Chemical</td></tr></tbody></table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

디기 토닌 적정 실험 : 셀룰러 Permeabilization을위한 최적의 디기 토닌 농도의 결정 디기 토닌의 적정 인 HepG2 세포 투과성으로위한 최적 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이들 실험의 경우, 디기 토닌가 로테 논, 숙신산 (미토콘드리아 복합체 II 기판)와 ADP의 포화 량의 존재하에 완전한 세포에서 적정하고, 호흡 속도 기준선 각 후에 측정된다 (복합체 II 의존 상태 3 유도) 적정 (도 1a 및도 1b). 이 실험의 결과는 디기 토닌의 부재 하에서, 세포 호흡 미토콘드리아 기질 및 ADP의 존재 하에서 자극되지 매우 낮은 그대로 비 투과성이 세포 호흡 것을 보여준다. 그러나, 디기 토닌 단계적으로 첨가하면, 세포 세포막은 투과 가능하고 mitochon되고숙시 네이트와 ADP가 세포를 입력 할 때 drial 호흡 (복잡한 II에 의존하는 상태 3) 전체 permeabilization까지 증가한다. 결과는 8-12 μM의 디기 토닌의 농도 permeabilization가 인 HepG2 세포의 ADP 자극 호흡에 최적입니다 것으로 나타났습니다. 디기 토닌 과도한 양이 이용되는 경우에는, 미토콘드리아 외막 완전성이 손상 될 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 디기 토닌 과도한 양이 손상 미토콘드리아 외막 무결성을 나타내는 복소 II 의존 상태 3 호흡의 감소를 유도. 현재와 다음 프로토콜에서, 모든 산소 소모 속도는 폐쇄을 (체적 고유 산소 유량을 나누어 계산 IO 2 pmol의의 X 초 -1 X 10-6 셀 (백만 셀 당 산소 유량)으로 표현되는 산소 챔버), JV, O 2 pmol의의 X 초 -1 X ml의 -1] 휴대 정광로<html> 셀 챔버 내의 이온 (부피 당 세포의 수 [106 셀 X ml의 -1]) 15. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig1.jpg" /> 도 1의 디기 토닌 적정 인 HepG2 세포 투과성으로위한 최적 농도를 결정한다. 청색 라인은 산소 농도를 나타내며; 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 세포가 이용 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (셀 X 초 수)로 표현된다. 고해상도 호흡율에서 (A)는 트레이싱 미토콘드리아 복합체 II 의존 호흡 (실험 1)의 경우, 기판으로서 ADP와 숙신산 디기 토닌 사용. SD ± 수단 (4) 개별 실험 (B) 미토콘드리아 호흡 속도는 발표했다./ 54,985 / 54985fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;을 업로드&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Optimal (최적) 디기 토닌 농도를 사용하여 미토콘드리아 외막 무결성 평가 외부 미토콘드리아 막 무결성에 최적의 디기 토닌 농도 (8 μM)의 효과를 평가하기 위해 세포 디기 토닌과 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이되어이 숙시 네이트의 후속 첨가 한 후 미토콘드리아 호흡의 측정에 따라 시험 (미토콘드리아 복잡한 II 의존 상태 2 휴식 ADP의 부재 호흡) ADP (ADP는 ((ADP는 oligomycin 첨가 한 후, 시토크롬 C의 존재)에서 상태 3 호흡 II 의존 복잡한 자극 억제제를 상태 3 호흡 II - 의존성) 및 사이토 크롬 C 복잡한 자극 도 2에 도시 된 바와 같이, ATP 합성 효소)의 모습을 모방 4. </str옹&gt;, 시토크롬 C가 미토콘드리아 외막에서 시토크롬 C의 손실을 없었다 및 미토콘드리아 무결성이 보존되고있는 것을 나타내는, 디기 토닌을 처리 한 세포의 복잡한 II에 의존하는 상태 3 호흡을 강화하지 않습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig2.jpg" /> 그림 2 : 시토크롬 C는 디기 토닌 (8 μM)을 처리 한 세포의 호흡을 개선하지 않습니다. 고해상도 호흡율를 이용하여 사이토 크롬 c 시험 주제 호흡 추적. 세포는 존재에서 10 mM의 숙시 네이트 (주 2), 2.5 mM의 ADP (주 3) 10 μM 시토크롬 C (주 3의 후속 첨가 한 후 호흡 속도의 측정에 따라 시험 8 μM의 디기 토닌과 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이있다 상태 4. 호흡 속도를 모방하는 2 μg의 / ㎖ oligomycin을 첨가하여 시토크롬 c)는 pmol의 / (SEC로 표현 X 만 달러n 개의 세포). CII : 복잡한 II. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54985/54985fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 디기 토닌 고농도 사용 미토콘드리아 외막 무결성 평가 디기 토닌의 매우 높은 농도는 미토콘드리아 외막 무결성을 손상시킬 수 있음을 입증하기 위해, 우리는 디기 토닌의 고용량을 사용하여 실험을 수행 하였다. 이 실험을 위해, 세포를 40 μM의 디기 토닌 대신 8 μM, 그리고 미토콘드리아 외막의 무결성과 투과성이되어이 숙시 네이트의 후속 첨가 한 후 미토콘드리아 호흡의 측정에 따라 시험 (미토콘드리아 복잡한 ADP의 부재 상태 2 호흡을 쉬고 II-에 따라 다름) , ADP와 시토크롬 C (ADP 복잡한 II 의존 상태 3 호흡을 자극) (ADP 복잡한 II-D 자극oligomycin의 존재 (도 3)의 4 상태를 모방 oligomycin 첨가 한 후 ependent 상태 시토크롬 C의 존재하에 3 호흡). 이 실험의 결과는 시토크롬 C의 손상 미토콘드리아 외막 무결성을 나타내는 미토콘드리아 외막에서 시토크롬 C의 손실을 나타내는 디기 토닌 고용량으로 처리 된 세포의 호흡 향상을 보여준다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig3.jpg" /> 그림 3 : 디기 토닌의 높은 용량 (40 μM)은 미토콘드리아 외막의 무결성을 손상시킨다. 기판으로서 숙신산을 사용 호흡율 고해상도에서 트레이싱. 청색 라인은 산소 농도를 나타내며; 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 세포가 이용 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비는 다음과 같이 표현된다pmol의 / (초 세포의 X 번호). 40 μM의 디기 토닌, 숙시 네이트 (10 mM)을 ADP (2.5 밀리미터), 시토크롬 C (10 μM) 및 oligomycin (2 μg의 / ㎖)의 후속 추가 표시됩니다. CII : 복잡한 II. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54985/54985fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 최대 초과 외인성 기판을 이용하여 투과성이 호흡 인 HepG2 세포 (주 3) ADP 자극 복합 I-은 투과성이 인 HepG2 세포 (1 × 106 세포 / ml) 및 IV의 II- 의존성 ADP 최대 자극 호흡 (주 3) 성공적으로 과량 외인성 기질 (도 4)를 사용하여 측정된다. 이 실험을 위해, 세포에 기재된 기판 및 억제제의 후속 첨가 후 측정 디기 토닌 및 미토콘드리아 산소 소비율으로 투과성이있다 <str옹&gt; 그림 4. 기질 - 효소 억제제 적정 프로토콜 결과 세포가 성공적으로 투과성이 있으며 미토콘드리아 복잡한 활동 외인성 기질의 첨가 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 증가 I, II 및 IV 최대 호흡 속도 (주 3)을 유도하는 것으로 나타났다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig4.jpg" /> 그림 4 : 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3)의 성공적인 측정. 호흡 속도는 pmol의 / (초 X 만 세포)로 표현된다. 세포는 8 μM의 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡 속도으로 투과성이있다은 복잡한 III을 억제 antimycin 복잡한 I, 숙신산 (주 3 복합체 II)를 억제하기 위해 글루타메이트와 말산 (주 3 복합체 I), 로테의 후속 첨가 후 측정 및 아스 코르 베이트 / TMPD 아 지드 화 나트륨은 복잡 IV를 억제한다. 복잡한 IV 호흡 (주 3)이전과 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. CI : 복잡한 I, CII : 복잡한 II, CIV : 복잡한 IV. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54985/54985fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 최대한 ADP 자극 호흡의 실패 측정 투과성이 인 HepG2 세포의 (주 3) 복합 I-은 II- 및 IV 의존성 ADP 최대 자극 호흡 투과성이 인 HepG2 세포 (1 × 106 세포 / ml)의 (주 3) 성공적으로 과량 외인성 기질 (도 5)를 사용하여 측정되지 않는다. 이 실험을 위해, 세포는도 5에 기술 된 바와 같이 기판 및 억제제의 후속 첨가 후 측정 디기 토닌 및 미토콘드리아 산소 소비율으로 투과성이있다. 도 5에 도시 된 바와 같이, </strong&gt;에서 호흡 속도는도 4에 도시 된 결과에 비해 세포 투과성이 매우 낮다. 감소 호흡 레벨에 대한 가능한 설명은 이전 실험에서 미토콘드리아 억제제와 oxygraph 챔버의 오염이다. 이러한 antimycin 및 로테 논 등의 미토콘드리아 억제제는 에탄올에 용해하며 oxygraph 챔버와 스토퍼에 충실 할 수 있습니다. 따라서 oxygraph 챔버 및 스토퍼는 각 실험 후 광범위하게 세척해야한다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig5.jpg" /> 그림 5 : 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3)의 실패 측정. I- 복합체의 실패한 실험의 주제 호흡 흔적은 II- 고해상도 호흡율을 이용하여 투과성이 인 HepG2 세포의 최대 ADP 자극 호흡 (주 3) IV는 구동. 호흡 속도는 다음과 같이 표현된다pmol의 / (초 X 백만 셀). 세포는 8 μM의 디기 토닌 및 미토콘드리아 호흡 속도으로 투과성이있다은 복잡한 III을 억제 antimycin 복잡한 I, 숙신산 (주 3 복합체 II)를 억제하기 위해 글루타메이트와 말산 (주 3 복합체 I), 로테의 후속 첨가 후 측정 및 아스 코르 베이트 / TMPD 아 지드 화 나트륨은 복잡 IV를 억제한다. 복합 IV 호흡 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54985/54985fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 본래 세포의 결합과 비 결합 호흡 인 HepG2 세포의 기저 산소 소비는 oligomycin (oligomycin를 구분 호흡)와 FCCP의 순차적 인 추가 (그림 6)의 존재를 측정한다. BASAL 세포 호흡 속도는 내인성 세포 기질의 존재하에 본래 인 HepG2 세포의 산소 소비를 나타내며, 세포 ATP 요구에 따라 변경할 수있다. Oligomycin를 구분 호흡 속도는 세포의 ATP 회전율을 나타내고 기초 내생 호흡 속도에서 oligomycin를 구분 호흡 속도를 빼서 계산되어 세포 호흡 및 oligomycin에 민감한 호흡 속도를 누출 나타냅니다. FCCP uncoupler의 화학 물질이 순차적으로 기록 된 다른 농도와 최대 비 결합 호흡에 추가됩니다. 본 실험 조건에 대한 최대 비 결합 미토콘드리아 호흡 속도 (최대 전자 전달계 용량) 0.9-1.2 μM FCCP에서 획득된다. 결과는 그대로 인 HepG2 세포에서 FCCP의 이상성 활동을 보여줍니다. 따라서, 각각의 실험 조건에 대해, 최대 비 결합 FCCP는 호흡률을 얻기 위해 적정한다. 커플 링되지 호흡 조절 비율 (uRCR)는 FCCP 나누어 계산oligomycin의 존재 호흡률 의해 비결 호흡률. Oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) oligomycin를 구분 기초 내생 호흡에서 호흡 속도를 빼서 계산한다. 기저 호흡률하여 oligomycin 성 호흡 속도를 나누어 계산 ATP를 합성하는 데 사용되는 미토콘드리아의 산소 소비량의 비율을 나타내는 효율성 결합. 실험의 끝에서, 비 미토콘드리아 호흡 속도를 얻기 위해 미토콘드리아 전자 전달계 억제제를 첨가하고, 비 미토콘드리아 호흡 속도는 모든 결과에서 감산된다. 도 6에 나타낸 실험에서, 비 - 미토콘드리아 호흡 속도가 26 pmol의 / (초 X 백만 셀)의 기초 호흡 속도가 48 pmol의 / (초 X 백만 셀)이다, oligomycin 구분하지 호흡률 7 pmol의 / (SEC X 만 세포), oligomycin에 민감한 호흡 (ATP 회전율) 41 pmol의 / (초 X 만 세포)와 Couplin의g 효율 0.85. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig6.jpg" /> 그림 6 : 결합 그대로 세포의 결합되지 호흡. 인 HepG2 세포의 기저 산소 소비의 대표적인 호흡기 흔적 oligomycin (oligomycin 구분하지 호흡) 고해상도 호흡율을 사용 FCCP의 첨가 순서의 존재 하에서 측정 하였다. 안정된 신호가 도달하면 그 후, 호흡 모든 결과에서 감산된다 로테와 antimycin A를 첨가하고, 나머지 배경 호흡 (비 미토콘드리아 호흡)이 억제된다. 산소 소비 pmol의 / (셀 X 초 수)로 표현된다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54985/54985fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 호흡 버퍼 (13) </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 110 밀리미터 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 밀리미터 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 3.0 밀리미터 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 80 mM의 </td></tr><tr><td> K-락토 </td><td> 60 mM의 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> 타우린 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td> 헤 페스 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.0 g / L </td></tr><tr><td> pH를 </td><td> 7.1 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 호흡 버퍼 조성물.

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High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 &#39;(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

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41.3K 조회수.  University of Bern.  고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다. 

비디오: High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

연구

생화학

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

의학

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

생물학

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 정자 세포의 호흡 측정

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

저자 스포트라이트: 정자 대사와 미토콘드리아 기능을 밝히는 남성 불임 연구 발전 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or enzymes are involved in the pathogenesis of several diseases. Mitochondrial substrate flux can be studied using intact cells, permeabilized cells, or isolated mitochondria. Investigating intact cells encounters several problems due to simultaneous oxidation of different substrates. Besides, several cell types contain internal stores of different substrates that complicate results interpretation. Methods such as mitochondrial isolation or using permeabilizing agents are not easily reproducible. Isolating pure mitochondria with intact membranes in sufficient amounts from small samples is problematic. Using non-selective permeabilizers causes various degrees of unavoidable mitochondrial membrane damage. Recombinant perfringolysin O (rPFO) was offered as a more appropriate permeabilizer, thanks to its ability to selectively permeabilize plasma membrane without affecting mitochondrial integrity. When used in combination with microplate respirometry, it allows testing the flux of several mitochondrial substrates with enough replicates within one experiment while using a minimal number of cells. In this work, the protocol describes a method to compare mitochondrial substrate flux of two different cellular phenotypes or genotypes and can be customized to test various mitochondrial substrates or inhibitors.

In this work, we describe a modified protocol to test mitochondrial respiratory substrate flux using recombinant perfringolysin O in combination with microplate-based respirometry. With this protocol, we show how metformin affects mitochondrial respiration of two different tumor cell lines.

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

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고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법