Name: high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds at JoVE.com

저자 조 및 과학적인 토론을 위한 Tessem 및 핸 콕 연구소의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 저자 코코아 파생된 epicatechin 단위체 분수를 제공 하는 앤드류 Neilson, 박사 (버지니아 공대) 감사 합니다. 이 연구는 JST에 당뇨병 액션 연구 및 교육 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>문화 기능-1 파생 832/13 베타 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스, 10 mM HEPES, 2mm 글루타민, 1 mM 나트륨 Pyruvate, 0.05 m m 2-mercaptoethanol9,10,11 보충 RPMI 1640 ,,1213.</li>
	<li>완전 한 RPMI 1640 미디어의 8 mL을 추가 하 여 10 분 중화 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하는 0.25 %trypsin 2 개 mL를 사용 하 여 T75 플라스 크에서 832/13 셀을 제거 합니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 1.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
	<li>2 x 106 6에서 셀/mL의 조밀도에 접시 832/13 셀 잘 요리.</li>
	<li>호흡 실험을 시작 하기 전에 셀에서 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터에서 48 h에 대 한 문화.</li>
</ol>2입니다. 고해상도 Respirometry에 대 한 셀의 준비
<ol><li>
코코아 파생된 epicatechin 단위체와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 24 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>도금, 후 미디어 24 h 변경 하 고 차량 통제 (3 정) 또는 100 nM 코코아 단위체 (3 정), 37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에는 추가적인 24 h (총 48 h)에 대 한 문화 뒤 832/13 세포 치료.</li>
		<li>낮은 포도 당 분 비 분석 결과 버퍼 (SAB) 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 x 1에 832/13 세포를 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.<ol>
<li>게 10 x SAB 33.32 g의 NaCl, KCl, KH2포4, MgSO4 의 0.7 g의 0.82 g 1.73 g H2O 500 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
			<li>만들기 1 낮은 포도 SAB SAB, 100 µ L의 45% 포도 당, 1 M HEPES, 1 mL의 2 mL x 10의 10 mL와 함께 x 0.25 M CaCl2, 35 %BSA 솔루션, NaHCO3 의 0.21 g의 0.57 mL의 H2O 100 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고. 살 균 필터 마지막 해결책입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curcumin와 832/13 세포 치료.
	<ol>
<li>37 ° C, 5% CO2습도 인큐베이터에서 도금 후 48 h에 대 한 832/13 셀 문화.</li>
		<li>832/13 5 분 Aspirate 버퍼에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 있는 셀을 세척 하 고 832/13 셀 3 h, 낮은 혈당 SAB x 1 매 시간 변경에 대 한 낮은 포도 SAB x 1에 품 어.</li>
		<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 외피의 2.5 h, 후 버퍼를 발음 하 고 낮은 포도 당 SAB 차량 제어 또는 30 분 동안 40 µ M curcumin x 1에 있는 셀을 품 어. 부 화, 다음 버퍼 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수확 하는 고해상도 respirometry에 대 한 트립 신 셀
	<ol>
<li>낮은 포도 SAB x 1에서 3 h 부 화 후 잘 당 0.25 %trypsin 250 µ L로 접시에서 셀을 제거 합니다.</li>
		<li>차량 제어 또는 15 mL 원뿔 튜브에 SAB의 4 mL와의 복합 치료 3 우물에서 트립 신에 셀 결합.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 PBS의 단계 2.3.2에서 900 µ L에서 셀 볼륨의 100 µ L를 희석.</li>
		<li>낮은 포도 SAB 각 챔버에 대 한 적절 한 농도에서 3 mL을 x 1에 있는 셀의 적절 한 수를 희석. 데이터 1 x 106 셀/mL의 농도 가장 효과적인 방법을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
고해상도 respirometry에 대 한 기계적 분리 된 세포를 수확
	<ol>
<li>1 x에서 3 h 부 화 후 낮은 포도 SAB, 1 x 각 낮은 포도 당 SAB 잘하고 부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 기계적 분리와 접시에서 셀 타격의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>차량 통제로 또는 호흡에 대 한 15 mL 원뿔 튜브 3 mL SAB의 총에 대 한 관심의 복합 치료 3 우물에서 세포를 결합 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 고해상도 Respirometry
<ol><li>고해상도 respirometer의 준비입니다.
	<ol>
<li>켜고 고해상도 respirometer respirometer 분석 프로그램을 실행 하 여 바탕 화면에 연결.</li>
		<li>두 약 실 전부에서 70% 에탄올 발음 이 약 실은 45 분의 최소 70% 에탄올에 담근 다.</li>
		<li>각 단계 후 발음 70% 에탄올으로 두 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2O, 각 단계 후 발음과 세 번 챔버 세척.</li>
		<li>DdH2오 챔버 plungers 린스 이 plungers와 티타늄 포트에서 잔여 에탄올을 정리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarographic 산소 센서의 구경 측정입니다.
	<ol>
<li>지속적으로 사용 하 여 자기 볶음 바 데이터 기록 간격 750 rpm 고 37 ° C에서 약 실에 있는 2.0에서 버퍼를 교 반 각 oxygraph 챔버에 낮은 포도 당 SAB 버퍼 x 1의 2.4 mL을 추가 F7 버튼을 탭 열기 s 분류 "시스템". Plungers를 밀어 모든 방법에서 후 렌치 폭 설정에 철회 하 고. 안정적인 산소 유량을 얻을 때까지 1 시간 최소 equilibrate 기계를 하자.</li>
		<li>37 ° C에 실험의 기간에 대 한 기계를 설정 합니다. 800 분극 전압 설정 F7 버튼을 "산소, O2"탭을 열고 2의 이득을 mV. 산소 농도 변화는 안정 되어 있는 하는 동안 적어도 30 분 동안 SAB 버퍼의 산소 농도 equilibrate (2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>산소 농도 안정화에 따라 산소 농도의 변화는 안정 산소 농도 변화의 배경 측정을 설정 하는 영역을 선택 합니다.<ol>
<li>Shift 키를 누른 다, 왼쪽 마우스를 클릭 하 고 선택된 영역에서 마우스를 드래그 하 여 영역을 선택 합니다. 두 챔버의 각각에 해당 하는 각 추적에 대 한 선택한 지역 및 변경 "r1"와 관련 된 문자를 클릭 하십시오.</li>
			<li>왼쪽 하단에 있는 "O2 교정" 상자를 두 번 클릭 하 고 스크린의 모서리를 마우스 오른쪽, r 1으로 "공기 교정"에 대 한 "선택 표시" 버튼을 클릭 고 두 약 실 전부에 대 한 "보정 하 고 클립보드에 복사"를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2.1.5 또는 2.2.5 832/13 베타 세포의 호흡의 평가 단계에서 준비.
	<ol>
<li>1 x 낮은 포도 당 SAB.에 각 약 실 (한 실 제어 차량 취급 셀, 복합 치료 세포 한 챔버)에 샘플의 2.4 mL 로드 기계적 분리 방식 (-20 ° C에서 측정 후 동결)를 사용 하 여 경우 BCA (Bicinchoninic 산) 분석 결과 의해 단백질 정량에 대 한 셀 샘플의 0.5 mL를 유지 합니다.<ol>
<li>모든 방법으로 플런저를 밀어 하 고 잔류 볼륨 발음. 750 rpm 및 모든 후속 단계에 대 한 37 ° C에서 실험을 통해 지속적으로 세포를 저 어. F 4를 클릭 하 여 샘플 로드 되 면 "세포"로 라벨 표시를 확인 합니다.</li>
			<li>30 분에 대 한 샘플을 측정 합니다. 신호 안정화 후 3.2.3에 설명 된 대로 낮은 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 해당 하는 산소 농도 변화의 영역을 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 주사기를 사용 하 여 포트 로드 티타늄 통해 각 챔버에 45% 살 균 포도 당 솔루션 (16.7 m m 최종 농도)의 12.5 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 치료 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "포도". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 산소 농도 변화는이 영역을 선택 합니다. 이것은 16.7 m m 포도 당 독서 하 고 물질로 조건7해당 합니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 5mm oligomycin (2.5 최종 농도) 각 챔버로 로딩 포트를 통해의 1 µ L를 추가 합니다. 확인 표시 측정 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "OligoA". 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. Oligomycin A 억제 ATP synthase 이며 따라서 발생 하는 유일한 산소 유량 전자와 아닌 산화 인 산화7의 누설을 통해.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 최대 호흡 율 설정 될 때까지 1 µ L 단위로 1mm FCCP 추가 합니다. 이 최대한 uncoupled 호흡을 나타냅니다. 3-4 µ L 사이 FCCP 충분 한 (1.5-2.0 µ M 최종 농도) 기능-1 832/13 셀의 최대 uncoupled 호흡을 유도 하는 것 이다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "FCCP" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. FCCP 연결을 푸는 에이전트입니다. 이 uncoupled 호흡7을 측정할 수 있습니다.</li>
		<li>신호 안정화에 도달 하면 로드 포트를 통해 각 실에 1 µ L 5mm Antimycin A (2.5 최종 농도)를 추가 합니다. 처리 추가 3.3.1에 설명 된 대로 "AntiA" 표시 마크를 확인 합니다. 하자 신호 안정화 및 안정 되어 있는 산소 플럭스 달성 될 때까지 세포 호흡을 기록. 3.2.3에 설명 된 대로 곡선의이 영역을 선택 합니다. 참고: Antimycin A 시 토 크롬 C 환 원 효소, ubiquinone 산화를 억제 한다 모든 호흡을 차단. 호흡7을 완전히 막을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 단백질 농도 호흡 정규화에 대 한 측정.
	<ol>
<li>샘플 측정 단백질 샘플13BCA 메서드 사용 하 여 로드 시 유지의 0.5 mL를 사용 하 여.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 희석 하지 않고 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>trypsinized 셀에서 832/13 베타 세포 호흡 계산.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 분석 결과에 mL 사용 당 셀의 수를 입력 합니다. 단위 셀/mL를 변경 세포 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 베타 세포 호흡 계산에서 기계적으로 해리 셀.<ol>
<li>Respirometer 분석 프로그램의 f 3 버튼을 누르면 BCA 분석 결과에서 단백질 계산을 입력 합니다. 밀리 그램 단위 변경, BCA 농도 입력 하 고 SAB. 매체 변경</li>
		<li>선택 하 고 O2 3.2.3에 설명 된 대로 보정 양식으로 입력 하 여 데이터를 정규화 배경 읽기를 선택 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 포도 당, 16.7 m m 포도 당, Oligomycin A, FCCP, 3.3.1에 설명 된 대로 Antimycin A에서에서 읽기의 선택을 확인 합니다.</li>
		<li>Respirometer 분석 프로그램 내에서 단백질 농도 입력 하 고 각 치료 호흡 측정 동안에 대 한 적절 한 평균 값을 선택 후 각 챔버에 대 한 판독을 내보냅니다. 이것은 f 2를 클릭 하 고 다음 클립보드 기능을 "복사"를 추진 하 여 이루어집니다. 이 다른 분석 프로그램에 사용 하기 위해 데이터를 내보냅니다. "O2 슬로프 부정적" 값을 사용 하 여 계산에 대 한.</li>
		<li>자동차의 3-5 독립 실행 처리 컨트롤 및 자연 화합물 기능-1 832/13 베타 세포의 손상 세포 호흡에 미치는 영향을 확인 하기 위해 치료 셀 데이터를 컴파일하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 목적은 그대로 췌 장 베타 세포에서 호흡 속도 측정에 고해상도 respirometry를 사용 하는 것입니다. 이 메서드는 증가 된 포도 당 수준으로 베타 세포 반응의 측정을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자연스럽 게 발생 단위체 epicatechin 또는 curcumin4,5에서 같이 프로토콜 또한 다양 한 화합물과 전처리에 대 한 수 있습니다. 다른 다양 한 화합물과 치료는이 프로토콜을 전처리 (다음과 같이)를 사용 하거나 기본 프로토콜에 대 한 최소한의 수정으로 호흡기 챔버 내에서 치료에 사용 될 수 있습니다.
다양 한 방법으로이 메서드는 수정할 수 있다. 다른 베타 세포 라인을 사용할 수; 그러나, 세포 수와 SAB 세척 시간 실험적으로 결정 해야 합니다. 기본 설치류와 인간의 독도 또한 사용할 수; 그러나, 셀 또는 섬 등가물의 수 또한 실험적으로 결정 해야 합니다. 적어도 하나의 연구는 고해상도 respirometry15를 사용 하 여 섬 산소 소비를 측정 했다. 이 연구는 반응, 당 400 독도 필요 하지만 포도 당 유도 호흡 변화를 측정 하지 않았다. 기본 조직은 고해상도 respirometers16,17함께 사용, 그 실험 문제 해결 후 그대로 독도 사용 수 있습니다. 그러나,이 시험에 필요한 독도의 많은 수를 감안할 때, 산소 소비를 측정의 다른 방법 수 있습니다 더 나은 적합 주 섬 호흡의 측정.
제시 프로토콜 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 세포의 충분 한 숫자가 중요 하다. 우리의 연구 1 x 106 셀/mL의 농도에서 832/13 베타 세포는 포도 당 자극 호흡 측정에 대 한 충분 한 보여줍니다. 0.5 x 10을 사용 하 여 측정6 셀/mL 낮은 포도 당 자극 호흡 및 낮은 신호 대 잡음 비를 설명 했다. 또한, 2 x 106 셀/mL를 사용 하 여 측정 결과 높은 샘플 샘플 변화, 및 산소는 필요한 챔버 다시 산소와 자주 급속 한 세포 죽음에 있는 결과의 급속 한 휴대 전화 사용. 셀의 적절 한 수를 실험적으로 주어진된 셀 라인에 대 한이 중요 한 단계를 해결 하기 위해 결정 되어야 합니다.
두 번째 중요 한 단계는 높은 포도 당 수준에 대응 하는 베타 세포를 준비 하 고. RPMI 1640 문화 미디어는 높은 포도 당 수준. 낮은 포도 당 문화에 높은 포도 당에서 셀을 이동 한다. 1 x에서 3 h 인큐베이션 낮은 포도 당 SAB ~16.7 mM 포도 당의 추가에 대 한 중요 한 응답을 베타 세포에 대 한 충분 하다. 포도 당 이외에 가변 응답에 3 h 결과 보다는 더 적은의 기간을 씻어. 포도 당 응답 문제를 해결 하는 것은 SAB 세척 시간의 길이 늘려 해결할 수 있습니다.
세 번째 중요 한 단계는 측정에 대 한 셀을 준비 하는 방법입니다. 우리의 데이터 trypsin 및 기계적 분리 모두 사용 될 수 있지만, 트립 신 발표 샘플 샘플 변화 보다 일관 된 신호에 갈수록 셀 결과 보여 줍니다. 그러나 두 가지 방법으로 관찰 하는 추세, 트립 신을 사용 하 여 준비 하는 셀 데이터의 힘은 더 큰 유지 되었다. 셀 스크 같은 다른 방법을 사용할 수 있습니다 하는 동안 우리의 데이터 trypsin의 사용 더 적은 샘플 샘플 가변성18,19가장 재현성 결과 귀 착될 것 이다는 것이 좋습니다.
이 방법의 한계는 다음과 같다. 첫째, 두 치료 챔버와 함께이 아니다 높은 처리량 검열 방법. 두 샘플의 각 실행은 기계를 준비 하는 시간을 포함 하 여 3-4 h 걸립니다. 둘째, 셀의 비교적 큰 농도 주어진 ~2.2 mL 챔버 당 필요한 샘플 (또는 ~2.2 x 106 셀)의 분석 결과 대 한 필요 합니다. 분석 결과에 필요한 샘플의 금액, 큰 공급이 가능 하지 않으면 기본 독도 대 한이 도구와 프로토콜의 사용 제한 됩니다. 이 기법에서는 호흡에 대 한 독도 사용 연구 ~ 400 독도/챔버15사용. 이 약, 각각에 대 한 두 개의 마우스에서 독도 챔버20요구할 것입니다. 3 permeabilized 셀 사용 하지 않는 셀을 투과 하지 않은 화합물을 사용 하 여 개별 전자 체인 구성 요소에 치료의 효과 결정 하는 기능 사용할 수는 없습니다.
기존의 방법에 관하여이 프로토콜의 중요 한 장점의 여러 가지가 있습니다. 첫째,이 프로토콜은 다양 한 막 투과성 화합물의 stepwise 적정에 대 한 수 있습니다. 이 필요한 농도의 정확한 결정 허용. 둘째, 그대로 베타 세포의 사용 우리가 cytosolic와 미토 콘 드리 아 포도 당 물질 대사7에 영향을 쿼리할 수 있습니다. 고기를 나타내는 glycolytic 통로, permeabilized 셀을 사용 하는 경우 손실 되는 관측에 변화의 관찰 하 수 있습니다. 셋째, 그대로 셀 수 높은 포도 당에 대 한 응답을 사용 하 여 베타 세포 기능,이 분석 결과의 permeabilized 이체에서의 통계로. 마지막으로,이 프로토콜은 베타 세포 호흡, 호흡을 측정 하는 다른 도구와 함께 존재 하지 않는 사치에 화합물의 영향을 쿼리하려면 다양 한 여러 화합물의 추가 대 한 수 있습니다.
이 방법의 미래 응용 프로그램 ATP, 칼슘, H2O2 레벨 동시 호흡 측정 등과 같은 파라미터를 측정 하는 능력을 포함 합니다. 이 메서드는 또한 지방산 또는 ketones 같은 다른 연료 소스 존재 호흡의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 일부 수정, 측정 인슐린 분 비 수준을 수 반하는 호흡 측정도 가능.

췌 장 베타 세포의 주된 목적은 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 시스템 normoglycemia를 유지 하는 것입니다. 베타 세포 느낄 회람 포도 당 크게 낮은 선호도, 고용량 포도 당 운송업 자 GLUT2 때문에 생리 적 변화 (포도 당 운송업 자 2, Km 16.7 m m)1. 순환 포도 당 수준을 증가,이 높은-용량 낮은 선호도 전송 셀 내에 베타 세포내 포도 당에 있는 비례 증가 촉진 합니다. 포도 당 분해, TCA 사이클 (tricarboxylic 산 주기) 및 높은 세포질 ATP (아데노신 3 인산 염) 수준에서 발생 하는 미토 콘 드리 아 호흡 대사입니다. 높은 ATP 농도 ATP 민감한 K+ 채널, 막 도발은 결과 차단 합니다. 막 도발은 전압 Ca2 + 채널 개방 원인과 기의 후속 릴리스 바인딩된 인슐린과 립2. 베타 세포 기능 장애 제 2 형 당뇨병 (T2D), 각 인 이며, 감소 하 고 가난 하 게 통제 하는 인슐린 분 비 및 궁극적으로 베타 세포 죽음3. 유지 하거나 베타 세포 기능을 개선 하는 메커니즘 T2D에 대 한 치료로 사용 될 수 있습니다.
학문은 자연스럽 게 발생의 유익한 효과 설명 했다 췌 장 beta 세포4공장 기반 화합물. 이 화합물은 증가 베타 세포 증식, 생존, 또는 포도 당 자극 인슐린 분 비를 통해 그들의 효과 할 수 있습니다. 예를 들어, 최근 연구는 단위체 epicatechin 미토 콘 드리 아 호흡 증가 통해 포도 당 자극 인슐린 분 비를 강화 하 고5레벨 셀룰러 ATP를 증가 증명 하고있다. 따라서, 이러한 화합물 기능 베타 셀을 어떻게 증가할 수 있는지 이해 질량 잠재적인 치료로 이러한 화합물을 활용 하는 것이 중요 하다.
세포 호흡은 여러 가지 도구를 통해 측정할 수 있습니다. 고해상도 respirometer의 사용 permeabilized 또는 그대로 셀 인구6화학 변조기의 적정에 대 한 수 있습니다. 이 도구에 따라서 다양 한 정보를 제공 하는 다양 한 농도, 다양 한 화합물의 추가 허용 합니다.
포도 당 대사 및 베타 세포 기능 사이 친밀 한 연결을 감안할 때, 세포 호흡의 측정은 중요 합니다. 세포 호흡의 측정을 수행할 수 있습니다 갖는 각 고유한 장점과 단점7,8permeabilized 또는 그대로 베타 세포를 사용 하 여. 베타 세포의 permeabilization 전자 전송 체인의 다양 한 측면을 측정 한 수, 하는 동안 그것은 beta 세포 포도 당 통풍 관, 신진 대사 호흡을 유도 하는 메커니즘에 관계 없이 이렇게 한다. 따라서, unpermeabilized 베타 세포 호흡의 사용 다양 한 포도 당 수준, 판독으로 산소 소비를 사용 하 여 베타 세포 응답을 결정 하는 매우 유용한 기술입니다.
이 기법의 목적은 그대로 기능-1에서 산소 소비량을 측정 하 832/13 베타 세포 파생입니다. 이 기술은 수 있습니다 unstimulatory 포도 당 조건 (2.5 m m 포도 당)에 대 한 베타 세포의 응답 결정 물질로 포도 당 조건 (16.7 m m 포도 당) 뿐만 아니라. Unpermeabilized 셀 개별적으로 복잡 한 테스트를 허용 하지 않는 하는 동안 I, II 또는 III의 전자 수송 체인, 기술을 다루는 복잡 한 IV 억제 (Oligomycin A) 상태로 호흡 (FCCP 카보닐기 시안-측정 허용 않는다 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), 호흡 (Antimycin A) 완전히 저해. 이 연구에서는 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 뿐 아니라 그대로 unpermeabilized 췌 장 베타 세포, 호흡 측정의 효능을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument for high-resolution respirometry</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 cell line</td><td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Pre-treatment of beta cells</td></tr><tr><td>Cocoa epicatechin monomer</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 beta cell media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose Solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>35% BSA Solution</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>BCA Protein Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>For determining protein concentration</td></tr></tbody></table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

고해상도 respirometry 고립 된 미토 콘 드리 아, 세포와 조직에의 산소 소비량의 측정에 대 한 수 있습니다. 베타 세포는 높은 포도 당 농도에 대 한 응답에서 인슐린 분 비를 통해 통제 혈액 포도 당 수준에 의해 신체에 중요 한 역할을 한다. 인슐린 분 비는 포도 당 대사 및 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 제어 됩니다. 따라서, 본래 베타 세포 호흡 측정 당뇨병을 위한 치료로 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있을 필수적 이다. 그대로 832/13 기능-1을 사용 하 여 우리 세포 호흡에 포도 당 농도 증가의 효과 측정할 수 있는 베타 세포 파생. 이 프로토콜의 효과 결정 하는 하나를 수 있도록 다양 한 화합물의 유무에서 베타 세포 호흡 측정 수 있습니다 화합물 그대로 세포 호흡에 주어진. 여기 우리가 (2.5 m m) 낮은 또는 높은 혈당 (16.7 m m) 존재에서 베타 세포 호흡에 두 개의 자연적 사건 화합물, 단위체 epicatechin curcumin의 효과 보여줍니다. 이 기술은 다른 포도 당 농도 면 전에 서 그대로 베타 세포 호흡에 다양 한 화합물의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

기능 1 832/13 베타 세포 준비 프로토콜에 설명 된 대로 수확을 다양 한 화학 개입 (그림 1A)에 따라 산소 소비에 변조를 시연할 예정 이다. 호흡 증가 16.7 mM 포도 (그림 1B)에 포도 당 농도 증가 때 관찰 됩니다. 호흡은 그대로 셀 Oligomycin a 치료는 줄어 이 호흡은 기저, nonphosphorylating 호흡기 상태로 정의 되는 누설으로 알려져 있다. 최대한 호흡 때 베타 세포 FCCP, ETS 호흡, 또는 전자 전송 시스템 호흡으로 정의 되는 연결을 푸는 에이전트와 함께 처리 됩니다 달성 될 것입니다. 마지막으로, 호흡은 Antimycin a를 이용한 (잔여 산소 소비) 비 호흡기 세포 산소 소비를 참조로 대우 될 때 0으로 떨어질 것 이다.
핸드폰 번호에 차이 크게이 기술에서 얻은 데이터의 품질을 변경 됩니다. 포도 당 유도 호흡은 0.5, 1 및 2 x 106 셀/mL (그림 2A-2 C)에서 측정 했다. 셀 개수와 BCA를 사용 하 여 단백질 분석 실험, 단백질 농도 농도 계산 된 3 개의 테스트 셀에 해당 (2D 그림). 0.5 x 10을 사용 하 여 측정6 셀/mL 포도 당 자극 호흡 (그림 2A), 그리고만 ETS 관련 된 증가 한 호흡을 보여 실패 중요 한 표시 했다. 이 낮은 휴대폰 번호 결과 낮은 신호에 잡음 비율 결과 혼동 한다를 제안 합니다. 마찬가지로, 2 x 106 셀/mL에서 측정 또한 결과 중요 한 변화만 ETS 측정 (그림 2C)에 도달 되 고 통계적 의미에 의해 표시 된 대로. 이것은 아마도 다시 큰 다양성에 결과 샘플에서 샘플 분석 결과 중 약 실 여러 번 산소를 필요. 이러한 데이터는 1 x 106 셀/mL의 농도 중요 한 포도 당 자극 호흡, 누출 및 ETS에서에서 호흡 분석에 필요한 측정 결과 설명 (그림 2B 및 2E).
호흡에 대 한 셀을 제거 하는 두 가지 방법이이 프로토콜에서 제공 됩니다. 측정 37 ° c.에서 완료 되 면 트립 신을 사용 하 여 셀을 제거 하는 것은 효과적 호흡 측정 curcumin (그림 3A)의 존재 또는 부재에 포도 당 자극 호흡의 유지 보수를 보여줍니다 누출 및 ETS 호흡. Curcumin 치료 치료 셀에 셀의 비교 (그림 3B-C) 호흡이 매개 변수들을 변경 보여 줍니다. 호흡 측정 부재 또는 코코아 epicatechin 단위체 (그림 3D)의 존재에는 포도 당 자극 호흡의 유지 보수에도 보여 줍니다 누출 및 ETS 호흡. 코코아 epicatechin 단위체 치료 세포 치료 세포의 비교 뿐만 아니라 누설 및 ETS 호흡 (그림 3E-F) 2.5 m m와 16.7 mM 포도 당, 증가 한 호흡을 보여 줍니다. 이러한 데이터는 curcumin 832/13 베타 세포 호흡 향상 되지 않습니다, 하는 동안 코코아 epicatechin 단위체 않습니다 (그림 3)를 보여 줍니다. Curcumin 포스 활동14억제를 통해 인슐린 분 비를 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 우리의 데이터 그 curcumin 미토 콘 드 리아 기능 변조를 통해 인슐린 분 비를 강화 하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 이미 그 코코아 epicatechin 단위체의 문화 유도 미토 콘 드리 아 전자 수송 체인5의 다양 한 구성의 표현 증명 하고있다. 우리는 또한 (oligomycin 치료에 의해 유도 된) 누수 상태에서 증가 한 호흡 관찰과 ETS (전자 교통 시스템, FCCP에 의해 유도 된). 이 도구를 사용 하 여 미래 연구에 대 한 잠재적인 대상의 수를 제안합니다.
셀의 트립 신 제거 하는 대신, 기계적 분리도 수행할 수 있습니다 37 ° c.에서 완료 될 때 제시 세척 기술을 사용 하 여 호흡 측정 부재 또는 curcumin 또는 코코아 epicatechin 단위체 (그림 4A-C)의 존재에서 수행 했다. 그러나 이러한 데이터는 셀의 트립 신 준비과 관찰 동향 유지 됩니다, 감도 저하 될 것으로 보인다 보여줍니다. 제어 및 코코아 epicatechin 단위체 세포 포도 당 자극 유지 치료, 동안 누출 및 ETS 호흡, curcumin으로 치료 하는 세포만 증가 샘플 샘플 다양성으로 인해 포도 당 자극 호흡을 유지. 트립 신 셀 준비과 관찰 하는 동향 (그림 4D-F)를 유지 했다, 동안 의미 기계적 분리에 의해 도입 된 큰 샘플 샘플 가변성에 아마도 모든 매개 변수에서 감소 하 고 단백질 농도 보다는 셀 번호를 정규화.
이러한 데이터는 그대로 기능-1 832/13 베타 세포의 호흡을 측정 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 신호 대 잡음 비를 최대화 하기 위해 정확한 측정을 위한 최적의 휴대폰 번호와 셀을 준비 하기 위한 선호 하는 방법을 제안 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig1.jpg"> 그림 1 : 그대로 832/13 베타 세포의 대표적인 호흡 곡선. 그대로 832/13 베타 세포 (그림 1A) 2.5 m m 16.7 mM 포도 당, 포도 당 2.5 Oligomycin, 2 µ M (Carbonyl 시안-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)와 2.5 µ M Antimycin A. FCCP에에서 호흡에 대 한 측정 16.7 m m 포도 당 섹션 (그림 1B)의 확장은 포도 당 자극 호흡의 증가 보여 주기 위해 제공 됩니다. 셀 1 x 106 셀/mL의 농도에서 측정 되었다. 기저, nonphosphorylating 호흡 상태는 누출, ETS uncoupled 호흡 용량의 전자 교통 시스템을 참조 하며 후 미토 콘 드리 아 호흡 저해를 이용한 잔류 산소 소비를 말합니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57053/57053fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig2.jpg"> 그림 2 : 832/13 베타 세포 포도 당 유도 호흡 측정에 필요한 수의 결정. 그대로 832/13 베타 세포 (A) x 106 셀/mL (B) 1 x 106 셀/mL, 0.5 또는 (C) 2 x 106 셀/mL의 농도에서 호흡에 대 한 측정 됩니다. (D) x 106 셀/mL, mL/1 x 106 셀, 2 x 106 셀/mL 0.5에 해당 하는 단백질 농도. (E) 0.5 x 106 셀/mL, 1 x 106 셀/mL, 및 2 x 106 셀/mL에서 호흡의 비교. 호흡 16.7 mM 포도 당, 포도 당 2.5 미만 2.5 m m를 측정 했다 Oligomycin, 2 µ FCCP M와 2.5 µ M Antimycin A 조건. 2.5와 16.7 m m 포도와 호흡 베타 세포의 포도 당 자극 호흡 응답을 보여 줍니다. 호흡 oligomycin 후 누출 호흡 (기저, nonphosphorylating 호흡기 상태)를 보여 줍니다. FCCP 후 호흡 (Carbonyl 시안-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 치료 (전자 교통 시스템, ETS의 uncoupled 호흡기 용량)를 보여 줍니다. n = 6 독립 실행. 데이터는 평균 ± SEM.로 수 여 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57053/57053fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig3.jpg"> 그림 3 : 트립 신을 사용 하 여 릴리스 후 832/13 베타 세포의 호흡 측정. 832/13 베타 세포 단위체 코코아 epicatechin의 유무에서 경작 했다 또는 curcumin와 호흡 트립 신을 사용 하 여 셀을 발표 한 후 측정 했다. 호흡 16.7 mM 포도 당, 포도 당 2.5 미만 2.5 m m를 측정 했다 Oligomycin, 2 µ FCCP M와 2.5 µ M Antimycin A 조건. 2.5와 16.7 m m 포도와 호흡 포도 당 자극 호흡을 보여 줍니다. 호흡 oligomycin 후 누출 호흡 (기저, nonphosphorylating 호흡기 상태)를 보여 줍니다. FCCP 후 호흡 (Carbonyl 시안-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 치료 (전자 교통 시스템, ETS의 uncoupled 호흡기 용량)를 보여 줍니다. Antimycin는 치료 후 호흡 잔여 산소 소비 (ROX)를 보여 줍니다. Curcumin 832/13 셀의 (A) 치료 호흡 치료 때문에 적절 한 변화를 유지 한다. (B) 대표 추적 및 (C)의 평균 셀 curcumin와 치료에 대 한 데이터 설명 832/13 베타 세포 호흡에 변화가 없다. 코코아 epicatechin 단위체 832/13 셀의 (D) 치료 호흡 치료 때문에 적절 한 변경 유지합니다. (E) 대표 추적 및 (F) 코코아 epicatechin 단위체 치료 셀 보여줍니다 코코아 epicatechin 단위체 치료 후 모든 매개 변수에서 증가 한 호흡에 대 한 데이터의 평균입니다. (G) 모든 세 개의 매개 변수가 비교를 위해 함께 제공 됩니다. n = 6 독립 실행. 데이터는 평균 ± SEM.로 수 여 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * p < 0.0001. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57053/57053fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig4.jpg"> 그림 4 : 기계적 분리를 사용 하 여 릴리스 후 832/13 베타 세포의 호흡 측정. 832/13 베타 세포 단위체 코코아 epicatechin의 유무에서 경작 했다 또는 curcumin와 호흡 기계 분리를 사용 하 여 셀을 발표 한 후 측정 했다. 호흡 16.7 mM 포도 당, 포도 당 2.5 미만 2.5 m m를 측정 했다 Oligomycin, 2 µ FCCP M와 2.5 µ M Antimycin A 조건. 2.5와 16.7 m m 포도와 호흡 베타 세포의 포도 당 응답을 보여 줍니다. 호흡 oligomycin 후 누출 호흡 (기저, nonphosphorylating 호흡기 상태)를 보여 줍니다. FCCP 후 호흡 (Carbonyl 시안-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 치료 (전자 교통 시스템, ETS의 uncoupled 호흡기 용량)를 보여 줍니다. 데이터의 평균 셀 (A) 치료 셀 또는 셀 (B) curcumin으로 치료 또는 (C) 코코아 epicatechin 단위체 보여 그 기계적 분리 유지 누출 동안 모든 치료에 포도 당 자극 호흡 및 ETS의 curcumin 치료 셀에만 손실 됩니다. (D) curcumin 또는 (E) 코코아 epicatechin 단위체 치료 셀의 비교 curcumin와 호흡에 중요 한 변화 없이 코코아 epicatechin 단위체와 모든 매개 변수에서 증가 한 호흡을 보여 줍니다. (F) 모든 세 개의 매개 변수가 비교를 위해 함께 제공 됩니다. n = 6 독립 실행. 데이터는 평균 ± SEM.로 수 여 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.0001. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57053/57053fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  Brigham Young University. 이 프로토콜의 목표 고해상도 respirometry를 사용 하 여 그대로 832/13 베타 세포에 천연 화합물의 미토 콘 드리 아 호흡을 중재 하는 포도 당 변경의 효과 측정 하는 것입니다.

비디오: High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

연구

발생학

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate the measurement of islet oxygen consumption using a 96-well microplate designed for the measurement of oxygen consumption in spheroids. In this assay, spheroid microplates are coated with a cell and tissue adhesive on the day prior to the assay. We utilize a small volume of adhesive solution to encourage islet adherence to only the bottom of the well. On the day of the assay, 15 islets are loaded directly into the base of each well using a technique that ensures optimal positioning of islets and accurate measurement of oxygen consumption. Various aspects of mitochondrial respiration are probed pharmacologically in non-human primate islets, including ATP-dependent respiration, maximal respiration, and proton leak. This method allows for consistent, reproducible results using only a small number of islets per well. It can theoretically be applied to any cultured spheroids of similar size.

This protocol demonstrates the accurate and reproducible measurement of oxygen consumption in non-human primate pancreatic islets. The islet loading techniques and coating of the microplate provide a framework for efficient measurement of respiration in other types of cultured spheroids.

비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

생화학

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

의학

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

생물학

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 정자 세포의 호흡 측정

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

저자 스포트라이트: 정자 대사와 미토콘드리아 기능을 밝히는 남성 불임 연구 발전 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

요약

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높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

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인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법