Name: histological quantification of chronic myocardial infarct in rats
Uploaded: 2016-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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The study was supported by the Swiss National Foundation [SNF 310030-149986 to MNG], the University of Fribourg, and Fribourg Hospital.

모든 동물은 동물 관리에 관한 유럽 협약을 준수 인도적인 치료를 받았다. 수술 절차는 스위스 연방 수의학 사무실, 스위스의 승인을 국가 수의학 사무실, 프리 부르의 허가를 얻은 후 스위스 동물 보호법에 따라 수행 하였다. 1. 심장 수확 참고 : 모든 수술 개입은 이소 플루 란 마취하에 시행 하였다. 노력은 동물의 고통을 감소하기 위해 만들어졌다. 특히, 모든 동물은 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 예비 마취의 피하 주사를 받았다. 심근 경색을 영입하기위한 수술 프로토콜은 이전에 다른 곳에서 13 설명 하였다. <ol><li> 마취 (삽관 동물, 2.5 %의 이소 플루 란, 발 핀치 반사에 의해 확인 적절한 마취) 아래 myocardially 경색 동물에 흉골 절개를 수행합니다. <ol><li> 다음 근육을 피부를 절단하여 동물을 엽니 다수술 가위로. 왼쪽과 오른쪽에있는 갈비뼈를 절단 한 다음 가슴을 제거합니다. </li><li> 이전 수술 (LAD 결찰) 후 남은 유착을 제거합니다. 대동맥을 잘라 마음을 제거합니다. (PBS)에 1 M의 KCl의 조직을 넣어, 다음 PBS로 씻는다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 아크릴 쥐의 심장 매트릭스에 길이 방향으로 경색 마음을 넣습니다. 1 시간 동안 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 횡으로 면도날을 사용하여 매트릭스 직접 중심을 잘라. 각 조각을 확인하는 2mm 두께입니다. (리모델링 수준에 따라) 각각의 심장 7 슬라이드 - 약 5 컷 이 체계적인 샘플링이라고합니다. </li><li> 이 단계에서, 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색을 수행하는 단계 (심장 슬라이스베이스 - 정점의 방향을 유지하는) 선택 사항이다. <ol><li> 37 ° C에서 50 분 동안 PBS에 1 % TTC에 품어. 1 시간 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 부화. betwee 섹션을 넣어n은 2-mm 스페이서와 두 개의 유리판과는 15 배 배율로 카메라와 결합 stereological 현미경으로 사진을 찍을. 주의! 파라 포름 알데히드는 독성이있다. </li></ol></li><li> 슬라이드 동결 (1 차 옵션) <ol><li> (몰드의 바닥 아래 부분의 정점 중심쪽에 배치)의 방향을 유지 cryotomy 용 배지 (최적 절단 온도 OCT를) 실장과 플라스틱 몰드 (10 × 10 × 5mm)의 각 슬라이드를 넣는다. 15 분 - 10 냉각액 질소 하에서 2- 메틸 부탄 증기와 블록 동결. 마지막으로, -80 ° C에서 조직을 저장합니다. </li></ol></li><li> Paraffinization (2 차 옵션) <ol><li> 24 시간 동안 4 % PFA에서 각 카세트 삽입에 슬라이드 (아래 카세트의 하단에있는 부분의 정점 지향적 인 측면을 배치하여 방향을 유지)과 놓습니다. 조직 프로세서 기계 하룻밤에 넣어. <ol><li> 2 시간 동안 에탄올 70 %에 품어. 이단에 품어2 시간 동안 95 %를 올 실시. 3 시간 동안 100 % 에탄올에 부화. 4 시간 동안 크 실롤에 품어. 5 시간 동안 (오븐에서 60 ℃에서 용융) 파라핀을 부화. 마지막으로, 파라핀의 각 심장 슬라이드를 삽입하여 블록을 확인합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 메이슨 - Goldner 트리 크롬 염색 <ol><li> (5 μm의 두께) 또는 -18 ℃로 설정 저온 유지 장치와 간섭 단층 블록에서 (두께 : 7 μm의) 수동 마이크로톰으로 파라핀 블록에서 조직 섹션을 확인합니다. </li><li> 메이슨 - Goldner와 - (슬라이드 당 4 횡단 섹션 3) 트리 크롬 염색 (부록 참조) 각 쥐에 대한 각각의 심장 부분에서 하나의 슬라이드를 얼룩. 참고 : 파라핀 섹션에 대해이 단계에서 시작합니다. <ol><li> 오븐에서 60 ° C에서 슬라이드 녹아. 흄 후드에서 10 분 각각에 대해 두 번 크 실롤에서 그들을 deparaffinize. 3 분마다 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 증류수을 재수. 참고 : 동결 절단 (Cryosections)에 대해이 단계에서 시작에스. </li><li> Bouin 용액에 하룻밤을 수정합니다. 15 분 - 그 후, 10 수돗물을 실행에 그들을 씻어. 증류수를 씻어. 3 분 마이어의 헤 마톡 실린에서 그들을 품어. </li><li> 슬라이드를 제거하고 5 분 동안 증류수를 둡니다. 그런 다음, 5 분 동안 산 푹신-개양귀비 빛에서 그들을 품어. 1 분 동안 1 % 아세트산을 씻어. </li><li> 다음, 1 분 동안 몰리브덴 산 오렌지 G에서 그들을 품어. 1 분 동안 1 % 아세트산을 씻어 10 분 동안 밝은 녹색 염료에서 그들을 품어, 1 분 동안 1 % 아세트산을 헹군다. </li><li> 70 % 에탄올 (30 초), 95 % 에탄올 (30 초), 100 % 에탄올 (5 분)에서 그 탈수. , 조직 섹션에 수지 장착 매체의 한 방울을 넣고 된 커버로를 커버하고 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 경색 크기 분석 <ol><li> 카메라와 결합 된 실체 현미경 (15 배 확대)에 각 슬라이드에서 하나의 이미지를 획득. 같은 설정으로 통치자를 촬영에스. </li><li> 경색, 격벽 두께, 좌심실 (LV) 공동 영역 경색 영역 및 사용 LV 조직 영역의 중간에 흉터 두께를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용한다. <ol><li> 눈금자 사진 (그림 1A)와 규모를 설정합니다. <ol><li> 다음 설정 변환 계수를 선택 측정을 클릭합니다. 교정 줄에 선을 그립니다. 오른쪽 사진을 클릭하고 최종 교정을 클릭합니다. 바 값을 참고 한 다음 확인을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 스테인드 심장 사진 (그림 1B)에서 LV를 선택합니다. 다중 세그먼트 도구를 사용합니다. 좌심실 지점별로 포인트를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 복사 / 어디든지 붙여 넣습니다. </li><li> 단일 세그먼트 측정 도구를 사용하여 흉터 및 격벽 두께를 측정 (도 1C </st룽&gt;). </li><li> 자동 LV 캐비티 경색을 검출하고, LV 영역은 RGB 모드 (도 1D)의 자동 면적 측정 도구를 사용. <ol><li> 도구를 클릭합니다. 활성화 만 테두리 및 RGB 모드에서 연속. 마지막으로 검출하는 관심 영역 내부를 클릭. 필요한 경우, 정밀 도구를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 좌심실 면적에 대한 경색 면적의 비율로서 경색 크기를 계산한다. </li><li> 다음 팽창 지수를 계산 : LV 캐비티 면적 / 전체 LV 영역] / [경색 두께 / 격벽 두께 같이, LV 캐비티와 LV 조직 영역을 모두 포함하는 전체 LV 면적. </li><li> 마지막으로 다음과 같이 각각의 마음에 대한 &quot;평균&quot;계산 : [경색 슬라이드에서 확장 인덱스의 평균] * [경색 슬라이드 번호 슬라이드 / 총]. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

프로토콜 내에서 중요한 단계 섬유 성 조직이 정확하게 수확 마음과 이미지의 계통 추출법을 사용하여 만성 MI 쥐 모델에서 평가 될 수는 정점에베이스에서 얻은 삼색 염색 조직 학적 섹션으로 분석합니다. 두 단계는 성공적인 프로토콜 구현에 특히 중요하다. 먼저, 심장 수확의 KCl 사용은 심장 근육이 이완 된 상태로 유지 될 수있다. 이 단계는 서로 다른 마음에서 경색 크기의 비교를 위해 중요하다. 둘째, Bouin 용액 섹션의 하룻밤 고정 밝은 트리 크롬 염색을 수득하는 것이 중요하다. 수정 및 문제 해결 염색의 부재는 감소 배양 시간 등 Bouin 용액의 섹션의 고정 동안 어려움 때문일 수 또는 Bouin 솔루션을 만료 할 수 있습니다. TTC의 얼룩은 선택과 coul입니다급속하지만 비 정량적 방식으로 경색 크기를 시각화하는데 사용될 거라고. 이 TTC 전에 10월 파라핀 하나로 포함 동일한 심장에 대해 수행 될 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 기술의 한계 본 방법은 하나 파라핀 및 냉동 보존 심장 부분 중에서 선택 및 면역 염색을 위해 사용될 수있게한다. 그럼에도 불구하고, 전체 심장 절개해야하고, 조직은 단백질 및 유전자 발현 분석을위한 웨스턴 블롯 또는 RT-PCR로, 추가 분석을 위해 사용될 수 없다. 기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성 정량화 과정과 특히 때문에 분석 섹션의 수는 신뢰성 정량 최우선 얻을 필요 부분의 최소 수를 정의 조사간에 다양. Takagawa 전자t 등. 1-mm의 간격을 이용하여 쥐의 심장 전체 섹션 8 - 9 6 신뢰성 최소한 심장 슬라이스 번호 최대화 시연. 본 프로토콜에서 5-2-mm 두께의 절편을 수행 할 때 전체 쥐의 심장의 7 절 얻었다. 또한, 2 mm 섹션은 TTC 염색에 대한 표준 및 자주 사용하는 크기입니다. 또한, 조직 샘플이 적용이 간편하고, 전체 중심의 특성화를 허용 주기적 양태를 나타낸다. 2 mm 조각의 각각에서, 5 μm의 섹션 잘라 염색 하였다. 각각 5 ㎛의 섹션, 격벽 두께, 반흔의 두께와 길이, 총 상처 면적 총 LV 영역 및 LV 공동 영역의 정량화를 수행하고, 각각의 파라미터의 평균 마리당 산출 하였다. 우리는 자동 색상 검출 및 평가 모두의 정확성을 높이기 위해 오히려 2 mm 섹션 TTC 염색보다 얇은 부분의 메이슨 - Goldner 염색법을 사용의 길이. 사실, TTC 염색 오히려 만성 단계에 비해 위험 8, 14의 영역의 검출을위한 초기 단계 또는 허혈성 재관류 모델의 대부분은 재미있다. MI는 합자 사이트에 따라 달라질 수 있습니다 LAD 결찰에서 유도. 제시된 만성적 경색증 모델에서 결찰 크기는 의도적으로 각 동물에 대해 변형 및 경색 크기 및 리모델링의 다양한 조건에 대한 결과는 6 주 이후 존재 하였다. 따라서, 계산 된 EI는 심근 경색의 광범위한 계시 EF와 관련 심장 기능에서 관찰 된 차이를 지원. 경색 세그먼트 광범위 씨닝이 발생한 경우, 경색 영역을 크게 전층 섬유증의 경우에 감소되었다. 이 상태에서, (좌심실의 백분율로 표시) 전체 LV 관련 경색 조직의 면적을 계산함으로써 경색 크기를 정의하면 약 경색의 정도를 평가하는 것이다. C의 부족감육의 부재하에 본 경색은 경색 크기를 과도하게 추정 할 중에 나타낸 바와 같이 개조 유도 LV 팽창 경색 LV 벽의 극단적 인 박막화위한 onsideration는 95 % 신뢰 외부 값으로, 경색 크기를 과소 수도 간격. 이러한 단점은 EI의 계산을 통해 제거 될 수있다. LV 형상 변화가 긍정적 EI 및 감육 (15, 16)와 관련되는 것으로 나타났다. EI는 LV 함수의 예측 될 수 있지만, 그 심 초음파를 강조하는 것이 중요하고, 조직 학적 분석은 각각의 기능 및 조직 수준에서 심근 경색을 평가하는 방법을 보완한다. 심 초음파는 종 방향 연구를 허용하고, 조직 학적는 벽 두께 LV 형태의 추가 정량을 허용 기본적인 엔드 포인트 분석을 제공 분석한다. 후미 미래 응용 프로그램 또는 방향어이 기술을 마스터 만성 MI를 평가할 때 전체 심장의 전신 샘플링 및 EI의 계산은 특별한 관심입니다. 또한,이 방법은 치료 효과의 평가에 적합 할 것 같은 세포 - 등의 신규 치료법을위한 특히 경색 크기 및 재 형성을 감소 목표 치료 매트릭스 기반. 종점 조직학은 경색 크기의 전후 처리를 비교 분석으로 배제 경색 팽창 신뢰성 정량화 비 처리하고 처리 된 동물 간의 비교를 위해 무엇보다 중요하다.

심근 경색 (MI)는 전 세계적으로 사망과 장애의 주요 원인이다. 관상 동맥 심장 질환의 주요 원인이며; MI는 폐색과 같은 관상 동맥 사건에 연속 허혈의 결과. 재관류는 제 6 시간 내에 수행되지 않는 경우, 허혈 비가역 심근 괴사를 유도한다. 환자에서 MI의 특성은 임상 증상, 심전도, 바이오 마커, 심 초음파, MRI 영상의 혈장 수준의 평가 등 다양한 진단 도구에 의존하고, 조직 학적 1을 분석합니다. 급성 및 만성 MI는 관상 동맥 폐색시에 심근 괴사의 타이밍에 따른 손상의 두 가지 단계로 분류된다. 처음 7 일 동안 발생하는 급성 단계는, 상기 심근의 손실, 광범위한 염증 및 섬유 아세포의 채용과 연결됩니다. 심장 조직과 흉터의 형성 치유 특징 서브 급성기가 발생1 ~ 4-6주. 경색, 심실 벽이 얇아 및 뇌실 팽창의 확장은 만성 단계의 특징. 좌심실의 광범위한 개조 점진적 중증 심부전이 초래한다. 영구 왼쪽 앞쪽에 하강 동맥 (LAD) 결찰에 의해 유도 된 MI는 만성 심근 경색의 표준 설치류 모델을 나타냅니다. 관상 합자 모방 관상 동맥 폐색. 경색의 크기는 합자의 위치에 따라 달라집니다. 설치류 모델에서 심근 허혈의 특성은 이러한 고전 트로포 같은 바이오 마커의 플라즈마 수준을 사용하여 수행된다 I와 T (3), 심 초음파 검사, MRI 및 조직학 4,5-. 바이오 마커 레벨은 심근 죽음의 정도와 상관 관계가있다. 심장 초음파 검사는 국소 벽 운동 이상으로 인한 좌심실 기능 장애를 평가합니다. 이러한 또는 MRI와 같은 고해상도 또한, 비 침습성 영상화 기술에서심장 초음파 검사는 벽 운동의 감소 평가를 허용 감소 관류 가능한 심근 및 감육과 흉터 영역의 볼륨. LV 치수 경색 크기의 정확한 평가를 허용한다. 마지막으로, 가능한 죽은 심근의 정량화 수확 마음의 조직 학적 섹션의 특정 얼룩을 사용하여 사후을 수행 경색 크기 (IS)의 검증을 허용 할 수 있습니다. 또 다른 중요한 특징은 경색 팽창 지수 (EI) (6)의 평가이다. EI는 처음 3 일 이내에 전층 경색과 시작과 연관됩니다. EI는 벽 두께의 점진적인 감소는 LV 캐비티 대형화 및 LV 형상 그에 변경을 특징으로한다. 신규 한 치료의 치료 효과를 평가하기 위해 - 특히, 회생 전략 세포 행렬에 기초하고, 설치류 MI의 유전자 전달 정확한 평가는 가장 중요하다.유두근 레벨에서 획득 한 단면에서 측정 할 때, IS 크기 LAD 결찰 다음 경색 개발에 존재하는 큰 변화로 인해 편향 될 수도있다; 정점 경색은 occulted 될 수 있습니다. 중요한 결정 MI 크기보다 정확한 방법은 마우스 또는 래트 7-9 10에 대해 기재되어있다. 그럼에도 불구하고, IS 정확하게 LV 개조 또는 리모델링의 치료 유도 감소 (또는 preventions)를 정량화하기에 충분하다. 실제로, 일반적으로 심장의 단면으로 평가 LV 총 체적의 백분율로 표시된다. 이 방법은 급성 MI에 대한 유효하지만, 리모델링시 발생하는 좌심실 벽의 숱은 11, 12 평가에서-남아있다. 경색 크기 및 구조 변경의 완전한 형태 학적 정량은 내막과 외막 길이와 직경뿐만 아니라, 경색 건강 분야 등 여러 가지 파라미터를 정량화한다. 우리는 방법 론적 appr를 설명oach 정확하게 만성 쥐 모델에서 MI 및 리모델링을 평가합니다.

<table><tbody><tr><td>Acrylic rat heart matrix 2 mm</td><td>72-5015</td><td>Harvard Appartus</td><td></td></tr><tr><td>Inspira advanced volume controlled ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>557058</td><td></td></tr><tr><td>Catheter Insyte 14 G</td><td>BD</td><td>381267</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>BDHA361603E</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>T8877-10G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>MHS32-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuchsin&lt;br/&gt; CI 42685</td><td>F8129-50G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Xylidin&lt;br/&gt; CI 16150</td><td>P2395-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Orange G&lt;br/&gt; CI 16230</td><td>O3756-100G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Light green&lt;br/&gt; CI 42095</td><td>L5382-25G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>P9333-500G</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>10315083</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>10303990</td><td>HoneyWell</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>M32631-1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Stereogical microscope</td><td>SM2800</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>99340</td><td>Reactolab</td><td></td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>K113.1</td><td>Carl Roth</td><td></td></tr><tr><td>Bersoft Image measurement Software</td><td></td><td>Bersoft.com</td><td>Licensed software</td></tr></tbody></table>

histological quantification of chronic myocardial infarct in rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

6 주 후 LAD 내고는, 마음은 루이스 쥐에서 수확했다. 2 mm 조직 섹션은 정점에서베이스를 얻었다. TTC 염색 절차는 흰색에 나타나는 경색 영역, 그리고 빨간색으로 표시되는 건강한 심근, (그림 2) 시각화 하였다. LAD의 결찰의 위치에 따라 경색 크기가 달라집니다. 큰 MI를 들어, 전층 경색베이스 (그림 2A)로 정점에서 관찰되었다. 작은 경색은 심장 (그림 2B)의 중간 부분에 정점에서 볼 수 흰색 경색 조직을 발표했다. 작은 비 전층 경색의 경우, 섬유 성 조직 정점 (도 2C)로부터 하나 또는 두 섹션에서 관찰되었다. 각각의 심장 조각에서 얇은 5 μm의 섹션 잘라 메이슨 - Goldner의 트리 크롬으로 염색 하였다. 심장의 전체 단면의 사진이었다실체 현미경 하에서 취득 (그림 3). 건강한 조직은 녹색에서 빨간색과 결합 조직에 출연했다. 각 색 간의 판별을 용이하게하는 이미지 분석 소프트웨어로 수행 될 수있다. 경색과 격벽의 LV 캐비티 영역 및 LV 전체 영역의 두께를 측정하고, EI (표 1)을 계산하기 위해 계산되었다. EI는 각 섹션에 대해 계산 하였다. 심장의 크기에 따라, 섹션들의 개수, 각 심장은 제 5 내지 변경은 EI 각 섹션에서 EI의 평균이다. EI는 0에서 0.278로 변화하고 58 %의 CV와 함께, 심근 경색의 넓은 범위를 한 것으로 밝혀졌습니다. 비교에서, LV에 경색 비율의 평균은 54 % (표 1)의 CV 0에서 0.241로 변화. EI 경색의 비율이 크게 비교 하였다; 비 - 파라 메트릭 스피어 분석은 상관 계수 R-VA를 구비0.491의 루 (P = 0.005) (그림 4A). 예컨대 0.11 0.13 EI 가까운 값의 경우, 경색의 비율은 5.8에서 24.1 %로 다양. 심장 기능이 마취 된 동물 육주 후 LAD의 결찰에 고해상도 심 초음파에 의해 평가하고, 이전에 심장 수확에 한 번 실시 하였다. 조직 학적 정량에서 계산 된 EI는 EF와 크게 상관 관계. 비 파라 메트릭 스피어 분석은 -0.709 (p = 0.005) (그림 4B)의 r 값을 제공했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54914/54914fig1.jpg" /> 이미지 분석 소프트웨어의 사용 그림 1. 단계별 그림. 자동 색상 한계 및 길이 측정은 여러 단계를 포함했다. A. 교정 : 이미지의 크기가 설립되었다. 의 그림통치자는 심장 섹션과 동일한 조건에서 촬영했다. 눈금자의 길이 스케일 변환율을 정의하는 표시 하였다. 밀리미터 픽셀에서 변환을 수행 하였다. B. LV 선택 방법 : 우심실은 소프트웨어 선택 도구를 사용하여 화상의 잘라내었다. C. LV 벽 및 격벽 두께 측정 : 단일 측정 도구 거리를 정량화 하였다. 스케일 바는 3mm를 나타냅니다. D. 자동 영역 정량화 : 자동 컬러 한계가 RGB 모드에서 수행 하였다. 자동 선택은 자동 선택 모드를 선택한 후 수행 하였다. 색상 기반 선택을 수정할 수 있습니다; 연구자는 선택된 녹색 조직의 시각 제어를 수행 증가 또는 필요에 따라 선택 영역을 감소. 스케일 바는 3mm를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54914/54914fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </p&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54914/54914fig2.jpg" /> 그림 2. 심장 섹션은 TTC와 스테인드. 전체 심장의 2 mm 섹션은 TTC 염색 하였다. 건강한 심근 흰색에 빨간색과 섬유 성 조직에서 나타났다. 다른 경색 크기의 세 가지 마음이되게됩니다. A : 큰 전층 경색, B : 중간 경색, 및 C : 작은 경색. 스케일 바는 3mm를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54914/54914fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54914/54914fig3.jpg" /> 메이슨 - Goldner 트리 크롬으로 염색 그림 3. 심장 섹션. 5 μm의 섹션은 육주 후 LAD 내고 얻어진 각각의 심장 부분에서 절단 하였다. 역이네 섹션 실체 현미경하에 넣었다. 전체 섹션 사진 15X 배율로 얻었다. 젖꼭지 근육 (다시 화살표)의 수준에서 얻어진 대표 사진, 녹색, 빨간색과 섬유 성 조직에서 건강한 심근를 보여줍니다. 사진은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 자동 색상 한계뿐만 아니라, 경색 및 격벽 두께를 측정하고있는 사이트 (검은 선)를 나타낸다. 스케일 바는 3mm를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54914/54914fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54914/54914fig4.jpg" /> 확장 지수 (EI)과 경색 관련의 비율 사이에 그림 4. 상관 관계 (A) 또는 구출 률 (EF) (B)를 LV합니다. 선형 회귀 (검은 선) 및 95 % 털어NCE 간격 (점선)가 표시됩니다. 비 파라 메트릭 스피어 r 값이보고됩니다. A : (; P = 0.003 R = 0.567) 경색 및 EI의 비율은 크게 상관 관계. 경색 팽창 지수 (EI)는 [LV 캐비티 면적 / 전체 LV 영역] / [경색 두께 / 격벽 두께]으로 계산 하였다. 전체 LV 영역은 LV 결합 공동 및 LV 조직 영역으로 측정 하였다. 경색의 비율은 LV 조직 영역 / 경색 조직 영역으로서 산출 하였다. B : 함수가 현저 EI와 상관 고해상도 초음파 검사를 사용 6주 후 LAD 결찰로 평가 하였다. 두 매개 변수는 크게 상관 관계가 있었다 (R = -0.709, P = 0.005). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54914/54914fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54914/54914table1.jpg" /> 탁자1 : 메이슨 Goldner 묻은 심장 섹션에 측정 매개 변수.

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Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

쥐의 만성 심근 경색의 조직 학적 정량

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

14.5K 조회수.  University of Fribourg. The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections. 

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

생체공학

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

급성 심근 경색의 돼지 모델의 주요 결과 평가

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

온전한 심낭 허혈성 설치류 모델

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Generation and Characterization of Right Ventricular Myocardial Infarction Induced by Permanent Ligation of the Right Coronary Artery in Mice

Right ventricular infarction (RVI) is a common presentation in clinical practice. Severe RVI can lead to fatal hemodynamic dysfunction and arrhythmia. In contrast to the extensively used mouse myocardial infarction (MI) model generated by left coronary artery ligation, the RVI mouse model is rarely employed due to the difficulty associated with model generation. Research on the mechanisms and treatment of RVI-induced RV remodeling and dysfunction requires animal models to mimic the pathophysiology of RVI in patients. This study introduces a feasible procedure for RVI model generation in C57BL/6J mice. Further, this model was characterized based on the following: infarct size evaluation at 24 h after MI, assessment of cardiac remodeling and function with echocardiography, RV hemodynamics assessment, and histology of the infarct zone at 4 weeks after RVI. In addition, a coronary vasculature cast was performed to observe the coronary arterial arrangement in RV. This mouse model of RVI would facilitate the research on mechanisms of right heart failure and seek new therapeutic targets of RV remodeling.

There are several differences between the right and left ventricles. However, the pathophysiology of right ventricular infarction (RVI) has not been clarified. In the present protocol, a reproducible method for RVI mouse model generation is introduced, which may provide a means to explain the mechanism of RVI.

마우스에서 우측 관상동맥의 영구적 결찰에 의해 유도되는 우심실 심근경색의 생성 및 특성화

Right ventricular infarction (RVI) is a common presentation in clinical practice. Severe RVI can lead to fatal hemodynamic dysfunction and arrhythmia. In ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...