Name: visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
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TB는 낭포 성 섬유증 캐나다에서 연구 교제를 인정합니다.

연구 윤리위원회 (REB)를 수집하고 인체에서 객담 샘플을 저장하는 데 필요합니다. 이 연구는 아픈 어린이 REB 번호 1000019444를 위해 병원에 의해 승인되었다. 1. 준비 CF 객담 샘플 <ol><li> 낭포 성 섬유증 클리닉에 일상적인 방문시 환자의 객담 샘플을 수집하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 처리를 받아야하는, 연구 실험실, 컬렉션의 첫 번째 시간 이내에 얼음에 객담 샘플을 전송. </li></ol> 2. 객담 처리 <ol><li> 얻어진 객담 시료의 양을 기록한다. 샘플 (즉, PBS 2 부 1 부 샘플)의 양을 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가한다. </li><li> 전송 피펫과 잘 샘플을 섞는다. 소용돌이 1 분 완전히 혼합하는 가장 높은 설정에 샘플. </li><li> 나누어지는 적절한 수의 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 상기 혼합물 1 ㎖ 및 5,000 XG에 스핀 다운4 ℃에서 20 분. </li><li> 원심 분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 버린다. </li><li> 필터 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는을 소독하고 깨끗한 microcentrifuge 관에 수집합니다. 참고 : 여과 액의 무균는 LB 한천에 도금 및 액체 매체를 접종하여 시험한다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 가래 뜨는을 저장합니다. 참고 : 객담 여러 환자도 여과 다음 풀링 할 수 있습니다에서. </li><li> 객담 여과 액을 1/10 v / V를 원하는 미디어 (가래 100 ㎕, 미디어 900 μl를) 희석, 사용하기 전에. 참고 : 여기에, 표준 원성 국물 (LB) 미디어가 사용되었다. </li></ol> 바이오 필름 형성 3. 챔버의 coverglass 방법 <ol><li> (200 rpm)으로 진탕 37 ° C에서 원하는 미디어에 대한 관심이 하룻밤의 세균 분리를 성장. 주의 : 다른 박테리아의 수를 사용하여, 녹농균, 황색 포도상 구균이 임상 분리 포함부르크 홀데 리아의 cepacia의 복잡하고 아크 로모 박터의 아크 로모. 미디어의 선택은 그러나 LB 미디어가 초기 실험에 사용할 수있는 균주와 관심의 조건에 따라 달라집니다. </li><li> 밤새 배양 물로부터 신선한 미디어 4 ㎖ 중에 배양의 40 μl를 넣고 약 0.5 내지 600 nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도를 갖는 배양을 얻었다 (200 RPM)를 흔들면서 37 ℃에서 3-4 시간 동안 성장 -0.6. </li><li> 10 % 객담 여과 또는 (제어 등) 객담 여과없이 원하는 미디어에서 1/5 단계 3.2에서 문화를 희석. 객담 여과 액의 다른 농도를 테스트 할 수 있습니다 (즉, 50 % 또는 100 %). </li><li> 슬라이드 챔버의 우물을 배정하는 것을 희석 200 μl를 사용합니다. </li><li> 박테리아가 흔들림없이 37 ° C에서 4 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 4 시간 후, 미디어를 제거하고 부드럽게 1 배 신선한 매체와 바이오 필름을 씻는다. 200 ㎕의 새로운 미디어로 교체하십시오. 참고 : 생물막의 가래를 Fres의 효과를 연구시간 미디어는 객담 뜨는을 포함해야합니다. </li><li> 바이오 필름은 현미경을위한 시간이 될 때까지 세척하지 않고, 미디어마다 12 시간을 대체 흔들림없이 37 ° C에서의 시간 원하는 시간 동안 성장하도록 허용합니다. 참고 : 생물막 항생제 감수성에 가래 상층 액의 효과를 연구하려면, 항생제는 생물막 성장의 24 시간을 다음과 같은 미디어에 추가되고 염색 및 바이오 필름의 영상까지 언론에 유지됩니다. </li></ol> 4. 염색 바이오 필름 및 공 초점 현미경 <ol><li> 원하는 성장 시간 (24 ~ 48 시간이 잘 작동)에 따라, 챔버 우물에서 미디어를 제거하고 부드럽게 멸균 PBS 300 μL로 두 번 각 챔버를 씻는다. </li><li> 필요한 솔루션의 각 ml의 대한 (생존 키트에 제공) 각 염료의 1 μl를 혼합하여 바이오 필름에 대한 염색 혼합물을 준비합니다. 물이나 미디어 솔루션에 염료를 확인합니다. 참고 : 물은 제조업체가 권장된다. </li><li> 챔버 covergla의 각 웰에 염료 혼합물 200 μl를 추가SS 45 분간 어둠 속에서 실온에서 부화. </li><li> 실에서 염색 혼합물을 제거하고 멸균 PBS 300 μL 잘 각을 씻는다. PBS를 제거하고 신선한 물 또는 용지로 교체합니다. </li><li> 공 초점 현미경을 통해 바이오 필름의 시각화를 진행합니다. </li></ol> 5. 공 초점 현미경으로 바이오 필름을 시각화 <ol><li> 즉시 (1 시간 이내) 염색 후 챔버 스테인드 생물막을 읽어보십시오. 한 번에 2 ~ 8 잘 챔버에 1을 염색하여 슬라이드의 시각화 지연을 최소화합니다. </li><li> 인수 여기 및 필터 세트의 레이저와 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 수행합니다. 참고 : 여기에, 스펙트럼 얼리스 레이저와 함께 회전하는 디스크 공 촛점 시스템 (녹색 : 491nm, 적색 : 561 nm의) 여기에 사용 하였다. 40분의 515 및 40분의 624의 배출 필터 세트는 생물막 생존 키트에서 얼룩을 시각화하는 데 사용되었다. </li><li> 카메라와 공 초점 현미경에 25X 물 목표를 사용하여 이미지를 가져 가라. </li><l난&gt; 사용 Z-스택은 바이오 필름을 모델링합니다. 모든 0.5 μm의는 생물막의 마지막에 초점 프레임에 첫 번째에 초점 비행기에서 시작하는 이미지를 가지고 (일반적으로 30 ~ 80 μm의 48 시간의 바이오 필름에 걸친) </li><li> 각 우물에서 3-5 이미지를 가져 가라. 참고 : 따라서 8 잘 챔버의 coverglass를 들어, 24-40 이미지가 생성됩니다. </li><li> 분석을 위해 이미지를 저장합니다. 참고 : OME-TIFF 파일이 COMSTAT (18, 19)를 사용하여 분석로서 이미지를 저장해야합니다. 생물막 이미지 분석에 대한 지침은 http://www.comstat.dk/에서 찾을 수 있습니다. 이미지가 수입되면, 이러한 각각의 채널 (빨강 및 녹색)의 평균 두께, 바이오 매스 및 표면 범위 등의 매개 변수를 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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본원에 기재된 방법은 외인성 제품의 존재 하에서 성장 세균 생물막의 시각화를 허용. 이러한 유형의 시스템을 사용하지 않을 때는 놀랍게도, exoproducts의 생산은 중요하다. 예를 들어, 디티 오 트레이 톨 (DTT)는 종종 샘플을 액화하기 위해 인간의 객담 샘플에 사용됩니다. 그러나, 단독 DTT의 효과 생물막 개발 가능성을 감소시킬 수있다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 모든 조건에 대한 적절한 통제가 필요합니다. 또한, 인간의 타액 제품의 첨가로 인해 각 환자의 가래 고유 마이크로 바이을 가지고 있다는 사실에 실험에 고유의 변동을 생성한다. 이것을 조정하기 위해, 우리는 환자의 특정 결과를 방지하기 위해 풀링 객담 샘플을 사용했다. 어떤 모델 시스템을 사용하는 경우 또한 해당 미디어의 선택은 중요하다. 의도 된 유기체의 생물막 성장을위한 표준 미디어는 시스템의 초기 설정을 권장합니다. 이 실험의 목표는 식별자된다면외래 제품은 biofilm 형성에 영향을 미치는 방법을 쓸어 적절한 생물막 형성을 제공하는 영양 리치 미디어 좋습니다. 외생 적 요인이 바이오 필름에 영향을 줄 수있는 방법을 결정하면서 성장을위한 충분한 영양을 수 있습니다. 이러한 최소한의 또는 정의 된 미디어와 같은 다른 매체는, 더 나은 모방 특정 조건에 사용할 수 있습니다. 다른 매체가이 시스템에서 좋은 결과 사용되었다 (데이터는 미도시). 미디어를 추가하거나 생물막을 방해 방지하기 위해 바이오 필름의 세척 단계 중 / 제거 할 때 챔버의 coverglass에 바이오 필름의 부착은, 그러나 많은주의를 기울여야합니다 강력한이다. 제조 업체의 프로토콜에 따라, 라이브 죽은 얼룩의 사용은 설명 된 시스템에 대한 좋은 결과를 산출했다. 다수의 인자, 그러나,이 방법은 이미지에서 관찰되는 것에 관련한다 (색소 흡수 세균 생물막 검출기 이득 설정의 상대 밀도를 포함 함) 화상의 형광 비율에 영향을 미칠 수있다에스. 다른 방법은 (COMSTAT에서 유래) 생물막 총 미생물 존재의 비율로 죽은 세포의 바이오 매스 죽은 / 라이브 생물막의 상대적인 양을 나타내는 데 사용될 수있다. 반복 실험에서 바이오 필름의 가능성을 확인하는 세균 수를 사용하는 것이이 모델의 시각적 관찰을 확인하는 것이 좋습니다. 때문에 바이오 필름의 고유의 이질성에, 각 챔버와 다수의 챔버에서 여러 이미지는 실험에서 각 조건에 사용되어야한다. 이 실험의 비용 및 시간을 추가한다. 이미지의 인수는 이전에 실험 데이터의 분석에 중요하다. 현미경 설정을 결정할 때주의를 통해 이미지를 포화하지 찍은해야합니다. 우리는 25X 대물 나은 이미지를주는 것을 발견하지만 필요한 세부 사항의 수준 가능한 현미경에 따라 다른 목표 (10X, 25X, 40X 및 63X)의 숫자는 영상을 획득 할 수있다. t의 두께그는 Z-스택은 전체 이미지 품질 및 세부 사항의 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 매 0.5-1 μm의 촬영 이미지를 갖는 표준 컴퓨터 시스템 COMSTAT 의해 분석 될 수있는 크기로 Z 스택 이미지를 유지하면서, 25X 대물에서 명확한 이미지를 제공하는 것으로 보인다. 이러한 실험은 더 많은 비용과 시간이 다른 부착 분석법보다 소비하고, 높은 처리량 방식으로 수행 될 수 없다. 이 과정에서, 박테리아는 생체 내 조건이 반사되지 않고, 바이오 필름 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있는 보로 실리케이트 표면에 부착. 그러나, 그들은 추가 정보를 제공하고 항생제 내성 및 외인성 신호에 대한 생리적 반응을 바이오 필름 관련기구에 대한 가설을 생성 할 수 있습니다. 이 실험의 목표는 생물막이 아니라, 예를 들면 높은 처리량 방법을 사용하여 안티 생물막 화합물을 식별하기보다, 다양한 요인에 응답하여 변경하는 방법을 이해하는 경우, 추가 정보가 t를 사용하여 얻은그 기술에있어서 가치가한다. 따라서, 현재의 방법은 가장 흔히 생물막을 연구하는 데 사용되는 크리스탈 바이올렛 분석으로 이전 한정 부착 분석법 비해 상당한 진보이다. 이 절차에 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 저하를 방지하기 객담 샘플의 적시에 처리를 보장; 2) 바이오 필름의 혼란을 방지하기 위해 바이오 필름에 미디어의 변화와 부드러운 인 3)에 의한 바이오 필름 형성의 이질성에 생물막 두께의 정확한 표현을 보장하기 위해 바이오 필름 이미징의 반복 측정을하는. 시스템이 특정 박테리아 종해서 설정되면, 하나는 여러 임상 분리에 외인성 요인의 영향을 포함하여 다른 조건의 수를 테스트 할 수있다. 이 시스템은 사람의 타액 (16)에 노출 된 생물막에 항생제의 효과를 연구하기 위해 높은 저항성 및 내성 임상 분리 중간에 비교하기 위해 사용 된. 이러한 점액이나 콜라겐 마이크로 지지체 (예 puracol)와 바닥 코팅과 같은 챔버의 coverglass 17 변형 예는, 가능한 다른 실험의 범위를 확장 할 수있다. 여기에는 상피 세포와 박테리아, 또는 다른 세균 종 사이 것과 같은 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해이 시스템을 적용하는 것이 가능할 수있다. 이것은 Jurcisek 동부 등에 의해 기술 된 모델의 확장이다. 20 방법은 여기에 설명 된 사전 시각화에 생물막을 해결하기 위해 포르말린을 사용하여 유사한 슬라이드 챔버의 성장을 사용합니다. 또한,이 방법으로 우리는 즉시 염색 후 생물막을 시각화하고, 정착액을 사용하지 마십시오. 또, 생물막의 항생제의 효과를 테스트하는 외인성 인자를 추가한다. 이 모델은 따라서 상당히 인간의 질병에있는 세균 바이오 필름에 대한 우리의 이해를 촉진 할 가능성이있다.

세균 생물막은 서로에 부착되어 자기 분비 매트릭스 이탈되는 미생물의 기이다. 1,2- 고전, 그들은 물리적 흐름 조건 하에서 형성된 비 생물 적 또는 생물학적 표면에 부착 된 세균을 나타낸다. 바이오 필름은 또한 테스트 튜브에 형성된 열 풀 또는 펠리클의 공기 - 액체 계면의 표면과 같은 정적 상태 (흐름의 유무) 및 말단부에서 증가하는 것으로 나타났다. 그들은의 생물 연료, 부식 및 막힘의 결과, 저수지 또는 파이프에 형성 할 수있는 이러한 바이오 필름은 오래, 산업 공정에 큰 손해를 환경으로 인식하고 있습니다되었습니다. 3,4 그들은 카테터 관련된 감염, 낭포 성 섬유증 환자에서 폐 감염뿐만 아니라 수많은 다른 감염에 관여 된 바와 같이 바이오 필름은 또한 건강 관리 세팅에서 중요하다. 생물막 감염의 특징 중 5,6 하나는 드입니다항생제로 세균의 감수성을 주름과 선천성 면역 시스템에 의해 허가를 손상. 생물막 계 감염을 포함하는 7-9 가장 잘 연구, 임상 적 시나리오는 만성적 녹농균 생물막 감염된 낭포 성 섬유증 (CF), 환자에서 발생한다. 녹농균은 매우 어려운 치료를 할 수 있도록 만성 감염의 설립 동안 많은 변화를 겪을 수 있습니다. 10, 11 바이오 필름은 차등 선천성 면역을 활성화하고 염증을 구동 할 수있다. 이러한 감염은 CF 환자에서 증가 된 이환율 및 사망률을 초래할 12-14으로,이 컨텍스트에서 생물막 발달에 영향을 미칠 수있는 요인을 이해하는 것이 중요하다. 최근의 연구는 호스트 요인 녹농균 생물막 집계의 형성에 중요 제안합니다. 15이 바이오 필름은 항생제와 숙주 방어 메커니즘 감소 감수성에 기여한다. prese이러한 호중구 엘라 스타 제,뿐만 아니라, CF 폐에 존재하는 미생물로부터 분비 제품과 같은 숙주 유래 요인 NCE가 크게 생물막 형성 및 발달을 조절하는 잠재력을 가지고있다. (16) 또한, 바이오 필름은 다양한 경로의 발현을 조절하고 염증을 시작하는 호스트와 상호 작용합니다. 이러한 표준 크리스탈 바이올렛 분석 높은 처리량 방법, 생물막 공정에 관해서 몇 가지 정보를 제공 할 수 있지만, 이러한 요소에 대한 응답으로 바이오 필름의 시각화는보다 심층적 인 정보를 제공합니다. 이 논문에서는 체외 생물막의 개발 연구를 CF 환자의 객담에서 요소를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 상용 생물막 생존 키트를 사용 객담 함유 숙주 요인에 노출 생물막의 신속한 시각화 가능하다. 이 방법은 시각적 exogeno의 존재 생물막의 성장 중에 발생하는 변화를 식별하기 위해 사용될 수있다우리 제품 등 다양한 조건 하에서 생물막 개발의 변화를 분석하기위한 개선 된 방법을 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble software online</td><td></td><td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtering of sputum supernants</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Washing of biofilm chambers after media removal</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

바이오 필름은 자체 분비 매트릭스으로 쌌다 박테리아의 그룹으로 구성되어 있습니다. 이들은 산업 오염뿐만 아니라 많은 건강 관련 감염 현상 및 지속성에 중요한 역할을한다. 인간의 질병에서 가장 잘 설명하고 연구 바이오 필름 중 하나는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 감염으로 발생합니다. 호스트의 컨텍스트에서 생물막을 연구 할 때, 여러 가지 요인이 바이오 필름 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있다. 호스트 요인 생물막 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있는 방법을 확인하기 위해, 우리는 객담 상청액의 형태로 숙주 - 유도 인자의 존재 생물막의 성장에 고정 커브 글라스 챔버 법을 이용했다. 박테리아는 챔버에 접종 및 객담 여과 액에 노출되어있다. 성장의 48 시간 이후, 생물막 전에 공 초점 현미경 및 분석에 상업 생물막 생존 키트로 염색된다. 이미지 획득 후, 바이오 필름 특성은 다른 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 평가 될 수있다.이 방법은 우리가 항생제를 포함한 다양한 물질의 존재 생물막 성장의 주요 특성을 시각화 할 수 있습니다.

실험의 전반적인 디자인은도 1에 표시된다. 이 프로토콜의 사용은 다양한 기간 (예, 24, 48 또는 72 시간) 동안 성장 생물막의 변화를 시각화하기위한 편리한 방법을 제공한다. 중요한 것은 이러한 객담 여액 같은 외인성 신호 생물막 개발의 변화를 시각적으로 첨가 할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 10 % 객담 여액의 존재는 생물막의 구조 (도 2A, 하부 패널)을 변경할 수있다. (16)이 이미지는 바이오 필름의 평균 두께는 전체 바이오 매스 및 표면 커버리지를 포함한 주요 생물막 행렬들을 얻기 위해 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수있다. 이것은 전체 생물막 두께 증가 (도 2B, 3)에서 반사된다. 프레즌스 가래 생물막에 항생제 (16)의 효과는도 3에 도시되어있다. visuali으로<html> 바이오 필름 개발에 변경 내용을 쌩쌩, 하나는 더 나은 다른 요인은 크리스탈 바이올렛 염색 등 전통 생물막 분석보다 훨씬 더 나은 정도, 생물막 성장에 영향을 미칠 수있는 방법을 알 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig1.jpg" /> 그림 1 : 실험의 전반적인 디자인. 기본 프로토콜의 다이어그램 흐름. 밤새 (O / N) 배양은 1 / 1,000으로 희석하여 최종 OD가 0.5 (600)로 증가시킨다. 챔버의 coverglass의 우물에 접종하고 3 ~ 4 시간 동안 부착하도록 허용이 추가로 1 / 1,000, 200 μl를 희석한다. 이 후, 미디어를 제거하고 신선한 미디어로 대체. 바이오 필름은 원하는 시간에 대한 성장을 사용할 수 있습니다. 매체는 외인성 제품 또는 항생제는 바이오 필름에 첨가 될 수있다. 성장에 따라, 미디어 생물막은 염색 및 공 초점 이미징이 수행되고, 제거된다.ge.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig2.jpg" /> 그림 2 : 객담 여과 액에 노출 된 다음 생물막 개발의 대표 이미지. (A) 부르크 홀데 리아의 cepacia 단지의 대표 이미지 (BCC) 단독 (상단 패널) 미디어 챔버의 coverglass 성장의 48 시간 다음 임상 분리 또는 생물막 생존 키트로 염색 한 다음 10 % 객담 여과 액 (하단 패널)의 존재이다. 1 규모의 단위는 19.68 μm의를 나타냅니다. (B - C) 균주 (B)과 죽은 사람의 평균 두께 : BCC의 여러 이미지의 실제 비율 (C)는 객담이 여액 48 부재에서 슬라이드 챔버의 시간 (흰색 막대) 또는 존재 (검은 색 막대)에 대한 성장 분리합니다. 각 막대는 플롯 (45) 이미지의 평균을 나타냅니다평균의 표준 오차. ** 크루스 칼 - 월리스 테스트를 사용하여 제어 (미디어 만)에 비해 P &lt;0.001. 케네디 등의 알에서 적응 그림. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig3.jpg" /> 그림 3 : 가래 여과 액에 노출 생물막에 항생제 치료의 대표 이미지. (A) 부르크 홀데 리아 vietnamiensis 임상 분리의 이미지 (왼쪽) 형 미디어와 챔버의 coverglass이나 또는 토 브라 마이신의 1,000 μg의 / m없이 10 % 객담 여과 액 (오른쪽)의 존재 성장의 48 시간을 다음과 같습니다. 바이오 필름은 형 미디어에 24 시간 동안 성장시켰다 또는 매체는 10 % (v / v)의 객담 여과 액을 보충. 24 시간 후, 미디어를 제거하고, 메디칼로 대체항생제를 함유하는 (+/- 가래). 1 규모의 단위는 19.68 μm의를 나타냅니다. (B - C) 균주 (B)과 죽은 사람의 평균 두께 : 여러 이미지의 실제 비율 (C)는 (N = 9) B.의 vietnamiensis의 부재 또는 가래가 여액의 존재 슬라이드 챔버에서 48 시간 동안 성장 분리합니다. 각 막대는 평균의 표준 오차 플롯 (45) 이미지의 평균을 나타냅니다. ** p &lt;0.001 크루스 칼 - 월리스 시험을 이용한 대조군 (0 μg의 / ㎖)에 비해. 케네디 등의 알에서 적응 그림. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.3K 조회수.  Hospital for Sick Children. This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

비디오: Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

생체공학

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

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