Name: visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

السل يعترف زمالة بحثية من التليف الكيسي كندا.

لاحظ أن بحوث أخلاقيات المجلس (جندي كونفدرالي) مطلوب لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل مستشفى المرضى الأطفال REB # 1000019444. 1. إعداد عينات البلغم CF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينة البلغم من المرضى خلال الزيارات الروتينية للعيادة التليف الكيسي والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة البلغم على الجليد في غضون الساعة الأولى من جمع، إلى مختبر للأبحاث، إلى الخضوع لمعالجة. </li></ol> 2. معالجة البلغم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل حجم عينة البلغم الحصول عليها. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 2x حجم العينة (أي 2 أجزاء PBS، 1 جزء العينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط العينة بشكل جيد مع ماصة نقل. دوامة العينة على أعلى الإعداد لمدة 1 دقيقة لخلط تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل من الخليط المذكور أعلاه في عدد 1.5 مل أنابيب microcentrifuge المناسبة وتدور باستمرار في 5000 x ج ل20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون وجمع في أنبوب microcentrifuge نظيفة. ملاحظة: يتم اختبار العقم من الترشيح من قبل الطلاء على LB أجار وبتلقيح السائلة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين طاف البلغم في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. ملاحظة: البلغم من يمكن أيضا تجميع المرضى متعددة بعد الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدامها، وتمييع البلغم الترشيح 1/10 ت / ت (100 ميكرولتر من البلغم، 900 ميكرولتر من وسائل الاعلام) في وسائل الإعلام المرجوة. ملاحظة: هنا، تم استخدام مرق استذابة القياسية (LB) وسائل الاعلام. </li></ol> 3. غرف الطريقة ساترة لتشكيل بيوفيلم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو عزل البكتيريا من بين عشية وضحاها الاهتمام في وسائل الإعلام المطلوب عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: استخدمت عدد من البكتيريا المختلفة، بما في ذلك السريرية عزلات الزائفة الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية،بيركولديريا مجمع الشرهة وxylosoxidans المنتصلة. اختيار وسائل الاعلام يعتمد على سلالات وشروط الفائدة، ولكن وسائل الاعلام LB يمكن استخدامها لإجراء التجارب الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الثقافة بين عشية وضحاها، ضع 40 ميكرولتر من ثقافة إلى 4 مل من وسائل الإعلام الجديدة وتنمو لمدة 3-4 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) للحصول على الثقافة مع الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) ما يقرب من 0.5 -0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة من الخطوة 3.2 إلى 1/5 في وسائل الإعلام المطلوب مع 10٪ البلغم الترشيح أو بدون الترشيح البلغم (كما المراقبة). تركيز الآخرين من الترشيح البلغم يمكن اختبار (أي 50٪ أو 100٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 200 ميكرولتر من التخفيف البذور آبار غرف الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية دون أن تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 ساعات، وإزالة وسائل الإعلام وبلطف يغسل بيوفيلم مع وسائل الإعلام الجديدة 1X. استبدال 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة. ملاحظة: لدراسة آثار البلغم على بيوفيلم، وFRESوينبغي أن تتضمن وسائل الاعلام ح البلغم طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الأغشية الحيوية لتنمو لكمية من الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز، لتحل محل وسائل الاعلام كل 12 ساعة، دون غسل حتى الوقت للفحص المجهري. ملاحظة: لدراسة تأثير supernatants البلغم على القابلية للمضادات الحيوية بيوفيلم، تتم إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم ويتم الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام حتى تلطيخ والتصوير الأغشية الحيوية. </li></ol> 4. تلطيخ الأغشية الحيوية ومتحد البؤر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعقب المطلوب الوقت نمو (24-48 ساعة يعمل بشكل أفضل)، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار الغرفة وغسل بلطف كل غرفة مرتين مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط تلطيخ للبيوفيلم عن طريق خلط 1 ميكرولتر من كل صبغ (المنصوص عليها في عدة الجدوى) لكل مل من محلول الحاجة. جعل الصبغة في محلول مائي أو وسائل الإعلام. ينصح المياه من قبل الشركة المصنعة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من خليط الصبغة لكل بئر من covergla غرفSS ويحضن في درجة حرارة الغرفة، في الظلام لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خليط تلطيخ من الغرف وغسل كل بئر مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع المياه العذبة أو وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في التصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. </li></ol> 5. تصور الأغشية الحيوية مع متحد البؤر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الأغشية الحيوية الملون في غرف مباشرة بعد تلطيخ (في حدود 1 ساعة). تقليل التأخير في التصور من الشرائح التي تلطيخ 1-2 غرف 8 جيدا في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التصوير باستخدام متحد البؤر المجهر مع الليزر لالإثارة وتصفية مجموعات لاقتناء. ملاحظة: هنا، والغزل نظام القرص متحد مع ليزر بورياليس الطيفية استخدمت لإثارة (الأخضر: 561 نانومتر: 491nm، الأحمر). واستخدمت الانبعاثات تصفية مجموعات من 515/40 و624/40 لتصور البقع من عدة قابلية بيوفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور باستخدام الهدف المياه 25X على المجهر متحد البؤر مع الكاميرا. </li><lط&gt; استخدام Z-الأكوام لنموذج بيوفيلم. التقاط صور كل 0.5-1 ميكرون ابتداء من اول طائرة في التركيز على الإطار في التركيز الأخير من بيوفيلم (عادة تمتد 30-80 ميكرومتر لمدة 48 الأغشية الحيوية ساعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 3-5 صور من كل جانب. ملاحظة: وهكذا لمدة 8 ساترة غرف جيدا، سيتم إنشاء 24-40 الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الصور للتحليل. ملاحظة: يجب حفظ الصور كملفات OME-TIFF ليتم تحليلها باستخدام COMSTAT 18،19. تعليمات لتحليل الصور بيوفيلم يمكن العثور عليها في http://www.comstat.dk/. مرة واحدة يتم استيراد الصور والمعلمات مثل سمك متوسط ​​والكتلة الحيوية وتغطية السطح لكل قناة (الأحمر والأخضر) يمكن تحليلها. </li></ol>

<ol>
	<li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+with+biofilm+formation:+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy.">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giving+structure+to+the+biofilm+matrix:+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes.">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li><li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Microbial+coaggregation:+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development.">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation:+a+clinically+relevant+microbiological+process.">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li><li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance.">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li><li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-specific+antibiotic+resistance.">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li><li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario,+Canada.">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li><li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis.">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li><li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells.">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li><li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa.">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li><li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses.">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).</li><li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li><li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms.">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li><li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients.">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li><li>Vorregaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).</li><li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide.">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).</li></ol>

لا شيء.

الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تسمح لتصور الأغشية الحيوية البكتيرية التي تزرع في وجود المنتجات الخارجية. ليس من المستغرب أن إنتاج exoproducts له أهمية عند استخدام هذا النوع من النظام. على سبيل المثال، Dithiothreitol (DTT)، وغالبا ما تستخدم على عينات البلغم الإنسان لمساعدة تسييل العينات. ومع ذلك، فإن تأثير التلفزيون الرقمي الأرضي وحدها يمكن أن تقلل تنمية بيوفيلم وقدرتها على البقاء (لا تظهر البيانات). وهكذا، والضوابط المناسبة لجميع الشروط اللازمة. وعلاوة على ذلك، إضافة منتجات البلغم الإنسان يخلق التنوع الكامن في التجربة يرجع ذلك إلى حقيقة أن البلغم كل مريض لديه microbiome فريدة من نوعها. لضبط هذا، وقد استخدمنا عينات البلغم المجمعة لتجنب نتائج محددة للمرضى. بالإضافة إلى ذلك، فإن اختيار الوسائط المناسبة مهم عند استخدام أي نظام نموذجي. ينصح وسائل الاعلام القياسية للنمو بيوفيلم الكائن الحي المقصود من أجل الإعداد الأولي للنظام. إذا كان الهدف من التجربة هو الرمزify كيفية منتجات خارجية تؤثر على تشكيل بيوفيلم، والوسائط الغنية المغذية التي توفر تشكيل بيوفيلم الكافي اقترح. وهذا سوف يسمح التغذية الكافية للنمو بينما تحديد كيفية عوامل خارجية قد تؤثر على بيوفيلم. وسائل الإعلام الأخرى، مثل وسائل الإعلام الحد الأدنى أو محددة، ويمكن استخدامها لشروط معينة أفضل تقليد. وقد استخدمت وسائل الإعلام الأخرى مع نتائج جيدة في هذا النظام (لا تظهر البيانات). الحجز على الأغشية الحيوية إلى ساترة غرف قوي، يجب توخي الحذر لكن كبيرة عند إزالة / إضافة وسائل الإعلام أو أثناء غسل خطوات من الأغشية الحيوية لمنع تعطيل الأغشية الحيوية. وقد أسفر استخدام وصمة عار الحية القتلى حسب بروتوكول الشركة المصنعة نتائج جيدة للنظام وصفه. هناك عدد من العوامل يمكن أن تؤثر على نسبة مضان من الصور (بما في ذلك امتصاص الصبغة من البكتيريا، والكثافة النسبية للإعدادات بيوفيلم وزيادة كاشف)، ومع ذلك، ينبغي أن تتصل هذه الطريقة إلى ما لوحظ في الصورةالصورة. ويمكن استخدام تدابير أخرى لتمثيل القيمة النسبية للميت بيوفيلم / الحية، مثل الكتلة الحيوية من الخلايا الميتة كنسبة من إجمالي الكتلة الحيوية موجودة في بيوفيلم (على النحو المستمد من COMSTAT). باستخدام بكتيريا لتأكيد جدوى بيوفيلم في التجارب المتكررة ينصح لتأكيد الملاحظات البصرية لهذا النموذج. نظرا لعدم التجانس المتأصل في الأغشية الحيوية، صور متعددة من كل غرفة وغرف متعددة وينبغي أن تستخدم في كل حالة في تجربة. وهذا يضيف إلى تكلفة ومدة هذه التجارب. الحصول على الصور مهم قبل لتحليل البيانات من هذه التجارب. يجب الحرص على لم تنته تشبع الصور وعند تحديد الإعداد المجهر. اعتمادا على مستوى التفاصيل المطلوبة والمجهر المتاحة، وعدد من الأهداف المختلفة (10X، 25X، 40X 63X و) يمكن استخدامها للحصول على الصور، على الرغم من أننا نجد أن الهدف 25X يعطي أفضل الصور. سمك رانه Z كومة يمكن أن تؤثر أيضا على جودة الصورة الشاملة ومستوى التفاصيل. بعد الصور التي التقطت كل 0.5-1 ميكرون يبدو لتقديم صور واضحة في 25X الهدف، مع الحفاظ على الصور Z-المكدس في حجم والتي يمكن تحليلها بواسطة COMSTAT على أنظمة الكمبيوتر القياسية. هذه التجارب هي أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا من المقايسات المرفقات الأخرى، ولا يمكن أن يتم ذلك بطريقة إنتاجية عالية. في هذا الإجراء، والبكتيريا تلتصق على سطح البورسليكات، والذي لا يعكس وجود حالة في الجسم الحي وقد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية. ومع ذلك، لأنها توفر معلومات إضافية ويمكن أن تولد فرضيات لآلية تتعلق بيوفيلم المقاومة للمضادات الحيوية والاستجابة الفسيولوجية للإشارة الخارجية. إذا كان الهدف من هذه التجربة هو أن نفهم كيف تتغير الأغشية الحيوية استجابة لعوامل مختلفة، بدلا من تحديد المركبات المضادة للبيوفيلم باستخدام الأساليب الإنتاجية العالية على سبيل المثال، المعلومات الإضافية المكتسبة باستخدام رأسلوبه يجعل طريقة جديرة بالاهتمام. وهكذا فإن الطريقة الحالية هو تقدم كبير على المقايسات مرفق محدودة السابقة مثل فحص الكريستال البنفسجي، الذي هو الأكثر شيوعا لدراسة الأغشية الحيوية. الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء ما يلي: 1) ضمان تجهيزها في الوقت المناسب من عينات البلغم لتجنب تدهورها؛ 2) أن تكون لطيف مع التغييرات وسائل الإعلام على الأغشية الحيوية لتجنب تعطل بيوفيلم و 3) القيام القياسات المتكررة التصوير بيوفيلم لضمان تمثيل دقيق لسمك بيوفيلم نظرا لعدم تجانس تشكيل بيوفيلم. بمجرد انشاء نظام الأنواع البكتيرية معينة، يمكن للمرء أن اختبار عدد من الظروف المختلفة، بما في ذلك آثار العوامل الخارجية على العزلات السريرية متعددة. وقد استخدم هذا النظام لدراسة تأثير المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية تتعرض لالبلغم البشري 16 ومقارنة العزلات السريرية شديدة المقاومة ومقاومة انتقالية تربط بين. 17 تعديلات على ساترة غرف، مثل طلاء أسفل مع الميوسين أو الكولاجين الصغيرة سقالة (على سبيل المثال، puracol)، يمكن أن تزيد من توسيع نطاق التجارب الممكنة. قد يكون من الممكن للتكيف مع هذا النظام لدراسة التفاعلات المباشرة، مثل تلك التي بين الخلايا الظهارية والبكتيريا، أو بين الأنواع البكتيرية المختلفة. هذا هو توسيع نموذج صفها Jurcisek وآخرون. 20 يستخدم أسلوب النمو غرفة شريحة مماثلة لتلك التي وصفها هنا ويستخدم الفورمالين لإصلاح الأغشية الحيوية قبل التصور. بدلا من ذلك، في هذه الطريقة نحن تصور الأغشية الحيوية على الفور بعد تلطيخ وعدم استخدام مثبت. وبالإضافة إلى ذلك، ونضيف إلى عوامل خارجية لاختبار تأثير المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية. وبالتالي هذا النموذج لديه القدرة على زيادة فهمنا من الأغشية الحيوية البكتيرية في الأمراض التي تصيب البشر.

الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تعلق على بعضها البعض، والمغطى في مصفوفة يفرز النفس. 1،2 كلاسيكي، إلا أنها تمثل البكتيريا تعلق بدنيا لسطح اللاأحيائي أو الحيوية شكلت في ظل ظروف التدفق. وقد تبين أيضا الأغشية الحيوية للنمو في ظروف ثابتة (غياب تدفق) والقاصي من السطوح، مثل في واجهة الهواء السائل من الحمامات الحرارية أو pellicles شكلت في أنابيب الاختبار. منذ فترة طويلة التعرف على هذه الأغشية الحيوية في البيئة وهم اذى رئيسيا في العمليات الصناعية، كما أنها يمكن أن تشكل في خزانات المياه أو في الأنابيب، مما أدى إلى biofouling والتآكل والعقبات. 3،4 الأغشية الحيوية هي أيضا حاسمة في مرافق الرعاية الصحية، كما ثبت أن تشارك في العدوى المرتبطة القسطرة، والالتهابات الرئوية في مرضى التليف الكيسي، وكذلك في التهابات أخرى عديدة. 5،6 واحدة من السمات المميزة لالتهابات بيوفيلم هي ديمجعدة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية وضعاف إزالة من قبل النظام المناعي الفطري. 7-9 درست معظم جيدا، والسيناريوهات ذات الصلة سريريا تنطوي عدوى القائم على بيوفيلم يحدث في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF)، المصابين المزمنين مع الأغشية الحيوية الزنجارية الزائفة. الزائفة الزنجارية يمكن أن يخضع لعدد من التغييرات خلال إنشاء عدوى مزمنة تجعل من الصعب جدا لعلاج. يمكن 10،11 الأغشية الحيوية تفعيل تفاضلي المناعة الفطرية ودفع الالتهاب. 12-14 وهذه الالتهابات تؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات في مرضى التليف الكيسي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم العوامل التي يمكن أن تؤثر على التنمية بيوفيلم في هذا السياق. وتشير دراسة حديثة إلى أن العوامل المضيفة هي الحاسمة في تشكيل المجاميع بيوفيلم الزائفة الزنجارية. وتساهم 15 هذه الأغشية الحيوية لتقليل التعرض للمضادات الحيوية وآليات دفاع المضيف. وبريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من العوامل المستمدة من المضيفة، كالإيلاستاز العدلة، فضلا عن المنتجات يفرز من الكائنات الدقيقة الموجودة في CF الرئة، لديها القدرة على تعديل إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم والتنمية. 16 وبالإضافة إلى ذلك، الأغشية الحيوية تتفاعل مع المضيف لتعديل تعبير عن العديد من الممرات وبدء الالتهاب. في حين أساليب إنتاجية عالية، مثل معيار فحص الكريستال البنفسجي، يمكن أن توفر بعض المعلومات فيما يتعلق بعملية بيوفيلم، والتصور للبيوفيلم ردا على هذه العوامل توفر مزيد من المعلومات المتعمقة. في هذه المخطوطة وصفنا طريقة لاستخدام عوامل من البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في المختبر. وتسمح هذه الطريقة لتصور السريع الأغشية الحيوية تتعرض لعوامل المضيف البلغم التي تحتوي على استخدام عدة قابلية بيوفيلم التجارية. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد بصريا التغييرات التي تحدث أثناء نمو بيوفيلم في وجود exogenoلنا المنتجات، ويمثل طريقة تحسين لتحليل التغيرات في التنمية بيوفيلم في ظل ظروف مختلفة.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble software online</td><td></td><td>COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Standard media for overnight gowth/biofilm growth</td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtering of sputum supernants</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Washing of biofilm chambers after media removal</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model

تتكون الأغشية الحيوية من مجموعة من البكتيريا المغطى في مصفوفة يفرز النفس. أنها تلعب دورا هاما في التلوث الصناعي وكذلك في تطوير واستمرار العديد من الأمراض المتصلة بالصحة. تحدث أحد الأغشية الحيوية صفها وصفا جيدا ودرس في الأمراض التي تصيب البشر في عدوى الالتهاب الرئوي المزمن من مرضى التليف الكيسي. عند دراسة الأغشية الحيوية في سياق المضيف، يمكن أن العديد من العوامل تؤثر تشكيل بيوفيلم والتنمية. من أجل تحديد مدى العوامل المضيفة قد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية، استخدمنا طريقة ساترة تشامبيريد ثابت للنمو الأغشية الحيوية في وجود عوامل المستمدة من المضيفة في شكل supernatants البلغم. هي المصنفة البكتيريا في غرف ومعرضة للالرواشح البلغم. وبعد 48 ساعة من النمو، هي ملطخة الأغشية الحيوية مع بيوفيلم مجموعة الجدوى التجارية قبل الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل. وبعد الحصول على الصور، والخصائص بيوفيلم يمكن تقييم استخدام منصات البرمجيات المختلفة.هذا الأسلوب يسمح لنا تصور الخصائص الأساسية للنمو بيوفيلم في وجود مواد مختلفة بما في ذلك المضادات الحيوية.

ويمثل التصميم الشامل للتجربة في الشكل 1. استخدام هذا البروتوكول يوفر طريقة مريحة لتصور التغيرات في الأغشية الحيوية نمت لفترات زمنية مختلفة (على سبيل المثال، 24، 48 أو 72 ساعة). الأهم من ذلك، إشارات خارجية، مثل البلغم الرواشح، ويمكن أن يضاف إلى تصور التغييرات في تطوير بيوفيلم. كما رأينا في الشكل 2، وجود 10٪ الرواشح البلغم يمكن تغيير بنية بيوفيلم (الشكل 2A، لوحات أقل). ويمكن تحليل 16 هذه الصور باستخدام برنامج COMSTAT للحصول على المصفوفات بيوفيلم الرئيسية، بما في ذلك سمك متوسط بيوفيلم، إجمالي الكتلة الحيوية وتغطية السطح. وينعكس هذا في زيادة إجمالية في سمك بيوفيلم (الأرقام 2B، و 3). وأظهرت 16 تأثيرات المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية في البلغم وجود في الشكل (3). بواسطة visuali<html> زينغ التغييرات في تطوير بيوفيلم، يمكن للمرء أن نقدر أفضل لكيفية عوامل مختلفة يمكن أن يؤثر على نمو بيوفيلم، إلى حد أفضل بكثير من المقايسات بيوفيلم التقليدية، مثل تلطيخ الكريستال البنفسجي. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig1.jpg" /> الشكل 1: عموما تصميم التجربة. تدفق الرسم البياني من البروتوكول الأساسي. غير المخفف ل(O / N) الثقافة بين عشية وضحاها 1/1000، وسمح لتنمو إلى OD النهائي 600 من 0.5. ومما يخفف هذا 1/1000 و 200 ميكرولتر من المصنف في بئر ساترة تشامبيريد وسمح لنعلق لمدة 3-4 ساعة. وبعد ذلك، تتم إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. يسمح الأغشية الحيوية لتنمو لمدة زمنية محددة. ، يمكن إضافة وسائل الإعلام المنتجات الخارجية أو المضادات الحيوية لالأغشية الحيوية. في أعقاب النمو، تتم إزالة وسائل الإعلام، ملطخة الأغشية الحيوية وأن يتم التصوير متحد البؤر.ge.jpg مرحبا &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig2.jpg" /> الشكل 2: صور الممثل للتنمية بيوفيلم بعد التعرض لالرواشح البلغم. (A) صور الممثل بيركولديريا مجمع الشرهة (BCC) العزلات السريرية التالية 48 ساعة من النمو في ساترة تشامبيريد مع وسائل الإعلام وحدها (لوحات أعلى) أو في وجود 10 الرواشح٪ البلغم (لوحات أقل) تليها تلطيخ مع مجموعة الجدوى بيوفيلم. 1 وحدة على نطاق وتمثل 19.68 ميكرون. (B - C) متوسط سمك العزلات (ب) والميتة: نسبة الحية (ج) من صور متعددة من BCC العزلات نمت لمدة 48 ساعة في غرف الشرائح في غياب (أشرطة بيضاء) أو وجود (أشرطة سوداء) من البلغم الرواشح. يمثل كل شريط يعني من 45 صور تآمرمع الخطأ المعياري للمتوسط. ** ف &lt;0.001 مقارنة مع الشاهد (وسائل الإعلام وحدها) باستخدام اختبار كروسكال واليس. شخصية مقتبسة من كينيدي وآخرون. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54819/54819fig3.jpg" /> الشكل 3: صور الممثل العلاج بالمضادات الحيوية على الأغشية الحيوية تتعرض لالترشيح البلغم. (A) صور من العزلات السريرية بيركولديريا vietnamiensis عقب 48 ساعة من النمو في ساترة تشامبيريد مع وسائل الإعلام وحدها (يسار) أو في وجود 10 الرواشح٪ البلغم (يمين) مع أو بدون 1000 ميكروغرام / م التوبراميسين. وقد نمت الأغشية الحيوية لمدة 24 ساعة في وسائل الإعلام وحدها أو وسائل الإعلام تستكمل مع 10٪ (ت / ت) البلغم الرواشح. بعد 24 ساعة، تمت إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع ميديو(+/- البلغم) التي تحتوي على المضادات الحيوية. 1 وحدة على نطاق وتمثل 19.68 ميكرون. (B - C) متوسط سمك العزلات (ب) والميتة: نسبة الحية (ج) من صور متعددة (ن = 9) من B. vietnamiensis العزلات نمت لمدة 48 ساعة في غرف الشرائح في غياب أو وجود الرواشح البلغم. يمثل كل شريط يعني من 45 صور تآمر مع الخطأ المعياري للمتوسط. ** ف &lt;0.001 مقارنة مع الشاهد (0 ميكروغرام / مل) باستخدام اختبار كروسكال واليس. شخصية مقتبسة من كينيدي وآخرون. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54819/54819fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model at JoVE.com

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.3K Views.  Hospital for Sick Children. This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Video: Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

استخدام إنتاجية عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Bioengineering

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

نموذج وينف - غير مكلفة و تراكتابل مصغر من المخاط توصيل القصبات لدراسة الأحياء الدقيقة من التهابات الرئة

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

تصور الزائفة الزنجارية داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Biofilms are aggregates of microorganisms that rely on a self-produced matrix of extracellular polymeric substance for protection and structural integrity. The nosocomial pathogen, Pseudomonas aeruginosa, is known to adopt a biofilm mode of growth, causing chronic pulmonary infection in patients with cystic fibrosis (CF). The computer program, COMSTAT, is a useful tool for quantifying antimicrobial-induced changes in P. aeruginosa biofilm architecture by extracting data from three-dimensional confocal images. However, standardized operation of the software is less commonly addressed, which is important for optimal reporting of biofilm behavior and cross-center comparison. Thus, the aim of this protocol is to provide a simple and reproducible framework for quantifying in vitro biofilm structures under varying antimicrobial conditions via COMSTAT. The technique is modeled using a CF P. aeruginosa isolate, grown in the form of biofilm replicates, and exposed to tobramycin and the anti-Psl monoclonal antibody, Psl0096. The step-by-step approach aims to reduce user ambiguity and minimize the chance of overlooking crucial image-processing steps. Specifically, the protocol emphasizes the elimination of subjective variations associated with the manual operation of COMSTAT, including image segmentation and the selection of appropriate quantitative analysis functions. Although this method requires users to spend additional time processing confocal images prior to running COMSTAT, it helps minimize misrepresented biofilm heterogenicity in automated outputs.

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

Antimicrobial-induced changes to Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture differ among clinical isolates cultured from patients with cystic fibrosis and chronic pulmonary infection. Following confocal microscopy, COMSTAT software can be utilized to quantify variations in biofilm architecture (e.g., surface area, thickness, biomass) for individual isolates to assess the efficacy of anti-infective agents.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video