This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

L.에서 Sporopollenin Exine 캡슐 1. 추출 (SEC 초) 속 clavatum 포자 주 : SEC 추출 과정의 가연성 분말 (L. 속 clavatum), 고온 부식 산, 가연성 용제, 따라서 적절한 개인 보호 장비 (고글, 안면 마스크, 장갑, 실험실 코트), 사용에 승인 된 위험 평가 및 처분을 포함한다 공인 실험실 직원이 화학 물질은 필수적이다. <ol><li> 포자 탈지 <ol><li> 유리 냉각기, 물 순환 시스템 및 수조 (도 1)를 사용하여 흄 후드의 환류 설정을 준비한다. </li><li> 100g L. 무게 떨어진 점화원에서 먼지를 만들고없이 속 clavatum 포자. 참고 : 상업적으로 얻을 수 있었다 여기에 사용 된 포자 (자료 목록을 참조하십시오). </li><li> 자기 교반 막대로 1 L의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 둥근 바닥 플라스크에 천천히 전송 포자. </li><li> 의 포자에 500 ml의 아세톤 추가PTFE 플라스크 균질 현탁액을 부드럽게 진탕 플라스크. </li><li> 50 ° C에서 물 목욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 냉각기에 연결합니다. </li><li> 200 rpm으로 교반하면서 6 시간 동안 아세톤에 환류를 수행 한 다음 실온에서 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 진공 상태에서 여과지를 사용하여 현탁액을 여과하고, 대형 (15cm 직경) 유리 페트리 접시에 탈지 포자를 수집합니다. </li><li> 용매 증발을위한 구멍이있는 알루미늄 호일로 덮어 실온 (흄 후드)에서 포자를 건조. </li></ol></li><li> 분해법 <ol><li> 85 % 탈 (DI) 물 (v / v)의 인산을 준비하고 1 L의 PTFE 플라스크에 탈지 건조 포자를 전송합니다. </li><li> 탈지 포자에 인산 (85 % v / v)의 500 ML을 추가합니다. </li><li> 70 ℃에서 수욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 응축기에 연결한다. </li><li> 30 시간 동안 인산에 부드러운 환류 (70 ° C)을 수행 한 다음에 허용실온에서 냉각. </li><li> 500 ml의 따뜻한 DI 물을 사용하여 상기 현탁액을 희석하고, 필터 종이를 사용하는 진공 여과에 의해 수집 SEC 초. </li><li> 세척액의 시리즈를 수행하기 위해 세 L 유리 비커에 SEC 초 옮긴다. </li></ol></li><li> 삼성 세탁기 <ol><li> 흄 후드에서 SEC 초를 포함하는 3 L의 유리 비커를 놓습니다. </li><li> 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 800 ml의 고온 (50 ° C) DI 물을 추가합니다. </li><li> 여과지 진공 여과 설정을 사용하여 상기 현탁액을 필터. </li><li> 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 수집합니다. </li><li> 반복 1.3.1 단계를 반복합니다. 1.3.4합니다. 다섯 번. </li><li> 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 600 ml의 고온 (45 ° C) 아세톤을 추가합니다. </li><li> 진공하에 여과에 의해 SEC 초를 수집하고 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 전송합니다. </li><li> 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (50 ℃) 2 M 염산을 사용. </li><li> 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 호 600 ml에 사용t (50 °의 C) 2 M 수산화 나트륨. </li><li> 반복 1.3.1과 1.3.4 8 번 단계를 반복합니다. </li><li> 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 아세톤을 사용. </li><li> 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 에탄올을 사용. </li><li> 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 800 ㎖ (50 ℃)의 DI 물을 사용. </li><li> 모든 수분을 제거하기 위해 24 시간 동안 실온에서 흄 후드에서 여섯 대형 유리 페트리 접시 건조에 깨끗한 SEC 초를 전송합니다. </li><li> 60 ℃에서 10 시간 또는 일정 중량까지 1 밀리바의 진공에서 진공 오븐에서 건조 SEC 초. </li><li> 건조 SEC 초를 수집하고 폴리 프로필렌 병에 전송할 수 있습니다. </li><li> 건조 캐비닛에 SEC 초를 저장합니다. </li></ol></li></ol> SEC 초 2. 특성 <ol><li> 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 주사 전자 현미경 분석 (41)을 수행합니다. </li><li> 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 원소 분석 (41)을 수행합니다. 디스피 원소 분석 전에 최소한 1 시간 동안 60 ° C에서 모든 샘플은 6.25의 곱셈과 퍼센트 질소를 이용하여 단백질 함량을 계산한다.도 11는 각 샘플에 대한 삼중 측정하여 결과를 얻을. </li><li> 동화상 입자 분석기를 사용 micromeritic 특성 분석을 수행. 41 </li><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 미처리 스캔 처리 및 FITC-BSA로드 된 SEC 초. 41 </li></ol> 진공로드 기술 3. 생체 거대 분자 캡슐화 <ol><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 DI 물과 전달을 이용하여 125 ㎎을 1.2 ㎖ / ml의 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 제조 하였다. </li><li> SEC 초 150 mg의 무게를 측정하고, BSA 용액에 전송할 수 있습니다. </li><li> 균질 한 용액을 형성하기 위해 10 분 동안 튜브를 소용돌이. </li><li> 여과지를 이용하여 튜브를 커버. </li><li> 1 밀리바에서 진공 4 시간 동안 동결 건조기 플라스크 건조에 튜브를 전송합니다. </li><li> 3.1 단계 수행3.5. 3 개의 독립적 인 배치합니다. </li><li> BSA에로드 SEC 초를 수집하고 박격포와 유 봉을 사용하여 응집체를 제거합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 BSA-로드 SEC 초를 전송하고 잔여 BSA를 제거하는 2 ml의 탈 이온수를 추가합니다. </li><li> 5 분 4704 XG에서 원심 분리하여 SEC 초를 수집하고 상층 액을 버린다. </li><li> 한 번 탈 이온수로 세척을 반복합니다. </li><li> 여과지를 사용하여 BSA로드 SEC 초를 포함하는 튜브를 커버. </li><li> 냉동실 (-20 ° C)에 SEC 초를 전송하고 1 시간 동안 동결. </li><li> 추가로 특성화 될 때까지 냉장고에 24 시간 저장을위한 SEC 초 건조 동결. </li><li> 단계 3.1에서와 동일한 절차를 사용하여 BSA없는 위약 SEC 초를 준비한다. 3.13에. </li><li> 단계 3.1에서와 동일한 절차를 이용하여 FITC-BSA로드 SEC 초를 준비한다. 3.13에. </li></ol> 캡슐화 효율 4. 결정 <ol><li> 2 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 BSA-로드 SEC 초 5 mg의 무게. </li><li> 1.4 ml의 포스 추가테 5 분 동안 생리 식염수의 pH가 7.4 (PBS)와 소용돌이를 버퍼링. </li><li> 프로브는 10 초 3 회 40 %의 진폭의 현탁액을 초음파 처리. </li><li> 0.45 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 필터를 사용하여 상기 용액을 필터. </li><li> 단계 4.1에서와 동일한 절차를 수행한다. 4.4. 위약 SEC 초를 사용. </li><li> 공백으로 위약을 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한다. </li><li> BSA의 양은 PBS에서 BSA 표준 곡선 (200 내지 1,000 μg의 / ㎖)을 사용하여 캡슐화 정량화. 42 </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 작품, L.에서 SEC 추출의 체계적인 분석 속 clavatum 포자 제시이 보고서는 또한 높은 공정 온도 (180 ° C)을 필요로하는 기존의 프로토콜과 대조적으로, 기존의 일반적으로 사용되는 프로토콜. 11 크게 간소화를 달성하면서 고품질의 캡슐을 제조 할 수 있음을 표시하고, 긴 처리 시간 (7 일) 11 현재 SEC 추출 처리 최적화 주로 분해법 단계의 온도 및 시간을 절감에 집중 하였다. 탈지 및 알칼리 처리는 포자에서 sporoplasmic 재료의 최소한의 제거를 제공한다. 120 시간이 sporoplasmic 물질의 최대 양을 제거에 그러나, 5 시간에서 분해법. 결과는 총 처리 시간 및 온도를 급격히 종래 기술 (11)로부터 감소하고 중간 온도에서 30 시간 것이 될 수 있다는 것을 나타내는 (70° C)을 인산 최적 품질 캡슐을 제공 하였다. 또한, 30 시간의 분해법을 넘어, 그것은 SEC 초는 SEC 초의 전체 배치는 전반적인 구조적 무결성의 감소를 나타내는 될 수 있음을 시사 파괴하기 시작했다 입자 파편의 상당한 증가가 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 또한, 그 주목해야 L. 속 clavatum는 비교적 견고한 sporopollenin 2를 포함하는 것으로 간주되고, 이러한 산의 농도, 온도 및 / 또는 가수 분해 시간 등이 프로토콜에 관련된 특정 처리 조건이 다른 꽃가루 종 조정해야 할 수도있다. 그것은 보였다 그 분해법 만 사용하여 인산 (85 % V는 / v)의 30 시간 수율 깨끗하고 그대로 SEC 초를 위해. (41) 데이터는 분해법은 SEC의 생산에 중요한 단계임을 확인하여 SEC 초 생산. 마지막으로, 산 전용 초 남음 BSA의 밀봉에 사용 된 로딩의 높은 수준을 관찰 하였다. 로딩 wSEC 내부 캐비티 압력 강제 빈 캡슐로 BSA 용액을 그리도록 변경된다 진공의 적용에 의해 달성있다. 나노 채널 (직경 15 -. 20 ㎚), 이전에 L.의 exine 벽에서 확인되었다 속 clavatum 7은 용액 큰 내부 공동 내로 입력 할 수있다. 로딩 후, 캡슐을 세척하고, 자유 유동 분말을 수득 동결 건조기에서 건조시켰다. 크기의 균일 성 및 형태 학적 특성은 성공적인 밀봉 재료의 품질을 평가하기위한 중요한 요소이다. BSA로드 SEC 초의 관찰 크기의 균일 성 및 손상 형태는 마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 분해법 전용 처리 SEC 초의 잠재적 인 사용을 확인했다. 이러한 결과는 SEC 초의 대규모 산업 생산과 약물의 마이크로 캡슐화에 SEC 초 잠재적 애플리케이션에서 큰 관심을 자극 중요단백질, 펩티드, 보조 식품, 기능 식품, 화장품.

이 마이크로 캡슐화 응용 프로그램에서 사용하기 위해 식물의 포자와 꽃가루에서 얻은 천연 식물성 캡슐에 상당한 관심이. 인 자연에서 1-15, 포자 및 꽃가루는 가혹한 환경 조건에 대한 민감한 유전 물질에 대한 보호를 제공합니다. 식물 포자 꽃가루의 기본 구조는 통상적으로 외부 쉘 층 (exine) 내부 쉘층 (intine) 내부의 세포질 물질을 포함한다. exine는 sporopollenin이라 화학적 강력한 1,9,10,13,16 생체 고분자로 구성되고 intine 주로 셀룰로오스 재료로 구성된다. 16-18 빈 캡슐 7,9 다양한 공정에 의해 단리 할 수 세포질 물질을 제거하기위한 , 단백질, 그리고 intine 층. 2,12,16이 sporopollenin exine 캡슐 (초 남음) 그들의 좁은 크기 분포 균일 한 형태로 합성 봉지에 강력한 대안을 제공합니다. 7,9,13,19,20에게를이러한 석송 같은 다양한 식물 종으로부터 SEC 초를 얻기 표준화 된 프로세스의 개발은, 약물 전달, 식품, 화장품 등의 분야에서 마이크로 캡슐화 광범위한 응용 가능성을 연다. 6,10-13,21 SEC 초를 얻기 위해, 연구자들은 제 1 유기 용매와 포자 및 꽃가루를 처리 한 세포 내 내용물을 제거하는 알칼리 용액에서 환류시켰다. 22-25하지만, 나머지 캡슐 구조가 여전히 셀룰로오스 intine 층을 포함하도록 결정 하였다. 이것을 제거하기 위해, 연구자들은 SEC의 intine 제거 바람직한 방법되고 인산으로 몇 일 동안 22-25 염산, 뜨거운 황산, 또는 뜨거운 인산을 사용하여 장시간 산성 가수 분해 처리의 사용을 탐구. (2) 그러나, 지속적인 수년에 걸쳐 연구는 다양한 포자와 꽃가루가 날 처리 가혹한에 탄력성의 다른 학위를 가지고 있음을 보여 주었다thods 일반적으로 사용. (26, 27) 일부 포자와 꽃가루가 완전히 분해하고 강한 알칼리 용액에서 모든 구조적 무결성을 잃고, 또는 무겁게 강한 산성 용액에 손상.가 16 처리 조건에 SEC 응답의 변화는 화학 물질의 미묘한 변화에 기인 구조 및 화학 종 사이의 sporopollenin의 exine 재료 exine 형태. 28 인해 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 견고성의 변동, 포자 꽃가루 각 종의 처리 조건을 최적화 할 필요가있다. L. 종의 식물 포자 속 clavatum는 SEC 초 가장 널리 연구 단일 소스되고있다. . 이는이 때문에 널리 이용 가능성, 낮은 비용, 단 분산 및 화학적 안정성에 주로 제안된다 9, 29 포자가 쉽게 하나의 그룹의 형태 sporoplasmic 내용을 수확하여 포함 할 수있다 - 2 ㎛의 세포 소기관 및 Biomolecules. 11 L. 속 clavatum 포자 치료 다양한 용도 천연 분말 윤활제 화장품 30,31베이스, 30 및 32-36 한방에 사용되어왔다. L.로부터 얻어진 SEC 초 속 clavatum 포자 및 처리 후의 꽃가루.이 다른 종으로부터의 SEC 초 이상 처리 탄력적으로 도시 된, 결과 SEC 초들은 복잡 microridge 구조 및 높은 형태 균일 캡슐화 넓은 내부 공동을 제공하는 동시에 유지하는 것으로 나타났다. 7 연구는 것을 나타냅니다 L. 속 clavatum SEC 초 마약, 10, 13 백신, 11 단백질, 7, 14 셀, 8 오일, 5-7,9 및 식품 보조제의 캡슐화에 사용할 수 있습니다. 5,15 관찰 SEC 적재 효율은 기존에 비해 상대적으로 높은 캡슐화 재료. 7은도보고 혜택을 제공하고 있습니다SEC 밀봉하는 등, 6,10 맛을 마스킹하기위한 산화에 대하여 천연 어느 정도의 보호를 제공한다. 기존의 연구에서 12 능력 L. 위해 가장 일반적으로 사용되는 SEC 추출법 등 속 clavatum은 네 가지 주요 단계를 기반으로합니다. 단계 하나는 포자를 탈지 50 ° C에서 최대 12 시간 동안 아세톤 용매 환류입니다. 11 2 단계는 세포질과 단백질 물질을 제거하기 위해 120 ° C에서 최대 12 시간 동안 6 % 수산화 칼륨의 알칼리성 환류입니다. 11 단계 세 180 ° C에서 최대 7 일 동안 85 % 인산에 산 환류는 셀룰로오스 intine 재료를 제거하는 것이다. 11 4 단계가 나머지 비 exine 물질을 제거하기 위해 물, 솔벤트, 산, 염기를 사용하는 포괄적 인 세척 공정 인 화학 잔류 물. 밀봉 애플리케이션 관련 SEC 추출의 주된 목적은, 자유를 이리저리 세포질 물질의 비어있는 캡슐을 제조한다잠재적 인 알레르겐 단백질이 M 및 형태 학적 손상. 2,37을 그러나, 산업 제조의 관점에서, 그러한 에너지 효율, 제조 시간, 안전 및 얻어진 폐기물 추가적인 경제적, 환경 적 요인을 고려하는 것도 중요하다. 에너지 효율에 관해서, 높은 온도와 긴 처리 시간을 모두 생산 비용뿐만 아니라 환경에 미치는 영향을 미칩니다. 생산 기간 및 소요 시간 처리 수익성을 좌우하는 중요한 요소이다. 특히 관심 고온 인산 처리 안전 문제를 증가시키고, 일괄 처리 시간에서 상당한 인프라 정비의 증가 지연에 이르게 부식성 스케일링 될 것으로 알려져 있다는 것이다. 38-40 가능한 경우 발생할 수 필요한 단계의 수를 최소화 크게 생성 된 폐기물을 감소시킨다. 그러나, 일반적으로 L.의 4 단계 프로세스를 사용 속 clavatum SEC 추출은 단순히 EV가연구의 수십 년에서 olved 거의 실제 프로세스 최적화를했다. 최근 Mundargi는 등. (41)은 체계적으로 평가하고 가장 일반적으로보고 된 SEC 추출 기술 중 하나를 최적화함으로써이 분야에서 진행중인 작업에 상당한 기여를했다. 본 연구의 제 1 섹션에서 : 포자 탈지 6 시간 동안 50 ℃에서 아세톤 처리를 이용하여 설명된다; sporoplasm 및 intine 제거 절차는 30 시간 동안 70 ° C에서 85 % 인산 처리를 이용하여 증명된다; 물, 용매, 산 및 염기와 광범위한 세정 잔류 sporoplasmic 콘텐츠의 제거를 입증하기 위해 사용된다; 삼성 전자의 건조는 대류 건조 및 진공 오븐 건조를 이용하여 설명된다. 세 번째 섹션에서 삼성 진공 로딩이 모델 단백질의 진공로드를 이용하여 증명하고, 다음에 소 혈청 알부민 (BSA), 세척 및 동결 건조를 BSA는 --SEC를로드. 네 번째 섹션에서 determinBSA에 캡슐화 효율 ATION는 초음파 프로브를 원심 분리를 이용하고, UV / 비스 분석법 설명된다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Lycopodium clavatum&lt;/em&gt; spores (s-type)</td><td>Sigma</td><td>19108-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated BSA</td><td>Sigma</td><td>A9771-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid (85% w/v)</td><td>Sigma</td><td>438081-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma</td><td>V800202&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881-1KG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>V800022</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>AcME&amp;nbsp;</td><td>C000356</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Millipore purified water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres (50 &amp;plusmn; 1 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific (CA, USA)</td><td>4250A</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;nbsp;</td><td>Vector labs (CA, USA)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 &amp;mu;m, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide</td><td>Ibidi GmbH (Munich, Germany)</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Lycopodium SECs (L-type)</td><td>Polysciences, Inc. (PA, USA)</td><td>16867-1</td><td></td></tr><tr><td>Heating plates</td><td>IKA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Jeol, Japan</td><td>&amp;nbsp;JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Elemental analyzer&amp;nbsp;</td><td>Elementar, Germany</td><td>VarioEL III</td><td></td></tr><tr><td>FlowCam: The benchtop system</td><td>Fluid Imaging Technologies, USA</td><td>FlowCamVS</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Labconco, USA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrometer</td><td>Boeco, Germany</td><td>S220</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of plant-based capsules for microencapsulation applications

식물 기반 포자 또는 꽃가루에서 파생 된 마이크로 캡슐은 마이크로 캡슐화 응용 프로그램의 다양한 범위에 대한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 내부 sporoplasmic 내용을 제거하기 위해 포자 또는 꽃가루가 처리 될 때 Sporopollenin의 exine 캡슐 (SEC 초)을 얻을 수있다. 얻어진 중공의 마이크로 캡슐이 균일 micromeritic 고도를 나타내고, 특히 식물 종에 관련된 복잡한 미세 기능을 유지한다. 여기서, 우리는 석송의 포자에서 SEC 초 생산을 위해 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스를 보여줍니다. 현재 SEC 분리 과정은 최근 크게 종래 SEC 분리에 사용되는 프로세싱 요구를 감소하고, 본래 마이크로 캡슐의 제조를 위해 최적화되어있다. 자연 L. 속 clavatum 포자 인산으로 처리하여, 아세톤으로 탈지 광범위 sporoplasmi를 제거하는 세척C 내용. 아세톤으로 탈지 후, 85 % 인산을 사용하여 단일 공정 단계 sporoplasmic 모든 내용을 제거하는 것으로 나타났다. 30 시간에 산 처리 시간을 제한함으로써, 깨끗한 SEC 초를 분리 및 장기간의 처리 시간이 발생하는 것으로 나타났다 SEC의 파쇄를 방지 할 수있다. 물 광범위한 세척, 산을 희석 기지를 희석 용매 모든 sporoplasmic 물질 및 화학 잔류 물이 적절하게 제거되었는지 확인합니다. 진공로드 기법 대표적인 친수성 화합물로서 모델 단백질 (소 혈청 알부민)을로드하는 데에 이용된다. 진공로드들은 다른 마이크로 캡슐화 프로토콜에서 요구되는 가혹한 용매 또는 바람직하지 않은 화학 물질 없이도 다양한 화합물을로드하는 간단한 기술을 제공한다. 이러한 분리 및로드 프로토콜을 기반으로 초 남음 마이크로 캡슐화와 같은 응용 프로그램, 치료제, 식품, 화장품의 다양한 범위에서 사용하기에 유망한 재료 및 퍼스널 케어 자극을 제공ucts을.

Sporopollenin Exine 캡슐에 대한 간소화 된 추출 과정 L. 속 clavatum SEC 추출은 세 가지 주요 단계에 의해 달성되었다 : (1) 아세톤을 사용하여 탈지; (2) 분해법은 인산에게 85 %를 사용 (v / v)의; (3) 광범위한 SEC 세척 용제를 사용. 유선형 SEC 추출 처리의 흐름은도 1 (A)에 제시된다 -. I 간단히, 처리는 50 ° C에서 6 시간 동안 아세톤 환류와 탈지하는 단계를 포함하고, 탈지 포자는 잔류 제거 퓸 후드에서 밤새 건조시켜 아세톤. 탈지 포자를 30 시간 동안 인산을 사용하는 분해법 하였다. 분해법 동안 sporoplasmic 재료의 대부분이 용해 된 후 진공 여과 단계 동안 제거 하였다. 산 용매를 사용하여 잔류 sporoplasmic 재료를 세척 단계의 광범위한 일련 제거하기 위해서베이스, 물을 수행한다. 초 남음 처음 24 시간 동안 건조시키고, RT에서 10 시간, 잔류 용매 및 수분을 제거하기 위해 추가로 60 ° C 1 밀리바의 진공에서 건조 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 모든 SEC 추출 단계가 위험 통지 흄 후드에서 수행 하였다. SEC 추출하는 동안 약 70 %의 질량 손실은 sporoplasmic 물질의 제거로 인해 관찰하고 데이터는 깨끗하고 손상 SEC 초 생산 기존의보고와 일치한다.도 7 19,20,29 유선형 과정 초기 탈지 공정에서 최종 제품에 약 5 일 만에 완료되고 프로세스가 쉽게 적절한 안전 제어와 1kg 실험실 규모의 배치까지 확장 할 수 있습니다. 때문에 involvin하지 않고있는 간단한 단계에 M, 이러한 유리하다 - SEC 초를 이용하여 캡슐화 단계는 그림 1 J에 제시g 거친, 유기 용매 또는 기계적 전단력을 요구. 7 우리 밀봉 실험은 150 mg의 SEC 초 및 SEC 초 흡수하여 충분한 로딩 용액 량을 포함한다. 이러한 초 후 로딩 선택된 수성 또는 유기 용매에 화합물의 용해도에 의해 제한되고,로드는로드 세 방법 중 하나에 의해 달성 될 수있다 : 수동 압축하고, 진공로드. 그러나, 진공 로딩 화합물의 상대적으로 높은 캡슐화를 제공합니다. 7, 19, 20 Sporopollenin Exine 캡슐의 물리 화학적 요소 특성 분석 도 1에 나타난 공정을 간소화하여 제조 SEC 초의 청결도를 결정하기 위해, 표면 및 단면 형태, micromeritic 속성, 원소 조성은 SEC 추출 과정의 다른 단계에서 조사 하였다. 도시 된 바와 같이도 2는 SEM 이미지는 고유 한 미세 구조로 그대로 포자를 나타내고, 처리 전에 마이크론 스케일 sporoplasmic 소기관의 단면 이미지에서 관찰되었다. 포자 탈지 및 알칼리 처리로 어떤 형태 학적 및 구조적 변화는 sporoplasmic 세포 기관의 파열에서 떨어져 관찰되지 않았다. 도 3은 5 시간 내지 30 시간까지 다양한 시점에서의 인산을 사용하는 분해법 SEC 초 이후의 SEM 이미지를 나타낸다. 최대 30 시간 동안 분해법 이러한 결과 지원 sporoplasmic 물질없는 그대로 깨끗한 SEC 초를 제공합니다. 잔류 단백질 물질을 확인하기 위해, CHN 원소 분석 (29)을 수행하고, 데이터는 이들 결과는 깨끗하고 손상 SEC 초를 달성하는 최적의 처리 조건을 선택하기위한 지침을 제공하는도 4에 제시되어있다. 탈지 및 알칼리 처리 SEC 초의 경우, 실질적인 단백질 없다물질 제거가 관찰된다. 분해법은 인산을 사용하여 단, 단백질 성 물질의 대부분은 30 시간에 제거하고, 더 이상의 감소는 120 시간에 처리 시간을 증가 관찰되지 않는다. 원소 데이터는 SEC 초 7,11의 연장 처리에 상업 SEC 초에 이전 보고서와 일치한다. Micromeritic 특성 동화상 입자 분석 (DIPA)로 분석하고, 결과가 31.0 ± 2.2 ㎛의 크기는,이 결과는 최대 30 시간 동안 분해법 후 SEC 초의 균일 한 크기 분포를 지원도 5에 제시되어있다. 반면, 삼성 구조적 무결성 장시간 분해법으로 감소하고 30 시간 처리 기간을 넘어 SEC 초 상당한 분열을 야기하기 시작합니다. 그림 6은 분해법 프로로 제작 SEC 초에 대한 SEM 및 DIPA 데이터를 보여줍니다30 시간 동안 인산을 사용 cessing. 이러한 결과는 탈지 단계 이후에, 32.5 ± 2.7 ㎛의 균일 한 크기 분포와 깨끗하고 그대로 SEC 초를 생산 분해법 확인합니다. 분해법 전용 초 남음 상기 이전 보고서 바와 같이 알칼리 분해법에 의해 제조 처리 SEC 초에 필적 %의 질소 함량을 결정 대하여, 11 0.15 ± 0.0 %의 잔류 단백질 함량을 갖는다. (7) Sporopollenin Exine 캡슐을 사용하여 마이크로 캡슐화 L.의 사용을 설명하기 위해, 분해법 전용 프로세스를 사용하여 제조 된 초 남음 속 clavatum, 마이크로 캡슐화 실험 모델 단백질로서 BSA를 사용하여 수행 하였다. SEC 초에 적하 7도. 150 mg의 SEC 초 및 125 ㎎ / ㎖ BSA 1.2 mL로하여 진공 로딩 기술을 사용하여 달성 CLSM 메신저를 도시 한전 분해법 전용 처리 후 및 FITC-BSA 캡슐화와 SEC 초 세. 데이터 인해 포자 캐비티 내부 sporoplasm 성분의 존재로 그 치료 SEC 초 전시자가 형광을 나타냅니다. 그러나, 분해법 전용 가공 후, 모든 sporoplasmic 내용은 빈 내부 공동의 결과로 제거됩니다. 놀랍게도, FITC-BSA의 밀봉 후 녹색 형광 SEC 초에 모델 단백질의 캡슐화를 확인은 SEC 초 내부에서 관찰된다. 19,20,41 또한, SEC 초, SEM 및 DIPA 분석을 실시 하였다 BSA로드 및 데이터가 그림 8에 표시됩니다. SEM 이미지는 BSA 로딩 후 그대로 깨끗한 microridges의 존재를 확인의 형태 학적 변화와 micromeritic 특성을 조사한다. 또한, 그다지 큰 변화는 SEC 초 BSA로 로딩 한 후 직경, 원형, 및 종횡비가 관찰되지 않았다. 이 자료는 consiste 있습니다NT SEC 초를 사용하여 약물의 캡슐에 이전 보고서와. 7, 10 캡슐화 된 BSA의 양을 정량화하는, BSA는 BSA로드 SEC 초 5 ㎎으로부터 추출하고, 그 데이터는 표 1에 제시되어있다.이 데이터는 SEC 초 그램 당 BSA 로딩 0.170 ± 0.01 g을 나타낸다. 전반적으로, SEM, DIPA, CLSM 및 분광 분석에 의해 BSA의 정량은, L.에서 BSA의 성공적인 캡슐화를 확인 속 clavatum SEC 초 삼성 전자 형태 안정성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig1.jpg" /> L. 그림 1. 간소화 추출 과정 속 clavatum Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). (A) 비 처리 포자. (B) 포자 6 시간 동안 50 ℃에서 환류 설정을 사용하여 탈지. (C) 용매를 여과 수집<html> 탈지 포자 이온. (D)을 실온에서 탈지 포자 건조. (E) 30 시간 동안 70 ° C에서 85 % (v / v) 인산을 사용하여 PTFE 플라스크 포자 분해법. (F) 산 여과 진공 여과를 사용하여 셋업. (G) SEC 물, 산, 염기의 시리즈를 사용하여 세정하고, 용매 세척 단계. (H) SEC 건조 60 ℃, 10 시간, 1 밀리바의 진공에서 진공 오븐을 사용. (I) 그대로 클린 및 (K). SEC 초와 BSA 용액을 혼합. 최종 제품으로 (J)를 SEC 초를 건조 SEC 초와 BSA 용액을 균질화. SEC 초에 BSA의 (L) 진공로드. (M) BSA-로드 SEC 초입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> 54768 / 54768fig2.jpg &quot;/&gt; L. 그림 2. 주사 전자 현미경 분석 전 산 처리의 다른 단계 동안 속 clavatum 포자. (A) sporoplasmic 세포 소기관과 생체 분자를 나타내는 처리되지 않은 포자. (B) 아세톤 처리 포자가 sporoplasmic 내용을 중단 표시합니다. (C) 및 (D) 알칼리가 sporoplasmic 내용의 제거를 보여주는 포자를 처리하고 주름 내부 셀룰로오스 intine 층. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig3.jpg" /> L. 그림 3. 주사 전자 현미경 분석 산의 다른 단계 동안 속 clavatum 포자5 ~ 30 시간으로 처리 (A - D). 각각 그대로 외부 미세 깨끗한 내부 공동을 나타내는 5, 10, 20, 30 시간 산 처리 된 포자. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig4.jpg" /> 포자 및 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). 치료의 다양한 단계 후 단백질 함량 그림 4. 단백질 함량. 표시 데이터 표준 편차 중으로 측정의 평균이다 (N = 3). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림 F. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig5.jpg" /> 포자의 그림 5. 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 및 Sporopollenin Exine 캡슐 치료의 여러 단계에서 (SEC 초) 열 (A - C)가. 각각 미리 산 처리, 산 처리, 그대로 SEC 초입니다. 플롯 SEC 직경, 원형, 종횡비, 에지 기울기를 나타내는 그래프이다. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig6.jpg" /> 그림 6. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 30 시간의 Acidoly그대로 외부 미세하고 깨끗한 내부 공동을 보여주는 동생 전용 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초). (A) SEC 초. (B) SEC 직경, 원형 및 화면 비율의 대표 그래프. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig7.jpg" /> 그림 7. 공 초점 레이저 주사 현미경 전과 치료 및 BSA 캡슐화 후 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초)의 (CLSM) 분석. 첫 번째 행은 sporoplasmic 세포 소기관 및 생체 분자의 자기 형광을 나타내는 치료 포자를 보여줍니다. 두 번째 행은 비어있는 내부 공동 30 시간의 분해법 전용 SEC 초를 나타낸다. 세 번째 행은 FITC-BSA가로드 묘사30 시간의 분해법 전용 SEC 초에. (스케일 바는 10 μm의 수 있습니다). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig8.jpg" /> 그림 8. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 BSA로드 Sporopollenin Exine 캡슐 (SEC 초)의 동적 이미징 입자 분석 (DIPA) 특성. BSA-SEC 초로드의 (A) SEM 이미지. (B) BSA로드 SEC 직경, 원형, 종횡비, 에지 기울기의 대표 그래프. (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <tablefo를하기 : 유지-together.within 페이지를 = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> 자료 </td><td> 배치 당 BSA 로딩 (125 ㎎ / ㎖) </td><td> 5 mg을 초 후 BSA (mg)을 </td><td> BSA의 양로드 (SEC 초 g 당 g) </td></tr><tr><td> 처리되지 않은 포자 </td><td> 0.6 ml의 </td><td> 0.654 ± 0.05 </td><td> 0.131 ± 0.01 </td></tr><tr><td> SEC 초 </td><td> 1.2 ml의 </td><td> 0.831 ± 0.05 </td><td> 0.170 ± 0.01 </td></tr></tbody></table> 처리되지 않은 포자와 SEC 초에 소 혈청 알부민 (BSA) 표 1. 캡슐화. BSA 용액의 부피는 &#39;치료 포자&#39;또는 &#39;SEC 초&#39;의 150 mg을 배치 당 로딩에 사용됩니다. 표시 데이터 표준 편차 세중 배치의 평균 (N = 3). (41)에서 적응 및 과학 보고서의 허가와 함께 사용.

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Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

이 프로토콜 / 원고는 석송의 포자에서 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 생산을위한 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스에 대해 설명합니다.

마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

extraction-of-plant-based-capsules-for-microencapsulation-applications

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K 조회수.  Nanyang Technological University.  이 프로토콜 / 원고는 석송의 포자에서 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 생산을위한 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스에 대해 설명합니다. 

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

연구

생화학

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

발생학

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

생체공학

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Bacterial Cellulose Spheres that Encapsulate Solid Materials

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an affordable and simple method for BC sphere production. In addition to producing these spheres, an encapsulation method for solid particles has also been identified. To produce BC spheres, water, black tea, sugar, vinegar, and bacterial culture are combined in a baffled flask and the contents are agitated. After determining the proper culture conditions for BC sphere formation, their ability to encapsulate solid particles was tested using biochar, polymer beads, and mine waste. Spheres were characterized using ImageJ software and thermal gravimetric analysis (TGA). Results indicate that spheres with 7.5 mm diameters can be made in 7 days. Adding various particles increases the average size range of the BC capsules. The spheres encapsulated 10 - 20% of their dry mass. This method shows low-cost sphere production and encapsulation that is possible with easily obtainable materials. BC spheres may be used in the future as a contaminant removal aid, controlled release fertilizer coating, or soil amendment.

This protocol presents an easy, inexpensive method of forming bacterial cellulose (BC) spheres. This biomaterial can function as an encapsulation medium for solid materials, including biochar, polymer spheres, and mine waste.

고체 물질을 캡슐화하는 세균성 셀룰로오스 구체

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an ...

공학

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

의학

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

화학

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

생리 활성 친수성 구형 단백질의 함정에 대한 나노 리포좀의 준비 및 특성화

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and scalability. In this paper, we describe a strategy for the robust and reproducible formation of hPSC spheroids where a co-axial flow focusing device is utilized to entrap hPSCs inside core-shell microcapsules. The core solution contained single cell suspension of hPSCs and was made viscous by the incorporation of high molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) and density gradient media. The shell stream comprised of PEG-4 arm-maleimide or PEG-4-Mal and flowed alongside the core stream toward two consecutive oil junctions. Droplet formation occurred at the first oil junction with shell solution wrapping itself around the core. Chemical crosslinking of the shell occurred at the second oil junction by introducing a di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol or DTT) to these droplets. The crosslinker reacts with maleimide functional groups via click chemistry, resulting in the formation of a hydrogel shell around the microcapsules. Our encapsulation technology produced 400 &#181;m diameter capsules at a rate of 10 capsules per second. The resultant capsules had a hydrogel shell and an aqueous core that allowed single cells to rapidly assemble into aggregates and form spheroids. The process of encapsulation did not adversely affect the viability of hPSCs, with &gt;95% viability observed 3 days post-encapsulation. For comparison, hPSCs encapsulated in solid gel microparticles (without an aqueous core) did not form spheroids and had &lt;50% viability 3 days after encapsulation. Spheroid formation of hPSCs inside core-shell microcapsules occurred within 48 h after encapsulation, with the spheroid diameter being a function of cell inoculation density. Overall, the microfluidic encapsulation technology described in this protocol was well-suited for hPSCs encapsulation and spheroid formation.

This article describes encapsulation of human pluripotent stem cells (hPSCs) using a co-axial flow focusing device. We demonstrate that this microfluidic encapsulation technology enables efficient formation of hPSC spheroids.