This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

1. Extraktion von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) von L. clavatum Spores Hinweis: Der Extraktionsprozess SEC beinhaltet ein entflammbares Pulver (L. clavatum), heiße ätzende Säuren und brennbare Lösungsmittel, also richtige persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel) genehmigte Risikobewertung auf Nutzung und Entsorgung Chemikalien von autorisiertem Laborpersonal ist von wesentlicher Bedeutung. <ol><li> Spore Entfettung <ol><li> Bereiten Sie eine Reflux - Set-up in einem Abzug durch einen Glaskühler, Wasserzirkulationssystem, und Wasserbad (Abbildung 1). </li><li> Man wiegt 100 g L. clavatum Sporen ohne Staubbildung und weg von jeder Zündquelle. Hinweis: Die hier verwendeten Sporen im Handel erhalten wurden (siehe Materialliste). </li><li> Transfer Sporen langsam zu einer 1 L Polytetrafluorethylen (PTFE) Rundkolben mit einem magnetischen Rührstab. </li><li> In 500 ml Aceton zu den Sporen in derPTFE-Kolben und schüttelt den Kolben sanft um eine homogene Suspension zu bilden. </li><li> Setzen Sie den PTFE-Kolben im Wasserbad Satz bei 50 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler. </li><li> Führen Sie unter Rückfluß in Aceton für 6 Stunden mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt und dann lassen bei RT abkühlen. </li><li> Filtern Sie die Suspension mit Filterpapier unter Vakuum und sammeln die entfettet Sporen in großen (15 cm Durchmesser) Petrischalen aus Glas. </li><li> Trocknen der Sporen bei Raumtemperatur (fume hood) durch Abdecken mit Aluminiumfolie mit Löchern für die Lösungsmittelverdampfung. </li></ol></li><li> Acidolyse <ol><li> Bereiten Sie 85% (v / v) Phosphorsäure mit entsalztem Wasser (DI) und übertragen entfettet trockenen Sporen in einen 1 l PTFE-Kolben. </li><li> Hinzufügen 500 ml Phosphorsäure (85% v / v) zu den entfetteten Sporen. </li><li> Setzen Sie den PTFE-Kolben in einem Wasserbad Satz bei 70 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler. </li><li> Führen leichtem Rückfluß (70 ° C) in Phosphorsäure für 30 h und dann lassenbei Raumtemperatur kühlen. </li><li> Verdünnen Sie die Suspension von 500 ml warmem DI Wasser und die SECs durch Vakuumfiltration mit Filterpapier sammeln. </li><li> Übertragen Sie die SECs in einen 3 L Becherglas eine Reihe von Waschungen durchzuführen. </li></ol></li><li> SEC Waschen <ol><li> Legen Sie die 3 L Becherglas enthält SECs in einem Abzug. </li><li> Hinzufügen 800 ml heißem (50 ° C) DI Wasser zu den SECs unter leichtem Rühren für 10 min. </li><li> Filtern Sie die Suspension durch mit Filterpapier und eine Vakuumfiltration Set-up. </li><li> Sammeln Sie die SECs in einem sauberen 3 L Becherglas. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1. bis 1.3.4. fünf Mal. </li><li> Hinzufügen 600 ml heißem (45 ° C) Aceton zu dem SECs unter leichtem Rühren für 10 min. </li><li> Sammeln Sie die SECs durch Filtration unter Vakuum und übertragen Sie die SECs auf eine saubere 3 L Becherglas. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (50 ° C) 2 M Chlorwasserstoffsäure. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml hot (50 ° C) 2 M Natriumhydroxid. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 und 1.3.4 achtmal. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (45 ° C) Aceton. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml heißem (45 ° C) Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 800 ml heißem (50 ° C) DI-Wasser. </li><li> Übertragen Sie die sauber SECs bis sechs große Petrischalen aus Glas und trocken in einem Abzug bei RT für 24 Stunden alle Wassergehalt zu entfernen. </li><li> Trocknen Sie die SECs in einem Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum 10 h oder bis zur Gewichtskonstanz. </li><li> Sammeln Sie die getrockneten SECs und Transfer in eine Polypropylenflasche. </li><li> Bewahren Sie die SECs in einem trockenen Schrank. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung von SECs <ol><li> Führen Sie rasterelektronenmikroskopische Analyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden. </li><li> Führen Elementaranalyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden. Dry alle Proben bei 60 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Elementaranalyse und Berechnung des Proteingehalts unter Verwendung Prozent Stickstoff mit einem Multiplikationsfaktor von 6,25. 11 Ergebnisse erhalten für jede Probe drei Messungen verwendet wird . </li><li> Führen Sie Micromeritic Eigenschaften Analyse ein dynamisches Bild Particle Analyzer verwendet wird . 41 </li><li> Scannen nicht verarbeiteten, verarbeitet und FITC-BSA-loaded SECs konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie. 41 </li></ol> 3. Biomakromoleküls Encapsulation von Vakuum-Loading-Technik <ol><li> Bereiten 1,2 ml 125 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung unter Verwendung von DI-Wasser und in ein 50 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> Man wiegt 150 mg SECs und Transfer zum BSA-Lösung. </li><li> Vortexen das Röhrchen für 10 min eine homogene Lösung zu bilden. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit Filterpapier. </li><li> Übertragen Sie das Rohr zu einem Gefriertrockner Kolben und trocken für 4 Stunden mit Vakuum bei 1 mbar. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1bis 3,5. für drei unabhängige Chargen. </li><li> Sammeln Sie die BSA-beladenen SECs und entfernen Sie die Agglomerate mit einem Mörser und Stößel. </li><li> Übertragen Sie die BSA-loaded SECs auf eine 50-ml-Röhrchen und 2 ml DI-Wasser, um den Rest BSA zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die SECs durch Zentrifugation bei 4704 × g für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche mit VE-Wasser einmal. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit BSA-beladenen SECs mit Filterpapier. </li><li> Übertragen Sie die SECs zu einem Gefrierschrank (-20 ° C) und einfrieren für 1 Stunde. </li><li> Frieren Sie trocknen die SECs für 24 Stunden und Speicher in einem Gefrierschrank bis zur weiteren Charakterisierung. </li><li> Bereiten Sie die Placebo SECs ohne BSA dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 3.1 verwenden. bis 3.13. </li><li> Bereiten Sie die FITC-BSA loaded SECs 3.1 das gleiche Verfahren wie in Schritten. bis 3.13. </li></ol> 4. Bestimmung der Umhüllungs-Effektivität <ol><li> Wiegen 5 mg BSA-loaded SECs in 2 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> In 1,4 ml Phosphate gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und Vortex für 5 min. </li><li> Sonde beschallen die Suspension bei 40% Amplitude für 3 Zyklen von 10 sec. </li><li> Filtern Sie die Lösung mit einem 0,45 um-Polyethersulfon (PES) Filter. </li><li> Führen die gleiche Prozedur wie in den Schritten 4.1. bis 4.4. mit Placebo SECs. </li><li> Messen Sie die Absorption bei 280 nm mit Placebo als Rohling. </li><li> Quantifizierung der Menge an BSA verkapselt eine BSA - Standardkurve unter Verwendung von (200 bis 1.000 &amp; mgr; g / ml) in PBS. 42 </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit wird eine systematische Analyse der SEC - Extraktion aus L. clavatum Sporen präsentiert und dieser Bericht zeigt , dass es möglich ist , eine höhere Qualität Kapseln zu produzieren , während auch eine deutliche Straffung der vorbestehenden häufigsten verwendete Protokoll zu erreichen. 11 Im Gegensatz zu dem bestehenden Protokoll eine hohe Prozesstemperatur erforderlich ist (180 ° C) und eine lange Prozessdauer (7 Tage), 11 die aktuelle Optimierungs wurde SEC - Extraktionsverarbeitung in erster Linie auf die Verringerung der Temperatur und die Dauer der Acidolyse Schritt konzentriert. Die Entfettung und Alkalibehandlungen bieten minimale Entfernung von sporoplasmic Material von Sporen. Allerdings Acidolyse von 5 h bis 120 h die maximale Menge des sporoplasmic Material entfernt. Die Ergebnisse zeigten , dass die Gesamtbearbeitungsdauer und Temperaturen könnten drastisch von herkömmlichen Techniken reduziert werden, 11 und , dass nur 30 Stunden in mäßiger Temperatur (70° C) zur Verfügung gestellt Phosphorsäure die optimale Qualität Kapseln. Auch über 30 h Acidolyse, wurde gefunden, daß die SECs begann zu brechen und eine signifikante Erhöhung der Partikelfragmente beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die gesamte Charge von SECs kann eine Verringerung der gesamten strukturellen Integrität ausstellen. Außerdem sollte beachtet werden , daß L. clavatum wird als vergleichsweise robust Sporopollenin umfassen, 2 und daß die spezifischen Verfahrensbedingungen in diesem Protokoll beteiligt sind , wie Säurekonzentration, der Temperatur und / oder Hydrolyse Dauer benötigen kann für andere Arten Pollen angepasst werden. Es wurde , dass die Produktion von SECs gezeigt durch Acidolyse-nur unter Verwendung von Phosphorsäure (85% v / v) für 30 h Ausbeuten sauber und intakt SECs. 41 Die Daten bestätigen , dass Acidolyse der entscheidende Schritt in SEC - Produktion ist. Schließlich wurden die säure nur SECs zur Verkapselung von BSA und ein hoher Beladungsgrad verwendet wurde beobachtet. Die Beladung wwie bei der Anwendung eines Vakuums erreicht, wobei der Innendruck SEC Hohlraums verändert wird, um zwangsweise die BSA-Lösung in die leeren Kapseln zeichnen. Nanokanäle (dia . 15 - 20 nm), die in den Wänden der exine L. zuvor identifiziert wurden , clavatum, 7 lassen Sie die Lösung in den großen inneren Hohlraum zu gelangen. Nach dem Beladen wurden die Kapseln gewaschen und in einem Gefriertrockner getrocknet, um ein freifließendes Pulver zu ergeben. Größeneinheitlichkeit und morphologischen Eigenschaften sind wichtige Faktoren für die Beurteilung der Qualität eines erfolgreichen Verkapselungsmaterial. Die beobachtete einheitliche Größe und intakte Morphologie von BSA belasteten SECs bestätigt das Potenzial Nutzung von Acidolyse-only verarbeitet SECs für Mikroverkapselung Anwendungen. Diese Ergebnisse sind wichtig für die großtechnische Produktion von SECs und zum Stimulieren größeres Interesse an der möglichen Anwendungen der SECs in die Mikroverkapselung von Arzneistoffen,Proteine, Peptide, Nahrungsergänzungsmittel, Nutraceuticals und Kosmetik.

Es gibt großes Interesse an natürlichen Pflanzenbasis Kapseln aus Pflanzensporen und Pollen für die Verwendung in der Mikroverkapselung Anwendungen erhalten. 1-15 In der Natur, Sporen und Pollen Schutz für empfindliche genetische Materialien gegen raue Umgebungsbedingungen. Die Grundstruktur der Pflanzensporen und Pollen umfasst typischerweise eine äußere Hüllschicht (exine), eine innere Mantelschicht (intine) und die interne zytoplasmatische Material. Die exine besteht aus einem chemisch robust Biopolymer 1,9,10,13,16 bezeichnet als Sporopollenin und die intine besteht hauptsächlich aus cellulosischen Materialien besteht. 16-18 leeren Kapseln kann nach verschiedenen Verfahren zur Entfernung von 7,9 cytoplasmatische Material isoliert werden , Proteine und die intine Schicht. 2,12,16 Diese Sporopollenin exine Kapseln (SECs) eine überzeugende Alternative zu synthetischen Vergussmassen bieten aufgrund ihrer engen Größenverteilung und eine einheitliche Morphologie. 7,9,13,19,20 dieEntwicklung von standardisierten Prozessen SECs aus verschiedenen Pflanzenarten, wie Lycopodium clavatum zu erhalten, öffnet sich das Potential für eine breite Palette von Mikroverkapselung Anwendungen auf den Gebieten der Arzneimittelabgabe, Nahrungsmittel und Kosmetika. 6,10-13,21 Um SECs zu erhalten, zytoplasmatische Inhalte zu entfernen , Sporen und Pollen mit organischen Lösungsmitteln und unter Rückfluß erhitzt in alkalischen Lösungen behandelt Forscher zuerst. 22-25 jedoch wurde die verbleibende Kapselstruktur des Cellulose intine Schicht enthalten noch bestimmt. Um diese zu entfernen, erkundeten die Forscher die Verwendung von längeren saure Hydrolyse Verarbeitung Salzsäure, heißer Schwefelsäure oder heiße Phosphorsäure über mehrere Tage mit, 22-25 mit Phosphorsäure die bevorzugte Methode der SEC intine Entfernung zu werden. 2 jedoch laufend Forschung in den letzten Jahren hat gezeigt, dass verschiedene Sporen und Pollen haben unterschiedliche Grade der Widerstandsfähigkeit gegenüber der harten Verarbeitung michthoden verwendet. 26,27 Einige Sporen und Pollen vollständig abgebaut sind und alle strukturelle Integrität in stark alkalischen Lösungen zu verlieren, oder stark in stark sauren Lösungen beschädigt werden. 16 Die Variabilität in SEC als Reaktion auf die Behandlungsbedingungen ist aufgrund subtile Variationen in der chemischen Struktur und Morphologie des exine Sporopollenin exine Material zwischen den Arten. 28 Aufgrund der Variabilität in der Robustheit Sporopollenin exine Kapseln (Sekunden), ist es notwendig , die Verarbeitungsbedingungen für die einzelnen Arten von sporen und Pollen zu optimieren. Pflanzensporen aus der Spezies L. clavatum haben die am häufigsten untersuchten einzelne Quelle von SECs werden. Es wird vorgeschlagen , dass dies in erster Linie wegen seiner breiten Verfügbarkeit ist, niedrige Kosten, Monodispersität und chemische Robustheit 9,29 Die Sporen leicht geerntet werden können und enthalten sporoplasmic Inhalte in Form von Gruppen von 1 -. 2 um Zellorganellen und biomolecules. 11 L. clavatum Sporen wurden als natürliches Pulverschmiermittel, 30,31 Basis für Kosmetika, 30 und in der Kräutermedizin 32-36 für eine breite Palette von therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Die SECs von L. erhalten clavatum wurden zur Verkapselung gezeigt werden , widerstandsfähiger Verarbeitung als SECs aus anderen Arten von Sporen und Pollen. 2 Nach der Bearbeitung wurden die resultierenden SECs worden ihre komplizierten microridge Strukturen und hohe morphologische Homogenität gezeigt zu halten , während eine große innere Hohlraum bereitstellt. 7 Studien zeigen , dass L. clavatum SECs kann zur Verkapselung von Arzneimitteln, Impfstoffen 10,13, 11 - Proteine, 7,14 Zellen, 8 Öle, 5-7,9 und Nahrungsergänzungsmittel. 5,15 Beobachteter SEC Ladewirkungsgrade sind relativ hoch im Vergleich zu herkömmlichen verwendet werden , Verkapselungsmaterialien. 7 Es gibt auch eine Reihe von Vorteilen berichtetDas am häufigsten verwendete SEC Extraktionsverfahren für L. SEC Einkapselung wie die Fähigkeit , Geschmack zu maskieren, 6,10 und einen gewissen Grad an natürlicher Schutz gegen Oxidation zu sorgen. 12 in den vorliegenden Studien, clavatum basiert auf vier Hauptschritte. Schritt eins ist Lösungsmittel Rückflußkochen in Aceton bis zu 12 Stunden bei 50 ° C , um die Sporen zu entfetten. 11 Schritt zwei alkalisch Rückfluß in 6% Kaliumhydroxid für bis zu 12 h bei 120 ° C zytoplasmatischen und proteinöse Materialien zu entfernen. 11 Stufe drei ist Säure Rückfluss in 85% iger Phosphorsäure für bis zu 7 Tage bei 180 ° C , um die Cellulose - intine Material zu entfernen. 11 Schritt vier ist ein umfassendes Waschvorgang Wasser, Lösungsmittel, Säuren und Basen alle verbleibenden nicht exine Material zu entfernen und chemische Rückstände. Die Hauptziele der SEC-Extraktion in Bezug auf Verkapselungsanwendungen sind Kapseln zu produzieren, die leeren zytoplasmatischer Material, frei from potenziell allergene Proteine und morphologisch intakt. 2,37 jedoch von einem industriellen Fertigungs Sicht ist es auch wichtig ist , weitere wirtschaftliche und ökologische Faktoren wie Energieeffizienz, Produktionsdauer, Sicherheit, und die daraus resultierenden Abfall zu betrachten. Im Hinblick auf die Energieeffizienz, sowohl bei hohen Temperaturen und lange Bearbeitungszeiten beeinflussen die Produktionskosten sowie Umweltbelastung. Produktionsdauer und Laufzeit sind wichtige Faktoren, die die Verarbeitung der Rentabilität. Besonders besorgniserregend ist , dass Hochtemperatur - Sicherheitsfragen Phosphorsäure Verarbeitung erhöht und wird in korrosiven Skalierung führen bekannt , die in die Instandhaltung der Infrastruktur und Verzögerungen bei der Batch - Laufzeiten zu einem signifikanten Anstieg führt. 38-40 Wo es möglich ist , die Minimierung der Anzahl der erforderlichen Schritte führen kann deutlich den produzierten Abfall zu reduzieren. Jedoch verwendet das allgemein vierstufigen Prozess von L. clavatum SEC Extraktion hat einfach evolved aus Jahrzehnten der Forschung und hat wenig tatsächlichen Prozessoptimierung hatte. Vor kurzem Mundargi et al., Machte 41 einen wesentlichen Beitrag zu den laufenden Arbeiten in diesem Bereich durch die systematische Auswertung und eines der am häufigsten berichteten SEC Extraktionstechniken zu optimieren. Im ersten Abschnitt dieser Studie: Sporen Entfettung wird 6 h bei 50 ° C unter Verwendung von Aceton-Verarbeitung gezeigt; sporoplasm und intine Abschiebungsverfahren demonstriert für 30 Stunden bei 70 ° C 85% ige Phosphorsäure Verarbeitung verwendet wird; ausgiebiges Waschen mit Wasser, Lösemittel, Säure und Base wird verwendet, um die Entfernung von restlichem sporoplasmic Inhalte zu zeigen; und SEC Trocknung wird gezeigt, unter Verwendung von Konvektion Trocknen und Vakuumofentrocknung. Im dritten Abschnitt wird SEC Vakuumlade Vakuum Laden eines Modellproteins demonstrierte Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), gefolgt von BSA-geladen-SEC Waschen und Lyophilisieren. Im vierten Abschnitt wird die determination des Wirkungsgrades BSA Verkapselung Zentrifugation demonstrierte Verwendung Sondenbeschallung und UV / Vis-Spektrometrie.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Lycopodium clavatum&lt;/em&gt; spores (s-type)</td><td>Sigma</td><td>19108-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated BSA</td><td>Sigma</td><td>A9771-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid (85% w/v)</td><td>Sigma</td><td>438081-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma</td><td>V800202&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881-1KG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>V800022</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>AcME&amp;nbsp;</td><td>C000356</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Millipore purified water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres (50 &amp;plusmn; 1 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific (CA, USA)</td><td>4250A</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&amp;nbsp;</td><td>Vector labs (CA, USA)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 &amp;mu;m, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide</td><td>Ibidi GmbH (Munich, Germany)</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Lycopodium SECs (L-type)</td><td>Polysciences, Inc. (PA, USA)</td><td>16867-1</td><td></td></tr><tr><td>Heating plates</td><td>IKA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscope</td><td>Jeol, Japan</td><td>&amp;nbsp;JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Elemental analyzer&amp;nbsp;</td><td>Elementar, Germany</td><td>VarioEL III</td><td></td></tr><tr><td>FlowCam: The benchtop system</td><td>Fluid Imaging Technologies, USA</td><td>FlowCamVS</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Labconco, USA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Spectrometer</td><td>Boeco, Germany</td><td>S220</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of plant-based capsules for microencapsulation applications

Mikrokapseln, die aus pflanzlicher Basis Sporen oder Pollen bieten eine robuste Plattform für ein breites Spektrum von Mikroverkapselung Anwendungen. Sporopollenin exine Kapseln (SECs) erhält, wenn Sporen und Pollen verarbeitet werden, um die interne sporoplasmic Inhalte zu entfernen. Die resultierenden hohlen Mikrokapseln mit einem hohen Grad an Micromeritic Einheitlichkeit aufweisen und komplizierte mikrostrukturellen Eigenschaften auf die besonderen Pflanzenarten im Zusammenhang behalten. Hier zeigen wir einen optimierten Prozess für die Herstellung von SECs von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. Die aktuelle SEC Isolierungsverfahren wurde in SEC Isolations kürzlich optimiert, um signifikant die Verarbeitungsanforderungen zu reduzieren, die konventionell verwendet werden, und die Produktion von intakten Mikrokapseln zu gewährleisten. Natürliche L. clavatum Sporen werden mit Aceton entfettet, mit Phosphorsäure behandelt und extensiv sporoplasmi zu entfernen gewaschenc Inhalt. Nach Aceton Entfettung, alle sporoplasmic einen einzigen Schritt Verarbeitung 85% unter Verwendung von Phosphorsäure gezeigt Inhalte zu entfernen ist. Durch die Begrenzung der Säurebearbeitungszeit auf 30 Stunden, ist es möglich, saubere SECs zu isolieren und SEC Fracturing vermeiden, die gezeigt worden ist, mit einer verlängerten Verarbeitungszeit auftreten. Ausgiebiges Waschen mit Wasser, verdünnte Säuren, verdünnte Basen und Lösungsmittel sichergestellt, dass alle sporoplasmic Material und chemische Rückstände ausreichend entfernt werden. Die Vakuumbeladungstechnik wird verwendet, um ein Modellprotein (Rinderserumalbumin) als repräsentative hydrophile Verbindung zu laden. Vakuumbelastung stellt eine einfache Technik verschiedene Verbindungen ohne die Notwendigkeit einer scharfen Lösungsmittel oder unerwünschte Chemikalien zu laden, die oft in anderen Mikroverkapselung Protokolle erforderlich sind. Auf der Grundlage dieser Isolation und Belastungsprotokollen bieten SECs ein vielversprechendes Material für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Mikroverkapselung-Anwendungen, wie Therapeutika, Lebensmittel, Kosmetika und Körperpflege proddukten.

Schlanke Extraktionsverfahren für Sporopollenin Exine Kapseln Die L. clavatum SEC Extraktion wurde durch drei Hauptschritte erzielt: (1) Entfettung mit Aceton; (2) Acidolyse mit Phosphorsäure 85% (v / v); und (3) Umfangreiche SEC Waschen unter Verwendung von Lösungsmitteln. Die Strömung des rationalisierte SEC Extraktionsprozess in Abbildung 1 A dargestellt wird . - Ich Kurz gesagt beinhaltet das Verfahren einen Entfettungsschritt mit Aceton unter Rückfluß für 6 Stunden bei 50 ° C und die entfettet Sporen wurden dann über Nacht in einem Abzug getrocknet Rest zu entfernen Aceton. unter Verwendung von Phosphorsäure für 30 h Die entfettet Sporen wurden Acidolyse unterworfen. Während Acidolyse die Mehrzahl der sporoplasmic Materialien werden gelöst und dann während des Vakuumfiltrationsschritt entfernt. Um Rest sporoplasmic Materialien eine umfangreiche Reihe von Waschschritten unter Verwendung von Lösungsmitteln zu entfernen, Säure, Base und Wasser durchgeführt wird. Die SECs wurden zunächst für 24 h bei RT getrocknet und weiter bei 60 ° C getrocknet und 1 mbar Vakuum 10 h Restlösemittel und Feuchtigkeit zu entfernen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, alle Extraktion SEC Schritte wurden in einem Abzug mit einer Gefahr Ankündigung durchgeführt. Während SEC Extraktion wird ca. 70% Masseverlust beobachtet aufgrund der Entfernung von sporoplasmic Materialien und unsere Daten steht im Einklang mit bestehenden Berichten der Produktion von sauberen und intakten SECs. 7, 19,20,29 Die optimierten Prozess von der anfänglichen Entfettung Schritt bis zum Endprodukt wird in etwa 5 Tage und das Verfahren mit den entsprechenden Sicherheitskontrollen können einfach skaliert bis zu 1 kg Labormaßstab Charge abgeschlossen. Encapsulation Schritte SECs präsentiert in Abbildung 1 J Verwendung - M, das sind vorteilhaft , da auf einfachen Schritten ohne involving harte organische Lösungsmittel oder mechanische Scherkräfte erfordern. 7 Unsere Verkapselung Experimente beinhalten 150 mg SECs und eine Beladung ausreichend Lösungsvolumen durch die SECs für die Aufnahme. Die Beladung in diesen SECs wird durch Verbindung Löslichkeit in ausgewählten wässrigen oder organischen Lösungsmitteln beschränkt und Belastung kann durch eine der drei Lade Methoden erreicht werden: passive, Kompressions- und Vakuumbelastung. Jedoch stellt Vakuumbelastung relativ höhere Verkapselung von Verbindungen. 7, 19,20 Die physikalisch - chemischen Charakterisierungen von Sporopollenin Exine Kapseln Um die Sauberkeit der SECs erzeugt bestimmen , indem die optimierten Prozess in Abbildung 1 dargestellt verwendet, die Oberfläche und Querschnittsmorphologie, Micromeritic Eigenschaften und elementare Zusammensetzung wurden in den verschiedenen Phasen des SEC - Extraktionsverfahren untersucht. Wie gezeigt inFigur 2 zeigen die REM - Aufnahmen intakten Sporen mit einer einzigartigen Mikrostruktur, und vor der Verarbeitung im Mikrometermaßstab sporoplasmic Organellen wurden in dem Querschnittsbild beobachtet. Mit Spore Entfettung und Alkalibehandlung keine morphologischen und strukturellen Veränderungen wurden neben dem Aufreißen der sporoplasmic Organellen beobachtet. Figur 3 zeigt REM - Aufnahmen von SECs nach Acidolyse Phosphorsäure zu verschiedenen Zeitpunkten von 5 h bis 30 h unter Verwendung. Diese Ergebnisse unterstützen, die für bis zu 30 Stunden Acidolyse bietet intakt und sauber SECs ohne sporoplasmic Materialien. Um 29 Restproteinhaltiges Material, CHN - Elementaranalyse zur Bestätigung wurde durchgeführt , und die Daten werden in Abbildung 4 Diese Ergebnisse liefern einen Leitfaden für die Auswahl der besten Verarbeitungsbedingungen zu erreichen , sauber und intakt SECs präsentiert. Im Fall von entfetteten und Alkali behandelt SECs keine wesentliche proteinischenMaterialabtrag beobachtet. Jedoch mit Acidolyse unter Verwendung von Phosphorsäure, die Mehrzahl von proteinhaltigen Materialien wird in 30 Stunden entfernt, und keine weitere Reduktion wird mit zunehmender Prozesszeit bis zu 120 Stunden beobachtet. Die elementare Daten mit früheren Berichten über erweiterte Verarbeitung von SECs 7,11 und mit kommerziellen SECs konsistent. Micromeritic Eigenschaften wurden durch dynamische Bildpartikelanalyse (DIPA) analysiert und die Ergebnisse sind in Abbildung 5 Diese Ergebnisse unterstützen die einheitliche Größenverteilung von SECs nach Acidolyse präsentiert für bis zu 30 Stunden, mit einer Größe von 31,0 ± 2,2 &amp; mgr; m. Im Gegensatz dazu nimmt strukturelle Integrität SEC mit längerer Acidolyse und beginnt deutliche Fragmentierung der SECs über 30 Stunden Behandlungsdauer zu verursachen. Abbildung 6 zeigt die SEM und DIPA Daten für SECs hergestellt mit nur Acidolyse Proarbeitung für 30 Stunden unter Verwendung von Phosphorsäure. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nach dem Entfettungsschritt, Acidolyse produziert saubere und intakte SECs mit einer einheitlichen Größenverteilung von 32,5 ± 2,7 &amp; mgr; m. Acidolyse-only SECs haben eine Restproteingehalt von nur 0,15 ± 0,0%, bestimmt in Bezug auf% Stickstoffgehalt, 11 , die mit SECs vergleichbar ist , hergestellt durch Alkali und Acidolyse Behandlung wie oben und mit früheren Berichten beschrieben hat . 7 Die Mikroverkapselung mit Sporopollenin Exine Kapseln Um die Verwendung von L. nachweisen clavatum SECs mit dem Acidolyse-only - Verfahren hergestellt, Mikroverkapselung Experimente wurden unter Verwendung von BSA als Modellprotein durchgeführt. Die Beladung in SECs wurde unter Verwendung einer Vakuumbeladungstechnik unter Verwendung von 150 mg SECs und 1,2 ml 125 mg / ml BSA erreicht. Figur 7 zeigt die CLSM imAlter SECs vor und nach der Acidolyse-only-Verarbeitung und mit FITC-BSA-Kapselung. Die Daten zeigen, dass unbehandelte SECs weisen Autofluoreszenz aufgrund des Vorhandenseins von sporoplasm Bestandteile innerhalb der Spore Höhle. Doch nach Acidolyse-only-Verarbeitung, alle sporoplasmic Inhalte ergeben sich in einem leeren inneren Hohlraum entfernt. Es fällt auf , nach der Einkapselung von FITC-BSA wird grüne Fluoreszenz im Inneren des SECs beobachtet, in SECs die Einkapselung des Modellproteins bestätigt. 19,20,41 Ferner wurden durchgeführt , um die morphologischen Veränderungen und Micromeritic Eigenschaften von BSA belasteten SECs, SEM und DIPA - Analyse untersucht , und die Daten in Abbildung 8 dargestellt. Die SEM - Bilder der Anwesenheit von intakten und sauber microridges nach BSA - Beladung zu bestätigen. Darüber hinaus wurden im Durchmesser, Kreisförmigkeit, und das Seitenverhältnis nach dem Laden in BSA SECs keine wesentlichen Veränderungen beobachtet. Diese Daten sind consistent mit früheren Berichten über die Verkapselung von Wirkstoffen mit SECs. 7.10 Zur Quantifizierung wurde die Menge an verkapseltem BSA, BSA 5 mg BSA-beladenen SECs extrahiert, und die Daten sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Daten zeigen , 0,170 ± 0,01 g BSA - Beladung pro Gramm SECs. Insgesamt bestätigen die REM - Aufnahme, DIPA, CLSM und Quantifizierung von BSA durch Spektralanalyse, die erfolgreiche Verkapselung von BSA in L. clavatum SECs und morphologische Stabilität SEC. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig1.jpg" /> Abbildung 1. Optimiertes Extraktionsverfahren für L. clavatum Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) unbehandelte Sporen. (B) Spore Entfettung mit einem Rückfluss Set-up bei 50 ° C für 6 Stunden. (C) Lösemittelfiltration und sammeln<html> Ionen von entfetteten Sporen. (D) Trocknen des entfetteten Sporen bei Raumtemperatur. (E) Spore Acidolyse in Kolben PTFE 85% (v / v) Phosphorsäure bei 70 ° C für 30 Stunden verwendet wird . (F) Säure Filtration unter Verwendung von Vakuumfiltration set-up. (G) SEC Waschen eine Reihe von Wasser, Säure, Base und Lösungsmittel Waschschritte. (H) SEC Trocknung Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum für 10 h. (I) intakt, sauber und SECs als Endprodukt getrocknet. (J) Mischen von SECs und BSA - Lösung. (K) Homogenisieren von SECs und BSA - Lösung. (L) Vakuum - Laden von BSA in SECs. (M) BSA-loaded SECs. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 54768 / 54768fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der Pre-Säure - Behandlung. (A) Unbehandelte Sporen zeigt sporoplasmic Zellorganellen und Biomolekülen. (B) Aceton behandelt Sporen sporoplasmic Inhalt gestört zeigt. (C) &amp; (D) Alkali behandelt Sporen Entfernung von sporoplasmic Inhalte zeigt und faltig interne cellulosischen intine Schicht. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig3.jpg" /> Abbildung 3. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der SäureBehandlung 5-30 hr (A - D). Beziehungsweise, 5, 10, 20 und 30 h Säure behandelt Sporen intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig4.jpg" /> Abbildung 4. Proteingehalt von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). Der Proteingehalt nach verschiedenen Stadien der Behandlung. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von Dreifachmessungen mit einer Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version o anzuzeigen</a>f dieser Figur. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig5.jpg" /> Abbildung 5. Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) in verschiedenen Stadien der Behandlung Spalten (A - C). Sind jeweils vorgeSäureBehandlung, Säurebehandlung, und intakte SECs. Plots sind repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig6.jpg" /> Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von 30 h Acidolysis-only Sporopollenin Exine Kapseln (Sekunden). (A) SECs intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Kreisförmigkeit und Seitenverhältnis. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig7.jpg" /> Abbildung 7. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Analyse von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) vor und nach der Behandlung und BSA Encapsulation. Die erste Reihe zeigt unbehandelten Sporen sporoplasmic zelluläre Organell und Biomolekül Autofluoreszenz zeigt. Die zweite Reihe zeigt 30 Stunden Acidolyse-only SECs mit einem leeren inneren Hohlraum. Die dritte Reihe zeigt FITC-BSA geladenin 30 Stunden Acidolyse-only SECs. (Maßstabsbalken sind 10 &amp; mgr; m). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig8.jpg" /> Abbildung 8. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) Charakterisierung von BSA-beladenen Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) REM - Aufnahmen von BSA-loaded SECs. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von BSA-beladenen SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <tablefo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Stoff </td><td> BSA - Beladung pro Charge (125 mg / ml) </td><td> BSA in 5 mg SECs (mg) </td><td> Anzahl der BSA beladen (g pro g SECs) </td></tr><tr><td> Unbehandelte Sporen </td><td> 0,6 ml </td><td> 0.654 ± 0.05 </td><td> 0.131 ± 0.01 </td></tr><tr><td> SECs </td><td> 1,2 ml </td><td> 0,831 ± 0,05 </td><td> 0.170 ± 0.01 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Verkapselung von Rinderserumalbumin (BSA) in unbehandeltem Spores und SECs. Volumen der BSA-Lösung für die Beladung pro 150 mg Charge von &quot;unbehandelte Sporen&quot; oder &quot;SECs &#39;verwendet. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von dreifachen Chargen mit Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten.

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Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs.

Extraktion von Pflanzenbasis Kapseln für Mikroverkapselung Anwendungen

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. 

Serie: Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Forschung

Biochemie

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Entwicklungsbiologie

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Biotechnik

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Bacterial Cellulose Spheres that Encapsulate Solid Materials

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an affordable and simple method for BC sphere production. In addition to producing these spheres, an encapsulation method for solid particles has also been identified. To produce BC spheres, water, black tea, sugar, vinegar, and bacterial culture are combined in a baffled flask and the contents are agitated. After determining the proper culture conditions for BC sphere formation, their ability to encapsulate solid particles was tested using biochar, polymer beads, and mine waste. Spheres were characterized using ImageJ software and thermal gravimetric analysis (TGA). Results indicate that spheres with 7.5 mm diameters can be made in 7 days. Adding various particles increases the average size range of the BC capsules. The spheres encapsulated 10 - 20% of their dry mass. This method shows low-cost sphere production and encapsulation that is possible with easily obtainable materials. BC spheres may be used in the future as a contaminant removal aid, controlled release fertilizer coating, or soil amendment.

This protocol presents an easy, inexpensive method of forming bacterial cellulose (BC) spheres. This biomaterial can function as an encapsulation medium for solid materials, including biochar, polymer spheres, and mine waste.

Bakterielle Cellulosekugeln, die feste Materialien verkapseln

Bacterial cellulose (BC) spheres have been increasingly researched since the popularization of BC as a novel material. This protocol presents an ...

Ingenieurwesen

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

Säugetierzellverkapselung in Alginatperlen unter Verwendung eines einfachen gerafften Gefäßes

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Medizin

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

Chemie

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and scalability. In this paper, we describe a strategy for the robust and reproducible formation of hPSC spheroids where a co-axial flow focusing device is utilized to entrap hPSCs inside core-shell microcapsules. The core solution contained single cell suspension of hPSCs and was made viscous by the incorporation of high molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) and density gradient media. The shell stream comprised of PEG-4 arm-maleimide or PEG-4-Mal and flowed alongside the core stream toward two consecutive oil junctions. Droplet formation occurred at the first oil junction with shell solution wrapping itself around the core. Chemical crosslinking of the shell occurred at the second oil junction by introducing a di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol or DTT) to these droplets. The crosslinker reacts with maleimide functional groups via click chemistry, resulting in the formation of a hydrogel shell around the microcapsules. Our encapsulation technology produced 400 &#181;m diameter capsules at a rate of 10 capsules per second. The resultant capsules had a hydrogel shell and an aqueous core that allowed single cells to rapidly assemble into aggregates and form spheroids. The process of encapsulation did not adversely affect the viability of hPSCs, with &gt;95% viability observed 3 days post-encapsulation. For comparison, hPSCs encapsulated in solid gel microparticles (without an aqueous core) did not form spheroids and had &lt;50% viability 3 days after encapsulation. Spheroid formation of hPSCs inside core-shell microcapsules occurred within 48 h after encapsulation, with the spheroid diameter being a function of cell inoculation density. Overall, the microfluidic encapsulation technology described in this protocol was well-suited for hPSCs encapsulation and spheroid formation.

This article describes encapsulation of human pluripotent stem cells (hPSCs) using a co-axial flow focusing device. We demonstrate that this microfluidic encapsulation technology enables efficient formation of hPSC spheroids.