Name: cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
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우리는 동물 실험과 지원을 위해 호주 생물 자원 (Garvan 연구소, 호주), 생물 자원 센터 (UNSW 호주)와 동물 관리 및 윤리위원회 감사합니다. 이 작품은 호주 국립 보건 의료 연구위원회 (프로젝트 그랜트 APP1062720)에 의해 지원되었다. 박사 세자르 P. 카날 레스는 CONICYT - Becas 칠레 장학금 (# 72101076)의받는 사람입니다. 씨 바셈 Akladios는 UNSW 호주로 대학 국제 대학원 상을받는 사람입니다.

윤리 문 : 동물 주제와 관련된 모든 절차 승인 ACEC 프로토콜 13 / 64B에서 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오. 투명 마우스 피부 조직의 1. 준비 참고 : 본 연구에 사용 된 모든 마우스는 C57BL / 6 유전 적 배경에 있었다 <ol><li> 마우스 피부 조직의 컬렉션입니다. <ol><li> 인도적 경추 탈구로 쥐를 안락사. </li><li> 조심스럽게 피부에 상처하지 트리머 복용 관리와 관련 피부 영역에서 머리카락을 제거합니다. </li><li> 워시 피부 인산염 완충 식염수 (PBS)에 70 % 에탄올로 오염을 제거합니다. </li><li> 집게와 지느러미 목 피부를 들어 올리고 가위로 절개를합니다. </li><li> 지느러미 마우스 피부 (약 1.5 × 4cm)의 큰 영역을 해부하다. </li><li> 필터 종이에 피부 진피 쪽을 평평하게하고, 샘플의 전후방 방향을 기록하십시오. </li><li> 트라이PBS에서 새로 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액으로 가득 15 ML 튜브에서 m 필터 해부 피부 주위에 종이, 장소. </li><li> 4 ℃에서 냉장고에 밤새 실온에서 1 시간 동안 고정하거나. </li><li> 15 ML 튜브에 PBS에 세척 피부 2 × 5 분. 참고 : 다음 (1.1.10 - 1.1.12)을 조직의 장기 저장을위한 선택적인 단계입니다. </li><li> 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ㎖의 튜브에 에탄올 (25 %, 50 % 70 %)의 농도가 증가하여 PBS에서 해부 피부 탈수. </li><li> 더 사용할 때까지 4 ° C에서 15 ML 튜브에 PBS에서 70 % 에탄올 탈수 피부를 저장합니다. </li><li> 4시간 지우기 전에 실온에서 1 시간 세정 단계 동안 15 ml의 튜브에서 에탄올 (70 %, 50 %, 25 %, 0 %)의 농도가 감소함에 따라 PBS에서 피부 조직을 재수. </li></ol></li><li> 마우스 피부 조직 검사를 지우기 <ol><li> 3.85 g의 요소와 3.85 g의 N, N, N을 용해하여 CUBIC1 클리어 솔루션을 준비 &#39;, N&#39;70 °의 C - (60)에 설정된 히터 증류수 5.38 ㎖ 중의은 - 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민. 뜨거운 교반기를 사용합니다. </li><li> 이 분명하고, 실온으로 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다. </li><li> 대략적인 크기 0.2 × 0.5 cm의 생검에 날카로운 면도날와 마우스의 피부를 잘라, 그리고 15 ML 튜브에 CUBIC1 클리어 솔루션 5ml에 잠수함. 모낭의 시각화를 최적화하기 위해, 생검의 긴면이 샘플의 안테 - 후방 방향을 따라 절단되어 있는지 확인합니다. </li><li> 37 ° C에서 하이브리드 오븐에서 회전하는 플랫폼에 배치합니다. </li><li> 7 일 후 청산 솔루션을 변경합니다. 사용하기 전에 신선한 CUBIC1 솔루션을 준비합니다. </li><li> 7 일 후 조직의 투명성을 확인합니다. 필요한 경우 조직이 완전히 투명해질 때까지, CUBIC1 청산 용액에 조직 검사를 둡니다. </li><li> 피부 조직 검사가 투명하면,CUBIC1 솔루션을 제거하고 37 ℃에서 6 시간 동안 조직 4 번 씻어 1 × PBS의 4를 가하여. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 15 ml의 관에서 PBS에 V 크로즈 / w 20 %의 피부 조직을 세척 하였다. </li><li> -80 ° C 형 냉장고에 하룻밤 15 ML 튜브 매체 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 장착의 조직을 고정. 참고 :이 단계는 다음 단계에서 항체 침투를 위해 조직 검사의 투과성을 증가 할 것이다. </li></ol></li></ol> 2. 면역 형광 염색법 <ol><li> 3 시간 - 2 실온에 1.2.9에서 조직) 해동. </li><li> 실온에서 8 시간 동안 PBS 5 ㎖로 15 ML 튜브에 세척 조직의 OCT 화합물을 제거합니다. </li><li> 37 년 쉐이커에 3 일 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 - X100) 100 : 2 ML 튜브로 전송 생검, 모두 1 희석, 1 ml의 토끼 방지 Keratin14 또는 토끼 항 사료된다 항체의 조직을 품어 C 오븐 °. </li><li> 15 ㎖의 관,로 전송 생검차 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST 5ml에 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 삼일 PBST 100과 부화 : 2 ML 튜브로 전송 생검 1, 희석 차 항체 Alexa594 1 ml의 항 - 토끼를 추가합니다. </li><li> 15 ML 튜브로 전송 생검, 그리고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 PBST의 5 ㎖에서 6 시간 동안 조직을 4 회 반복한다. </li><li> 2 ML 튜브로 전송 생검 추가, 1 ml의 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 핵 Counterstain과 용액 (1 : 1,000) PBST와 37 ° C 오븐에 통에 밤새 품어. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 쉐이커에 조직을 6 시간 동안 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST 1 ㎖​​를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 3. 나일 레드 염색 <ol><li> 1m의 최종 농도로 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 나일 레드 분말을 용해g / ㎖ </li><li> 1 μg / ML의 최종 농도는 1 ㎖의 PBS로 1 μL 나일 적색 용액을 추가한다. </li><li> 해동이 실온에 1.2.9에서 조직) - 3 시간 및 상온에서 8 시간 동안 5 ㎖ PBS로 세척한다. </li><li> 2 ML 튜브에 조직 검사를 전송하고, 실온에서 2.5 시간 동안 1 ml의 나일 레드 염색 용액에 조직을 잠수함. </li><li> 실온에서 30 분 동안 1 ml를 PBST로 4 회 2 ㎖의 튜브 피부 생검을 씻는다. </li><li> 상기 2 ㎖의 튜브에서 PBST 용액을 제거 DAPI 핵으로 대조 용액 (1 : 1000) 1 ㎖를 추가 PBST로 실온에서 밤새 배양한다. </li><li> DAPI의 대조 염색 액을 제거하고 실온에서 6 시간 동안 피부 조직을 4 회 씻어 2 ML 튜브에 PBST의 1ml를 추가합니다. 참고 : 선택 단계 : 생검 최소 3 주 동안 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 1X PBS에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> (50)를 포함하는 CUBIC2 클리어 솔루션을 준비% 슈 크로즈, 25 % (w / v)의 요소, 10 % (/ V w) (w / v)의 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol 및 0.1 % (v / v) 트리톤 X-100. </li><li> 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 진탕 기에서 2 ㎖의 튜브에 1 ㎖의 용액 CUBIC2 피부 조직을 인큐베이션. 이 단계에서는 조직의 굴절률을 고르게한다. </li><li> 조직의 선명도를 확인합니다. 이 클리어되면, 유리 커버 슬립 상에 그 긴 변에 전체 피부 생검 (0.2 × 0.5 cm)에 위치, 모낭의 길이 방향이 커버 슬립의 표면에 평행 같은 것을 (# 1 24 X 60mm) 참고 : 선택 단계 : 항체 염색 생검은 약 7 일 동안 CUBIC2 용액에 저장 될 수있다. 나일 레드 염색 생검은 최대 1 일 동안 CUBIC2 솔루션에 저장 될 수 있으며, 가능한 한 빨리 군데해야합니다. </li><li> 영상 실을 준비합니다 (그림 1) (F를, 파란색 압정 반죽 또는 유사한을 재생하고,이 된 커버 (24 × 50 ㎜) : 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품은 다음과 같습니다 참고igure의 1A). <ol><li> 블루 압정의 두 개의 얇은 스트립 (직경 약 1mm × 2 ㎝)와 두 개의 커버 슬립 (그림 1B)를 준비합니다. </li><li> 피부 생검 (그림 1C)를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 파란색 압정 스트립을 놓습니다. 4.4.3) </li><li> CUBIC2 솔루션의 드롭 (그림 1C)의 커버 슬립에 스트립 사이에 피부 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 두 번째 커버 슬립 (그림 1D)와 피부 생검을 커버. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경의 무대에 탑재 된 피부 조직 검사와 영상 챔버를 놓고 빛 경로로 조직을 이동합니다. </li><li> 형광 염색 관심 지역을 식별하는 수은 또는 할로겐 광원 및 표준 표면 형광 필터 (예 DAPI / GFP / CY3 / CY5)를 이용하여 시료를 검사한다. </li><li> (a 10X 및 20X 대물 렌즈 (NA 0.75) 및 표준 촛점 형광 이미징 기술을 사용하여 예를 들어., DA로 주목 화상 영역PI 염색 샘플은 405 nm의 레이저와 조명과 425 사이의 형광 신호 수집 - 475 nm의, 그리고 알렉사 플 루어 594 또는 나일 레드 묻은 시료와 561 nm의 레이저와 조명과 570 사이의 형광 신호 수집 -) 620 nm의. </li><li> 현미경 Z 스택 화상 획득 소프트웨어를 이용하여 관심있는 각각의 영역의 영상 Z-스택을 생성한다 (예., 후술하는 바와 같이 소프트웨어 4.13 NIS 촬상 소자를 사용하여). <ol><li> 최적의 레이저 파워와 PMT HV를 확인 / 오프셋 설정은 샘플 형광을 수집하기 위해 선정되었다. </li><li> &quot;취득 제어&quot;에서 &quot;ND 취득&quot;도구 모음을 엽니 다. </li><li> (다른 모든 탭이 선택 해제되어 있는지 확인합니다) &quot;Z 시리즈 설정&quot;탭을 선택합니다. </li><li> 라이브 스캔하는 동안, 샘플의 상단에 초점을 맞추고 &quot;최고&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 샘플의 바닥에 집중하고 &quot;바닥&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 입력 필수 단계 크기 (누르거나 최적화 된 스텝 크기 버튼). </li><li> 사전SS 버튼 &quot;지금 실행&quot;. </li><li> 개별 티파니 이미지 스택과 같은 결과 Z-스택 (이미지 Z-스택 당 1 형광 색소)을 저장합니다. </li></ol></li><li> 3D 분석 소프트웨어를 사용하여 관심의 3 차원 볼륨 영역을 재구성 화상 Z-스택을 사용 (예., 후술 Imaris x64의 7.2.3를 사용하여). <ol><li> 분석 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 선택 3D 볼륨 생성을위한 도구 모음에 버튼을 &quot;능가&quot;. </li><li> 열기 최초의 컬러 이미지 Z 스택 (예., DAPI). </li><li> 추가 색상 채널, 형광 색소 당 하나의 채널을 추가하려면 &#39;채널을 추가&#39;도구를 사용합니다. 따라서 DAPI와 알렉사 플 루어 594 형광 색소를 모두 포함하는 샘플은 두 개의 채널이 필요합니다. </li><li> 위의 4.7에서의 결정에 따라, (XYZ)을 올바른 픽셀 (복셀) 크기를 설정하려면 &quot;이미지 속성&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 필요에 따라 채널의 색상을 변경하려면 &quot;디스플레이 조정&quot;도구를 사용하여 (예를 들어, 파란색에 DAPI 채널을 설정 알렉사 플 루어 빨간색으로 594 채널). </li><li> 포에이미지 창에서 3D 볼륨을 sition, 필요에 따라 클릭하고 드래그 볼륨으로 컴퓨터 마우스를 사용합니다. </li><li> 3D 영상의 스크린 샷을 생성하기 위해 도구 모음에서 &quot;스냅 샷&quot;도구를 사용합니다. </li><li> 3D 샘플 회전의 영화를 생성하는 도구 모음에서 &quot;애니메이션&quot;도구를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li><li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+stem+cells:+an+update.">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li><li>Hardy, M. 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피부 개발 및 항상성 제어 규제기구는 가장 일반적으로 피부 형태학, 세포 집단 또는 단백질 발현의 제한된 하락 가능 항체와 조직 절편의 조직 학적 염색 또는 표지를 사용하여 2 차원으로 연구된다. 다수의 방법은 표피 전체 마운트 10-13의 3 차원 단일 세포 해상도 세포 단백질의 공간적 조직의 시각화를 개선하기 위해 개발되었다. 이들 중 일부는 특히 그러나 털이 피부를 사용하여 기술적 도전 진피에서 표피의 분리를 포함하고, 종종 모낭 조직 손상 및 파손을 초래한다. 또한, 배아 개발 및 조직의 항상성 동안 그들 사이에 발생하는 세포와 분자의 상호 작용을 연구 표피와 진피 손상의 분리. &#39;플랫 마운트 방식은&#39;다른 방법입니다 전체 두께 마우스피부 절개 및 면역 염색, 면역 후 신호 (14)를 유지하면서 벤질 벤조 에이트 및 벤질 알콜 (BBBA)을 이용하여 정화된다. 이 방법은 진피, 표피의 기술적 도전 분리를 필요로하지 않는다. 그러나 BBBA는 일부 형광 단백질을 변성하고,이 조직에서의 세포 및 분자 작용을 조사하기 위해 필요한 샘플의 고해상도 영상화를 허용하지 현미경 목표 오염, 매우 독성이다. 이 보고서는 상대적으로 안전하고 저렴한 시약을 사용하여 임의의 원하는 해부학 적 영역과 연령에서 전체 두께 마우스 피부 조직 검사를 명확히하기 위해 CUBIC 프로토콜 5-7을 설명합니다. 이 기술적으로 간단한 프로토콜은 가능 단일 셀 해상도에서 입체적으로 DAPI으로 대조 전체 두께 피부 생검에서 면역에 의해 단백질 발현 및 확산 패턴의 시각화를 허용 전례와 QUAL 매우 정확itative 평가 및 단백질 발현, 증식, 조직 형태 및 모낭 크기의 정량화. 이 방법은 또한, 정화 과정 동안 조직 지질의 제거에도 불구 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 sebocytes 적합하다. 이 방법의 중요한 한계는 효과적으로 결합이 피부 정화 공정을 이용하여 각각의 표적 단백질의 시각화를 허용 항체의 가용성이다. 또한, 상기 생성 된 이미지 및 동영상 파일은 크고, 이러한 강력한 프로세서 및 풍부한 데이터 저장 공간을 가진 컴퓨터와 같은 IT 좋은 자원은 필수적이다. 절차에서 중요한 단계는 피부 조직 검사의 준비입니다. 완전한 모낭 해부학 시각화 피부 생검의 배향은 고려되어야하고 생검의 길이는 모낭의 길이 방향과 평행하게 절단한다. 또한, 매우 얇은 소형 스키n은 조직 검사는 현미경에 대해 올바르게 장착하기가 어렵다. 큰 생검을 취소하는 데 시간이 더 필요하고, 항원 검출 유물의 결과 항체 침투 문제가 발생할 수 있습니다. 이 실험에 따라서 절단하는 것이 좋습니다 명확하고 얼룩 여러 조직 검사입니다. 단단히 반응물 농도의 변화를 초래 가열 공정 동안 내용물의 증발을 방지하는 CUBIC 용액을 준비하는 동안 튜브를 밀봉하고 손상된 조직 소거가 발생할 수에 또한 중요하다. 다음으로 중요한 단계는 조직 클리어링 프로세스를 가속화하기 위해 37 ° C에서 명확해질 것이라는 것이다. 7 일 후 상기 CUBIC1 용액 구를 대체 할 새로운 제조 할 필요가있을 것이다. 앞으로 더 많은 항체는 CUBIC 피부 정화 절차와 호환되는지 확인되며, 분석을 시각화하고 표피와 멜라닌 세포 (줄기) 세포 마커의 정량화에 확장 될 수있다s와 피부 단백질. 이 기술은 또한 진피 사이 신호의 상호 작용을 포함하여 돌연변이 생쥐와 유전자 변형 기자 마우스 모델의 피부에 이상이 정상 상피 세포 생물학을 기본 세포 및 분자 메커니즘의 해명에 피부 병리 해부학, 원조의 3D 연구에서 기본적인 역할을 담당 할 것 표피. 입방 프로토콜 5-7 다른 척추 동물 모델의 피부에 적용 할 수있을 것, 및 인간의 피부 생검 펀치이다. 광 시트 현미경 큰 피부 샘플 표피 해부학, 단백질 발현 패턴 및 모낭 사이클 단계의 진행의 시각화를 가능하게 할 것이다.

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 그것은 세 가지 주요 레이어 외부 표피, 진피 및 피하로 구성되어 있습니다. 표피는 높은 재생 조직이다. 그것은 주로 각질 구성된 층상 편평 상피이다. 각질 세포는 기저층에서 태어나 차별화하면서 suprabasal 레이어를 통해 위쪽으로 이동하고, 결국은 자신의 출생 후 한 달에 대한 외부 각질화 층에서 발산되어있다. 표피는 모낭 및 피지선 포함 부속물들을 개발하고있다. 모낭은 생활 1 전체에 순환 방식으로 재생. 표피의 재생 능력은 interfollicular 표피와 모낭 (2)의 기저층에있는 줄기 및 전구 세포의 존재에 의해 사용할 수 있습니다. 많은 신호 전달 경로는 표피 개발 및 재생에 관여하고있다. 이들 중 일부는 내 발생이러한 헤지 호그 경로로만 표피. 다른 신호 이벤트는 진피와 표피 세 사이에 발생한다. 예를 들어, 진피의 Wnt 신호 모낭 발달에 중요한 것으로 생각되며, 그들은 활성화 성장기의 발병 모유두에서 분비되는 모낭 벌지 줄기 / 선조 세포의 증식 및 모발 성장은 4. 더 나은들이 피부암으로 회생 피부 질환으로 교란 될 수있는 방법을 이해하는 표피 발달 및 재생을 제어하는​​ 세포 및 분자 적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 이 문서에서는 C의 리어 설명, U는 전체 마운트 피부 준비를 명확히하고, 공 초점 현미경에 의한 단일 셀 해상도에서 3 차원 단백질 발현 패턴을 시각화하는 B 비 I의 maging 칵테일과 C omputational 분석 (CUBIC) 프로토콜 5-7 nobstructed. 입방 방법은 피부의 몰입을 포함한다이 아미노 알코올 기반 화학 칵테일의 조직. 이러한 솔루션은 단일 세포 면역 해상도를 허용 투명 단백질 손상 조직을두고 피부 샘플의 굴절률을 조정한다. interfollicular 표피와 모낭에서 각질 세포 인구를이 CUBIC 프로토콜, 기초를 사용하고 증식하는 안티 Keratin14 (K14) 및 안티 사료된다 항체를 사용하여 야생형 마우스의 전체 두께 피부 생검에 몇 군데 있었다. 야생형 피부 조직 검사에서 피지선은 나일 레드 염색을 사용하여 시각화 하였다. 마지막으로, 야생형 및 증식 YAP2-5SA-ΔC 피부 생검의 기초 각질 세포 인구 8을 비교 하였다. 이 CUBIC 프로토콜은 단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 조직 검사에서 단백질 발현의 시각적 평가를 가능하게하고, 유전자 변형의 피부의 표피 해부학과 형태 학적 결함을 인식하는 중요한 도구입니다마우스 및 표피 개발과 재생의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사합니다.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96% (undenaturated)</td><td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>anti-Keratin14 antibody</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ki67 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - Confocal Microscope</td><td></td></tr><tr><td>cruZer6 Face Trimmer</td><td>Braun</td><td>Braun cruZer6 Face</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>438456</td><td></td></tr></tbody></table>

cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations

피부는 우리의 생존을 위해 필수적이다. 외부 표피 층은 모낭과 땀샘 우리의 몸과 표피 부속의 대부분을 커버하는 층상 편평 상피이다 interfollicular 표피로 구성되어 있습니다. 표피는 일생 동안 부상에 응답하여 재생을 겪는다. 이 긴밀하게 표피 내부와 표피와 진피 사이의 활성 여러 규제 메커니즘에 의해 규제되는 기저 상피 줄기 / 전구 세포 인구를 K14이 발현으로 활성화되어 있습니다. 이 문서는 전체 두께 마우스 피부 생검을 명확히하고, K14 단백질 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 설명, 사료된다 세포 증식라고 표시된, 나일 레드 sebocytes를 표시 및 3D에서 단일 셀 해상도 DAPI 핵 라벨. 이 방법은 정확한 평가와 피부 해부학과 병리학의 정량 및 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의 수 있습니다. 입방 프로토콜은 일입니다단일 셀 해상도에서 전체 두께 피부 생검 분자 및 세포 상호 작용을 조사 날짜에 사용할 수 전자 최선의 방법.

성인 야생형 마우스의 전체 두께 등의 피부 생검은 기저 각질 세포 마커 Keratin14 (K14)를 결합하는 항체로 염색, 명확하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 2, 영화 1)으로 대조 하였다. DAPI 양성 핵 샘플 (도 2A, C)에 걸쳐 볼 수 있었고, K14 염색 배타적 interfollicular 표피의 하나의 셀 두께의 기초 층에 표시이고, 피지선 (검은 색 별표)의 외주 루트 칼집을 개략적 모낭은 모발 이차 세균 (도 2B, C)에서, 앞서 구 출판. K14 염색 강도는 interfollicular 표피 원위 모낭 및 보조 헤어 세균 (흰색 별표)에 높고, 그리고 모낭 (도 2c에 니어)의 팽창 영역에서 상대적으로 낮았다. 진피 유두 명확하게 visibl도했다DAPI 라벨을 통해 전자 (그림 2c에 화살표). 성인 야생형 마우스의 휴지기에 증식 세포, 전체 두께 등의 피부 조직 검사를 시각화하기는 명확하고 방지 사료된다 항체로 염색하고, 핵은 DAPI 용액 (그림 3, 영화 2)으로 대조하고 있었다. 증식하는 케 라티노 사이트는 표피의 기저 interfollicular (도 3c에 IFE)에서 검출하고, 협부의 모낭 아니라 팽창 영역 (도 3c에 니어)에 (도 3c의 경우) 하였다. 성인 야생형 마우스의 성장기에있는 피지선, 전체 두께 등의 피부 조직 검사를 시각화하기 위해 명확하고 sebocytes의 지방 함량 레이블 나일 레드로 염색하고, 핵은 DAPI 염색 용액 (그림 4, 영화 3)으로 대조하고 있었다. 나일 레드 양성 sebaceou의 분비는 CUBIC 프로토콜은 크게 다음 지방 함유 구조의 형태에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여 모낭 (그림 4C에서 SB)의 지협 지역에서 관찰되었다. 예기치 않게, 헤어 샤프트는 나일 레드 (그림 4C에서 HS)으로 표시 하였다. 기초 각질 8에서 활동적인 YAP 돌연변이 단백질을 발현 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 마우스의 표피의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해, 성인 야생형 및 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 한배의 새끼 쥐의 전체 두께 등의 피부 생검은 명확하고 염색 하였다 안티 K14 항체 및 핵은 DAPI 용액 (도 5, 영화 4 (야생형)와 Movie 5 (YAP2-5SA-ΔC))과 대조시켰다. 그림 4 층에서 YAP2-5SA-ΔC 유전자 변형 피부에서, interfollicular 표피의 증식 (상단 이중 화살표 </strong&gt;) 명확하게 볼이고, 이전 8 바와 같이 모낭은 이상이었고, 확대 된 줄기 세포 집단을 나타내는 비정상적인 모낭 (도 5F 낮은 이중 화살표)에서 근위 K14 표지 된 세포 덩어리를 표시. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig1.jpg" /> 그림 1 : 이미징 회의소의 준비. A : 블루 압정 (지름 약 2mm × 2 CM)의 두 개의 얇은 스트립을 준비하고 :. 이미징 챔버의 제조에 필요한 소모품 B 반죽 또는 유사한, 2 커버 슬립 (24 × 50 mm)를 재생, 블루 압정입니다 이 커버 슬립 C :. 피부 조직 검사를위한 충분한 공간을 허용 한 커버 슬립에 배치 블루 압정 스트립. . 두 스트립 사이 CUBIC2 용액 한 방울의 피부 조직 검사를 배치 D : 블루 압정 스트립에 장소 두 번째 coverslip에 피부 생검을 커버. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/54401fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig2.jpg" /> 그림 2 : 성인 야생형 마우스의 텔로 겐의 등쪽 피부의 K14 / DAPI 라벨 보내고 K14 항체 (B 레드, C)로 표지 성인 야생형 마우스의 휴지기의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 재구성 및 DAPI 핵 Counterstain과. (A, C 파란색). K14 염색 팽창에 interfollicular 표피 (IFE), 지협과 피지선 (블랙 별표) 및 차 머리 세균 (흰색 별표) 강한, 그리고 상대적으로 낮은<html> 지역 (니어). 규모는 50 μm의 바. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/54401fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig3.jpg" /> 그림 3 :. A의 (B, C 레드) 성인 야생형 마우스 사료된다 항체로 표지 성인 야생형 마우스의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 복원이의 텔로 겐의 등쪽 피부의 사료된다 라벨링 및 DAPI 핵 Counterstain과 (파란색, C). 확산 사료된다 양성 각질 세포는 기초 interfollicular 표피 (IFE)에서 분명하고, 지협 지역 (IS)에서가 아니라 휴지기 모낭의 팽창 (니어)입니다. 규모는 50 μm의 바.rget = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig4.jpg" /> 그림 4 : 성인 야생형 마우스의 성장기에 등쪽 피부의 나일 레드 염색 나일 레드 (B 빨간색, C) 및 DAPI 핵 Counterstain과 (파란색으로 표시 성인 야생형 마우스의 성장기의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 재구성. A, C). 나일 레드 염색은 sebocytes (SB)와 머리 샤프트​​ (HS)에 표시됩니다. 규모는 50 μm의 바. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/54401fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54401/54401fig5.jpg" /> 그림5 : 형태 학적 이상 유무 YAP2-5SA-ΔC 표피 성인 야생형 (A - C)의 등쪽 피부 생검의 3D 볼륨 복원 및 YAP2-5SA-ΔC 형질 전환 한배의 새끼 쥐 (D - F를)은 K14 항체로 표지 (빨간색입니다. B, A의 C, E, F), 및 DAPI 핵 Counterstain과 (블루, C, D, F). YAP2-5SA-ΔC 표피의 표피 증식은 근위 (F 낮은 이중 화살표) 8 특성 줄기 / 전구 세포 질량을 표시 interfollicular 표피와 모낭에 (F에서 최고 이중 화살표)에서 알 수있다. 규모는 50 μm의 바. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/54401fig5large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a><html> 이 그림의. <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie1.jpg" /> 영화 1. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/Movie_1.mov" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie2.jpg" /> 영화 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/Movie_2.avi" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 3" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie3.jpg" /> 영화 3. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/Movie_3.mov" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 01movie4.jpg &quot;/&gt; 영화 4. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/Movie_4.mov" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 (5)" src="/files/ftp_upload/54401/54401movie5.jpg" /> 영화 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54401/Movie_5.mov" target="_blank">이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  University of New South Wales Australia.  이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의. 

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

3D 신경 줄기 세포 문화 번역하는 단백질 : 하이브리드 시각화 방법론

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

연구

신경과학

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

발생학

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

생물학

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

생체공학

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

면역학 및 감염병학

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 million individuals infected worldwide and no widely accessible cure. Despite intensive efforts, a detailed understanding of virus and host cell interactions in tissues during infection and in response to therapy remains incomplete. To address these limitations, water-based tissue clearing techniques CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) and CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) are applied to visualize complex virus host-cell interactions in HIV-infected tissues from animal models and humans using confocal and light sheet fluorescence microscopy. Optical sectioning of intact tissues and image analysis allows rapid reconstruction of spatial information contained within whole tissues and quantification of immune cell populations during infection. These methods are applicable to most tissue sources and diverse biological questions, including infectious disease and cancer.

Tissue clearing, combined with immunofluorescence microscopy, allows spatial visualization and quantification of immune-cell populations and virus proteins within intact tissues. Optical sectioning of cleared tissues with confocal and light sheet fluorescence microscopy can generate 3D models of complex tissue environments and reveal spatial heterogeneity exhibited during HIV infection.

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 ...