이 프로토콜은 두 가지 주요 이유로 중요합니다. 제1, 사용자가 동물 모델으로부터 분리된 피부 세포의 세포 주기 상태를 확인할 수 있게 한다. 그것은 또한 우리가 세포 주기의 이산 단계에서 단백질 발현을 분석할 수 있게 합니다.
세포 증식을 결정하는 이전 방법에 비해, 우리의 방법은 세포 주기에서 상이한 위상의 보다 정확한 측정을 허용하고, 우리는 또한 세포 분열의 다양한 단계에서 40 개 이상의 다른 마커를 분석 할 수 있습니다. 이렇게 하면 방법의 적용과 다재다능함이 크게 향상됩니다. 이 프로토콜은 암 연구와 세포 주기 특정 단백질 발현 패턴을 결정할 필요가 있는 질병의 그밖 모형에서 이용될 수 있습니다.
또한, 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 다른 모델 유기체로 변형될 수 있다. 처음으로 사용자는 가능한 최고의 품질의 셀 준비를 얻는 데 집중해야합니다. 이를 위해서는 신선한 시약을 사용하여 실험적 피부를 적시에 처리하고, 최소한의 조직 소화 시간을 하며, 세포의 무결성과 양을 보존하기 위해 원심 분리 후 상체를 신중하게 폐기해야 합니다.
먼저 원고에 설명된 대로 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어를 사용하여 금속 태그가 지정된 항체 패널을 설계합니다. 그런 다음 IdU 분말을 밀리리터 당 10 밀리그램에서 0.1 섭씨 60도에서 수산화 나트륨을 용해하여 IdU 스톡 솔루션을 준비하십시오. IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 알리코팅한 후 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에서 동결하십시오.
사용 직전에 IdU 용액의 pH를 12개의 일반 염산으로 7.5로 조정하고, 폐기 된 알리쿼트에 pH 스트립으로 테스트하여 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하십시오. 2개의 파라포멀데히드 고정 솔루션을 준비하려면 10x PBS5밀리리터와 16%PFA1밀리리터를 순수한 분자등급 증류수 44밀리리터와 결합합니다. 100 밀리몰라 시스플라틴 스톡 솔루션을 준비하려면 300.5 밀리그램의 Cisplatin 파우더를 DMSO 10 밀리리터에 녹입니다.
실험이 하루 이상 사용되려면 10 밀리머 시스플라틴 작업 용액을 준비하십시오. 쥐를 무게 하 고 체중의 그램 당 IdU의 0.1 밀리 그램에서 복용량을 결정. 관면 주사에 의해 IDU의 계산된 복용량을 관리하고, 세포를 수확하기 전에 2 시간 동안 기다립니다.
이전에 귀 기저에 IdU로 주입된 안락사 마우스의 귀를 외과적으로 제거하기 위해 한 쌍의 외과 적 등급 가위를 사용합니다. 100mm 페트리 접시에 귀를 놓습니다. 미세한 집게를 사용하여 앞쪽을 뒤쪽 피부와 조심스럽게 분리하여 절단 영역의 중간 또는 가장자리에 포켓을 만든 다음 두 개의 피부 플랩을 분리한 다음 전방 및 후방 스킨을 모두 진행합니다.
한 귀의 전방 및 후방 스킨을 12웰 컬쳐 플레이트의 한 웰에 조심스럽게 놓고, 갓 준비된 디스파스/콜라게나제 용액 1밀리리터로 채워져 피부의 피부면이 용액을 만지고 있습니다. 피부를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 소화된 귀나 신생아 껍질을 깨끗한 페트리 접시에 놓고 표피 쪽이 접시 표면에 닿습니다.
집게를 사용하여 피부를 평평하게 하고 중앙에서 가장자리까지 원형 패턴으로 작업하여 진피를 표피에서 부드럽게 밀어냅니다. 집게로 가장자리에 표피를 잡고 페트리 접시 표면에서 벗겨서 부드럽게 들어 올립니다. 미리 데운 세포 분리 용액에 표피를 접시의 한 웰에 조심스럽게 놓습니다.
섭씨 37도에서 5분 또는 실온에서 20분 간 배양하세요. 멸균 집게를 사용하여 표피를 사용하여 표피를 접시 바닥에 드래그하여 세포를 분리합니다. 1%FBS를 함유한 DMEM 1밀리리터를 추가하고 40마이크로미터 셀 체를 수집 튜브에 전달합니다.
DMEM의 추가 2 밀리리터와 잘 헹구고 세포 현탁액에 추가합니다. 원심 분리 후 5 분 동안 120 배 g에서 조심스럽게 슈퍼 나탄을 흡인합니다. 1%FBS를 포함하는 DMEM의 1~ 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전과 같이 세포를 다시 펠릿.
살아있는 세포와 죽은 세포를 결정하기 위하여 세포를 레이블을 붙이려면, 25 마이크로 몰라 시스플라틴을 포함하는 DMEM의 1 밀리리터에 있는 1-3 백만 세포를 재중단하고 1 분 동안 배양합니다. 동일한 볼륨의 FBS로 파이펫팅하여 담금질합니다. 5 분 동안 120 배 g에서 원심 분리 한 후, 희석 된 표백제를 포함하는 비커에 상체를 데칭하고, 나머지 용액을 종이 타월에 배출하기 위해 튜브를 반전시십시오.
바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전에 설명한 대로 다시 원심분리기. 세포를 고치려면, 바륨 양이온이 없는 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 연속 저전력 하에서 세포를 소용돌이치고 두 x PFA 고정 버퍼 드롭 와이즈의 1 밀리리터를 추가합니다.
흔들 기 플랫폼에 놓고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 동일한 조건에서 다시 원심분리기의 2 밀리리터로 세포를 세척하고 세척 단계를 반복합니다.
마지막으로, 바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 신중하게 상체를 데칭합니다. 1x 고정 버퍼의 1밀리리터로 셀을 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 배양하고 원심분리를 반복합니다.
셀을 세척하려면 바코드 permeabilization 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 셀 원심 분리 시 5분간 500배g의 세포 원심분리를 통해 바코드 투과화 버퍼 100마이크로리터를 추가하여 바코드를 준비하고 즉시 섞는다. 바코드 투과화 버퍼의 800 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
바코드 솔루션을 셀에 추가하고 실온에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. 5분간 500배 g의 원심분리기. 세포 염색 완충제와 원심분리기의 2밀리리터로 세포를 다시 세척합니다.
다음으로, 핵 항원 염색 완충액의 1밀리리터에서 1~300만 개의 세포를 재중단하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 핵 항원 염색 충류 완충및 원심분리기의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
반복 반복 반복 된 현탁액 및 원심 분리 후, 부드러운 소용돌이와 잔류 볼륨의 세포 펠릿을 다시 중단. 셀룰러 내 항체 칵테일 50마이크로리터를 실내 온도에서 45분간 혼합하고 배양합니다. 셀 염색 버퍼 2밀리리터를 추가합니다.
원심분리기는 이전 단계와 동일한 조건에서 다시 원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 셀 염색 완충제의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리기는 5분 동안 500배 g로, 재연 및 원심분리를 반복한다. 인터컬레이션 용액의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 섭씨 4도에서 1~3일 동안 보관하십시오.
세포를 원심분리한 후, 동일한 조건하에서 두 밀리리터의 세포 염색 완충제, 원심분리기로 펠릿을 세척하고, 동일한 원심분리와 함께 2밀리리터의 물로 2개의 추가 세척을 수행한다. 희석 된 EQ 비드 용액으로 밀리리터 당 백만 세포의 농도로 세포 펠릿을 다시 중단 한 다음 질량 세포계에서 샘플을 실행합니다. 성인 마우스 귀와 신생아 피부에서 예상되는 세포 수율 및 생존능력이 결정됩니다.
대략적인 수율은 피부의 표면적에 따라 달라집니다. 신생아 피부는 세포의 더 큰 수를 필요로 하는 실험에 대 한 더 나은 선택. 바코드 질량 세포측정 데이터의 정규화 및 절충볼루션 후, 그대로, 단일 및 실행 가능한 셀을 선택하는 기본 게이팅 전략이 표시됩니다.
실행 가능한 세포의 백분율은 염색하기 전에 세포의 품질 또는 상태를 나타낼 수 있습니다. 배양된 암종 세포와 분리된 마우스 이어 셀 간의 생존가능성에 대한 차이도 나타난다. 실행 가능한 세포는 조혈 세포를 제외하기 위하여 CD45 대 이벤트 길이에 문지였습니다.
리니지 마커의 포함은 다른 세포 주기 단계에 관심있는 세포 집단의 선택을 허용합니다. 기본 세포 주기 프로파일은 형광계 유동 세포측정에서 BRdU 대 PI의 검출에 의해 얻어진다. 그러나, 질량 세포종을 가진 그밖 증식 마커의 포함은, 세포 주기 단계의 더 정확한 확인을 허용합니다.
이러한 접근법에 따라, 세포 주기 프로파일은 동일한 실험에서 CD45 음성 대 CD45 양성 세포에 대한 프로파일과 같은 상이한 세포 유형 또는 실험 조건에 대해 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, G-1 단계에서 EGFR 및 mTOR PI3K 신호 경로를 정의하는 마커의 분석은, 파란색으로 표시된 주황색 및 CD45 양성 세포에 도시된 CD45 음성 세포에서 유사한 발현 프로파일을 드러냈다. 질량 세포측정은 고품질 의 세포를 많이 필요로한다.
사용자가 희귀 세포 집단에 관심이 있는 경우 더 많은 셀 수가 필요할 수 있습니다. 고립 된 살아있는 세포는 DNA 또는 RNA 분석, 생화학 연구에 사용될 수 있거나 대량 세포 측정을 위한 고정 및 염색 전에 조직 배양에 사용될 수 있다. 사용자는 파라포름알데히드, 염산 또는 수산화나트륨과 함께 작업할 때 필요한 경우 개인 보호 장비와 안전 캐비닛을 사용해야 합니다.
