이 작품은 NIH (HL118532, HL120142, CA187692), 데이비드 &amp; 루실 패커드 재단, 카밀 &amp; 헨리 드레퓌스 재단과 버로우즈에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 기금에 오신 것을 환영합니다. ASP는 샬롯 엘리자베스 프록터 경어 원정대에 의해 부분적으로 지원되었다.

솔루션 1. 준비 <ol><li> 인슐린의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다 (용매 100 ㎖에 500 mg의 인슐린) O DH이 5mm의 염산 (HCL)과 분말 인슐린 스톡을 희석. 증류수 100 ㎖로 농축 염산 50 μl를 첨가하여 용매 100 ㎖ (DH 2 O)를 준비한다. </li><li> PBS의 1X 용액을 제조하기 위해, 멸균 조건 하에서 DH 2 O로 배일 10 배 인산 완충 용액 (PBS) 원액을 희석. </li><li> 다음으로, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 용액을 제조 하였다 : 1 (w : w)의 비율로 10의 경화제와 함께 PDMS의 예비 중합체를 혼합한다. </li><li> 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비 : 재고 둘 베코의 변형 이글 중간의 500 ml의 : 식품 혼합물이 F-12 (DMEM는 / F-12), (10) 살균 소 태아 혈청의 ㎖ (FBS), 겐타 마이신 시약 500 μL 및 추가 5 ㎎ / ㎖의 인슐린 500 μL. </li><li> W (1 % 추가 1X PBS 용액에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 제조: BSA 분말 V) 솔루션은 PBS를 1 배에서 철저하게 혼합합니다. </li><li> 추가 I 콜라겐 중화 소 타입의 4 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 50 μL 배 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 완충액, 30 ㎕의 0.1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 30 ㎕의 세포 배양 배지, 주식 콜라겐 400 μL 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에. 위아래로 피펫 팅에 의해 천천히 섞는다; 거품을 도입하지 마십시오. 모든 거품을 제거하려면, 간단히 4 ℃에서 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 4 (V : V) 1X PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드 1을 희석하여 정착 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1,000 (절 : v)의 주식 핵 라벨링 솔루션 1을 희석하여 핵 라벨링 솔루션을 준비 1X PBS에서. </li><li> 세제 : 0.3 % (V V)와 1X PBS를 혼합하여 0.3 %의 인산 완충 생리 식염수 및 세제 (PBST) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 에서 0.3 % PBST : 염소 혈청을 1시 10분 (절 V)를 희석하여 버퍼를 차단 준비합니다. </li><li> PRI 희석하여 관심있는 특정 단백질에 대한 일차 항체 용액을 준비(예를 들어, 토끼 항 초점​​ 부착 키나아제 (FAK)) 메리 항체 1 : 200 (V : V) 버퍼를 차단한다. </li><li> (: V V)를 차단 완충액에서 1000 (예를 들어, 염소 항 - 토끼 1) 형광 프로브 컨쥬 게이트 항체를 희석하여 차 항체 용액을 제조 하였다. </li></ol> 3D의 미세화에 대한 탄성 스탬프 2. 준비 참고 : 탄성 스탬프는 PDMS로 만들어집니다. <ol><li> 단계 1.3에 기재된 바와 같이 동일한 비율로 PDMS 용액을 철저히 혼합한다. 혼합 과정 중에 도입 된 공기 방울을 제거하기 위해 15 ~ 30 분 동안 진공 챔버에서 혼합물을 놓는다. </li><li> 보트 또는 리소그래피 원하는 형상의 기능을 패턴 화 실리콘 마스터를 포함하는 페트리 접시의 무게를 플라스틱으로 탈기 솔루션을 붓는다. 최상의 결과를 위해 12 시간 ~ 60 ° C에서 PDMS 용액을 경화. 참고 : 실리콘 마스터가 매우 사용자 정의 할 수 있습니다; 이 프로토콜은 50의 크기로 직사각형 구조를 사용μm의 X 200 μm의 × 50 μm의 200 μm의 이격. 실리콘 마스터는 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 제조 될 수있다. 간단히, 에폭시 계 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼의 상부에 스핀 코팅된다. 원하는 스탬프 기능을 상세히 마스크 후 UV 광에 노출 된 포토 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼의 상부에 배치된다. 마스크에 의해 차단되지 바람직한 특징은 광에 노출되며, 포토 레지스트 코팅의 나머지 가용이며 씻겨 수 있지만 이러한 위치에서의 포토 레지스트는 가교 결합된다. </li><li> PDMS가 실리콘 마스터에서 원하는 기능 주위 경화 후, 플라스틱 컨테이너에서 PDMS 마스터를 제거한다. 조심스럽게 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 분리하고 깨끗한 면도날을 사용하여 인쇄 된 기능 주위에서 초과 PDMS를 제거합니다. </li><li> 지금 면도날 개별 사각형 우표에 각인 기능 (~ 8 mm × 5-mm)로 패턴 화 PDMS를 잘라. CLE 이러한 기능 측면까지 보관100 mm 직경의 페트리 접시. </li><li> 또한, 직사각형 스탬프 받침을 단계 1.3에 기재된 PDMS 용액을 사용한다. </li><li> 스핀 코터를 사용하여 100 mm 직경의 페트리 접시에 균일하게 PDMS 용액 ~ 2-3g 확산 단계 2.1에서와 같이 60 ℃에서 ~ 12 시간에 대한 PDMS 치료. 그리고, 면도날을 사용하여, 사각형으로 PDMS의 얇은 레이어 (~ 5mm × 2 mm)를 자른다. 참고 : 두 지원 단계 2.3에서 만든 각 PDMS 스탬프 필요합니다. 지지체는 PDMS 스탬프를 들어 100 mm 직경의 배양 접시에 저장 될 수있다. </li><li> PDMS 스탬프와 지지체는 세포 배양에 사용되기 전에하는 바이오 캐비닛 흡입기 (세포 배양 후드)를 이용하여 70 % 에탄올에 침지하고 건조하여 멸균. </li></ol> 3D 상피 조직 3. 준비 <ol><li> 바이오 안전성 캐비닛에서 각 우표의 상단에 PBS에 1 % BSA의 약 50 μl를 한 방울을 추가합니다. 미니 4 ° C에서 우표 덮여 방울을 배치4 시간의 엄마는 BSA가 도장의 표면에 흡착되도록합니다. </li><li> PDMS의 우표에서 대기음 BSA 솔루션입니다. </li><li> 각 세척 후 흡입, 세포 배양 배지 (스탬프 당 세척 당 50 μL가 충분합니다)로 두 번 우표의 표면을 세척 할 것. </li><li> 곡선 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 멸균 PDMS 스탬프와 지원을 처리합니다. 각각 스탬프를 PDMS의 바이오 안전성 캐비닛에서 한 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 배치. 각각의 접시에서 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 작은 거리에 의해 분리 된 두 개의 PDMS 지원을 누워. </li><li> 핀셋을 사용하여, 많은 원형 유리 커버 슬립 살균 (직경 15mm를, # 1) 70 % 에탄올을 이용하여 PDMS 스탬프가 같다. 핀셋으로 그들을 누른 상태에서 커버 슬립에서 초과 액체를 기음. 별도의 100 mm 직경의 페트리 접시에 세척 된 커버를 저장합니다. </li><li> ~ 콜라겐 액 50 μL 균일 코팅의 표면은 PDMS 스탬프 디스펜스. </li><li> 픽업각 콜라겐 코팅 PDMS는 핀셋 스탬프와 부드럽게 반전. PDMS의 상단의 반전 스탬프를 낮추하는 35 mm 직경의 조직 배양에 배치 지지체 콜라겐은 스탬프와 조직 배양 접시의 바닥 사이되도록 걸려. 30 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어. </li><li> 원형 커버 슬립 각각에 ~ 나머지 콜라겐 혼합물을 50 μL 분주하고 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화 (이후,이 완전히 콜라겐을 캡슐화 설계 조직 위에 배치 될 것이다). </li><li> 40 % 컨 플루 ~에서 상피 세포 (예. EpH4 마우스 유선 상피 세포)를 포함하는 100-mm 직경의 조직 배양 접시를 가져옵니다. 세포 배양 배지를 흡인하고 1X PBS 10 ㎖로 한번 세척 하였다. 세포에 트립신 2 ML을 추가하고 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 조직 배양 접시 트립신으로 세포를 포함하는 접시에서 나머지 부착 세포를 분리 신선한 배지 8 ㎖에 추가. 피펫으로 부드럽게 혼합하고 5 분 동안 100 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 혼합물을 이동합니다. </li><li> 원추형 튜브의 상등액을 흡인하고 세포 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포, 혈구 계산을 사용하여 상기 현탁액의 농도를 결정한다. 106 -10 107 세포 / ㎖ ~ 최종 농도를 얻기 위해 현탁액 볼륨을 조정한다. </li><li> 인큐베이터에서 겔화 콜라겐 샘플을 제거합니다. 핀셋 사용하여 부드럽게 성형 콜라겐에서 그들을 분리하고이를 폐기 똑바로 위로 PDMS 스탬프를 들어 올립니다. </li><li> 원하는 형상의 몰드 공동을 포함하는 각 콜라겐 겔의 표면 상 ~ 농축 세포 현탁액 30 μL 분주. 부드럽게 요리의 측면을 흔들면서하는 공동 내에 정착 셀을 촉진하는쪽으로 동안 10X / 0.25 NA 목표와 시야 현미경으로 세포를 관찰한다. 공동는 ~ 5 분 이내에 작성해야한다. </li><li> 연구에, 공동 각국에서 초과 세포를 가져 가십시오 옆으로 각 조직 배양 접시를 기울여 부드럽게 콜라겐 겔의 표면에 세포 배양 배지 μL 400 ~ 분배. 각 세척 사이에 현미경 콜라겐 젤을 확인 액체를 대기음 및 세척을 1-2 번 더 반복한다. </li><li> 과량의 세포가 콜라겐 주형의 셀 채워진 공동 주위에서 삭제 한 후, 15 분 동안 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터에 조직 배양 접시를 배치했다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 부드럽게 콜라겐 코팅 클래스 커버 슬립을 반전하고, 커버 슬립의 콜라겐이 세포 채워진 캐비티 위에 캡을 형성하도록 셀 가득 콜라겐 금형의 상단에 배치합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 콜라겐 뚜껑이 셀 채워진 콜라겐 금형에 부착 한 후, 겔 위에 유리 커버 슬립 위에 천천히 ~ 2-2.5 ㎖의 세포 배양 배지를 분배. 문화 1~3일 37 ° C에서 샘플. 노트:24 시간 후 초기 시드, 상피 조직은 예컨대 상피 성장 인자 (EGF) 또는 분지를 유도하는 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 성장 인자로 처리 될 수있다. </li></ol> 4. 면역 형광 및 이미지 분석 <ol><li> 조직 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고, 세포 - 함유 겔을 커버하기에 충분한 고정 제 용액을 추가한다. 200 rpm에서 진탕 기에서 15 분간 실온에서 인큐베이션 요리. </li><li> 상기 고정 제를 흡인 1X PBS로 조직 배양 접시를 채우고, 200 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. 세 총 세척 두 번 반복합니다. </li><li> 조직 배양 접시에서 대기음 PBS와 훽스트 솔루션으로 대체 : 핵 레이블을합니다. 15-20 분 동안 실온에서 인큐베이션. FAK 또는 항체 검출 또 다른 마커 얼룩, 4.5 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 핵 라벨 솔루션을 기음과 세포 함유 g을 씻어단계 4.2에서와 같이 1X PBS로 3 회 ELS. 스테인드 샘플을 더 사용할 때까지 4 ℃에서 1X PBS에 저장 될 수있다. </li><li> , 대기음 PBS 조직 배양 접시에서 0.3 % PBST 300 ㎕를 추가하고 실온에서 15 분 동안 샘플을 부화 : 목적 단백질에 대해 염색한다. </li><li> 상기 PBS를 흡인 블로킹 완충액과 겔을 포함하고, ~ 실온에서 4 시간 동안 진탕 (200 RPM)에서 배양한다. </li><li> 대기음 블로킹 완충액 차 항체 용액과 겔을 포함하고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다. </li><li> 일차 항체 용액을 흡인 0.3 % PBST 용액을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다. PBST를 기음과 3-4 시간 동안 매 30 분을 반복합니다. </li><li> 반복 4.7 및 4.8, 이차 항체 용액으로 배양이 시간 단계를 반복합니다. 이차 항체 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 조직 배양 접시를 감싸. FINA 후리터의 세척, 염색 샘플을 추가로 사용할 때까지 4 ° C에서 1X PBS에 저장할 수 있습니다. </li><li> 샘플을 시각화하기 위해, 상피 조직의 중간면에 초점을 맞춘 10X / 0.30 NA 목표를 사용합니다. </li><li> 세포 핵, UV 조명 아래 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 핵 마커로 표지 이미지 고정 샘플을 시각화합니다. </li><li> 거꾸로 형광 현미경에 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 관심의 단백질, 이미지 스테인드 샘플을 시각화합니다. </li><li> 동일한 초기 형상의 다수의 조직 (보통 50 개 이상)의 단백질 염색 빈도 맵을 작성하려면, 먼저 반입 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지들의 각각은 (재료 참조), 8 비트 그레이 스케일로 변환한다. </li><li> 이러한 이미지 임계 값, 그레이 스케일 컷오프 지점을 정의하여 바이너리 (즉, 하프 톤 / 흑백)로 변환; 임계 값 아래 그레이 스케일 값은 검정색되고, 임계 값 위의 사람들은 흰색이된다. 그런 다음, 결합하나의 이미지 스택에 각 이진 이미지의 각. </li><li> 다음에, 적층 된 이미지를 등록 (즉, 일치하거나 일치) 분석 소프트웨어. 많은 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 무료로 사용할 수 등록 플러그인이 함께 제공됩니다. <ol><li> 다음 이미지의 정렬을위한 템플릿으로 스택 각 이미지를 사용하여, 전체 스택의 이미지는 전파에 의해 정렬되도록. 마지막으로, 오버레이 (프로젝트) 평균 강도에 기초하여 상기 화상 정렬 스택의 이미지는 픽셀 주파수지도와 단일 이미지를 형성한다. 이 이미지는 색으로 구분 선택 10, 11의 이미지 편집 소프트웨어를 사용 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

분지 형태 형성으로 알려진 분 지형 상피 조직의 발달이 세포 유래 물리적 및 환경 인자에 의해 조절된다. 유선에서, 형태 형성을 분기하는 집단 세포 이동이 나무와 같은 구조를 작성하는 가이드를 통해 반복적 인 과정이다. 첫 번째 단계는 분기 개시 신도 1,2- 다음 유관에서 기본 봉오리 형성된다. 주변의 기질에 분기의 침략은 사춘기에서 스테로이드 호르몬의 전신 릴리스에 의해 유도된다. 새 차 싹은 기존 지점의 끝에서 시작하고,이 프로세스는 상피 나무 (3)를 작성하고 있습니다. 많은 중요한 생화학 적 신호가 확인되었지만, 이러한 복잡한 발육 과정은 부족 안내 세포 생물학적 메커니즘의 포괄적 이해. 또한, 특정 단서의 영향에 대한 역학적 연구 체험관에서 해체하기가 어렵습니다생체 내에서 사항은, 같은 정확한 시공간 섭동과 측정은 자주 할 수 없습니다. 이러한 전체 기관 배양 차 organoids 및 세포 배양 모델로서 3 차원 배양 기술은, 체계적 조직 형태 형성 4-6 기본 메커니즘을 연구에 유용한 도구이다. 이러한 이동, 증식 및 분화를 비롯한 세포 다양한 행동에 기계적 힘 생화학 적 신호로서, 각각의 특정 요인의 영향을 결정하는데 특히 유용 할 수있다. 6 설계된 세포 배양 모델 특히 용이 섭동을 사용 각 셀 자신의 미세. 그러한 배양 모델은 A로 유도 할 때 일관성과 재현성 총칭 이전 브랜치를 형성 제어 3D 구조 모델 유방 상피 조직을 설계하는 미세 - 기반 접근 방식을 사용ppropriate 성장 인자. 모델의 주요 이점은 정확하게 조작하고 높은 통계적 신뢰도 기계적 응력 패턴, 물리적 및 생화학 적 요인의 효과를 측정 할 수있다. 이 기술은 함께 전산 모델링 이미 유선 상피 조직 및 다른 지형 7-11 상피의 정상적인 발전이 지침 물리적 및 생화학 적 신호의 상대적 기여도를 결정하는데 사용되었다. 여기서 설명하는 것은 용이 세포 외 기질 (ECM) 겔의 다른 형태로 확장 될 수있는 이러한 모델 조직을 만들기위한 구체적인 프로토콜 및 치료제의 시험을위한 잠재적 수단으로 작용한다.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS curing agent</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographically patterned silicon master</td><td>self-made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weigh boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-diameter Petri dishes</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium : Ham&amp;rsquo;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Curved stainless steel tweezers</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspended in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td></tr></tbody></table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

유방 상피 조직의 미세 일반 회로도 실험적인 작업 흐름을 요약 한 미세 가공 절차의 일반 개략도가도 1에 도시되어있다. 결과적으로 완전히 ECM 겔에 포함되는 동일 형상 및 간격의 상피 조직의 배열이다. 대표적인 실험 I가 4 ㎎ / ㎖의 농도로 소 콜라겐 겔 타입의 배양 EpH4 마우스 유방 상피 세포를 사용한다. 설계 조직의 최고 품질을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 기술은 밀접하게 따라야한다. 유형으로 성형 된 사각형 우물의 배열도 2A와 2B 쇼 낮은 높은 배율의 뷰 내가 세포 파종하기 전에 젤 콜라겐. 웰의 형상은 실리콘 마스터 기능의 형상에 의해 결정된다. 이 일을 들어하는 것이 중요하다똑바로 콜라겐의 전자 PDMS 몰드 캐비티의 형상이 왜곡되지 않도록.도 2c는 타입 직사각형 웰을 도시 I는 (과잉 세포가 콜라겐의 표면을 세정 한) 유방 상피 세포 충전 된 겔 콜라겐. 이 예에서, 각 200 μm의 × 50 μm의 구형도는 약 80-100 세포가 포함되어 있습니다. 성장 인자를 첨가하는 형태 형성을 유도 24시간 시딩 한 후, 조직은 형태 형성 분지 모델링 HGF 또는 EGF 같은 몇 일간 배양 한 성장 인자로 처리 될 수있다. 일반적으로, 분기 조기 성장 인자 자극 후 4시간으로 형성하기 시작한다. 그림 3a는 내가 24 시간 미세 시술 후 젤 콜라겐 유형 내에서 직사각형의 유방 상피 조직 대표 결과를 보여주고있는 CEL 후LS는 콜라겐과 서로 접착 하였다. 어떠한 분기 성장 인자를 첨가하기 이전에 관찰되지 않는다.도 3b는 10 ng를 / ㎖의 HGF를 첨가 한 후 24 시간 분파 행한 대표적인 직사각형 조직을 나타낸다. 이 경우, 가지 세포가 높은 기계적 응력 9 경력 (중반 대조적으로) 조직의 단부에서 발생한다. 동일한 초기 겔 동일 형상의 다수의 조직을 다음 높은 처리량 분석을 가능 지점 위치 및 분기 길이 인구 평균을 결정하는 묘화 될 수있다. 면역 형광 염색법은 단백질 지방화를 시각화 문화 모델의 조직 배열의 면역 형광 염색법은 우리가 높은 통계 신뢰와 조직 내에서 단백질의 현지화를 확인할 수 있습니다. 그림 4a는 파트 :를 보여줍니다초점 부착 키나제 (FAK)에 대한 스테인드 분기 직사각형의 유방 상피 조직에서 대의 적 결과. 동일 형상의 조직 빈도 맵을 생성하는 다른 단백질의 현지화뿐만 아니라 분지 활성과 비교할 수있는 조직 내에서 관심있는 단백질의 평균 공간 지역화를 시각화 할 수있다. 도 4b는 일반적으로 발생 분기 직사각형 조직의 짧은 끝에서 FAK 농축을 보여주는 50 조직에 대한 평균 FAK 염색의 주파수지도를 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> 그림 1. 도식 미세 가공 과정을 개설. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2. 미세 공정 중에 찍은 사진. (A) 저와 (B) 및 형식 직사각형 공동의 고배율 위상차 이미지는 나는 탄성 PDMS 몰드를 사용하여 만든 콜라겐. (A) 및 (B)에서 (C) 공동 부 유선 상피 세포로 채워진다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> 그림 3. 미세 조직 형태 형성 분기 거칩니다. 미세 후 대표 직사각형 조직 24 시간의 (A) 위상 콘트라스트 이미지입니다. (B) 재의 상 대비 이미지10 ng를 / ㎖의 HGF를 첨가 한 후 24 시간 분파 받아야 시작 presentative 직사각형 조직. 흰색 화살표는 새로 형성된 지점을 나타냅니다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> 미세 조직의 그림 4. 면역 형광 염색법. 분기 개시 후 유방 상피 조직에서 FAK에 대한 (A) 면역 형광 염색법. (B) (50) 조직의 평균 FAK 얼룩의 주파수지도. 스케일 바, 100 μm의. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K 조회수.  Princeton University.  이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다. 

비디오: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

연구

암 연구학

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ECM also participates in cell migration, proliferation, and differentiation. Fibroblasts are the main type of cells modifying ECM fiber arrangement and production. In cancer, CAFs (cancer associated fibroblasts) are in permanent activation status, participating in ECM remodeling, facilitating tumor cell migration, and stimulating tumor-associated angiogenesis, among other pro-tumorigenic roles. The objective of this method is to create a three-dimensional matrix with a fiber composition that is similar to in vivo matrices, using immortalized fibroblasts or human primary CAFs. Fibroblasts are cultured in pre-treated cell culture plates and grown under ascorbic acid stimulation. Then, fibroblasts are removed and matrices are blocked for further cell seeding. In this ECM model, fibroblasts can be activated or modified to generate different kinds of matrix, whose effects can be studied in cell culture. 3D matrices are also shaped by cell signals, like degradation or cross-linking enzymes that might modify fiber distribution. In this context, angiogenesis can be studied, along with other cell types such as epithelial tumor cells.

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. Fibroblasts are seeded in a pre-treated culture plate and stimulated with ascorbic acid for matrix generation. Matrices are decellularized and blocked to culture relevant cells (e.g., endothelial cells).

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

생체공학

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

<meta charset="utf8"></head><body>상피 세포와 섬유아세포 세포를 위한 첨단 2층 3D 공동 배양 시스템

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: PVA-PCL 나노섬유막을 사용한 3D 공동배양 시스템 발전

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...