Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem NIH (HL118532, HL120142, CA187692), der David &amp; Lucile Packard Foundation, der Camille &amp; Henry Dreyfus-Stiftung unterstützt wird, und der Burroughs Welcome Fund. ASP wurde teilweise durch eine Charlotte Elizabeth Procter ehrende Fellowship unterstützt.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Zur Herstellung einer 5 mg / ml - Lösung von Insulin, verdünnen das pulverisierte Insulin Lager mit 5 mM Salzsäure (HCl) in dH 2 O (500 mg Insulin in 100 ml Lösungsmittel). Herstellung von 100 ml Lösungsmittel durch 50 &amp; mgr; l konzentrierter HCl Zugabe zu 100 ml destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Um eine 1x PBS - Lösung machen, verdünnen das 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Stammlösung mit dH 2 O unter sterilen Bedingungen auf 1x. </li><li> Bereiten Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerlösung wie folgt: mischen Sie das PDMS-Präpolymer zusammen mit dem Härter in einem 10: 1 (w: w) Verhältnis. </li><li> Bereiten Sie die Zellkulturmedium wie folgt: zu 500 ml Lager Dulbecco modifiziertem Eagle Medium: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F-12), 10 ml sterilem fötalen Rinderserum (FBS), 500 ul Gentamicin Reagens und 500 &amp; mgr; l von 5 mg / ml Insulin. </li><li> Um die 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung zuzubereiten, 1% (w: V) Lösung Pulver von BSA PBS auf 1x und gründlich mischen. </li><li> Um eine 4 mg / ml-Lösung von neutralisiert Rinder-Typ vorbereiten I-Kollagen, fügen Sie 50 ul 10x Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) Puffer, 30 ul 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH), 30 &amp; mgr; l Zellkulturmedium und 400 ul Lager Kollagen zu einem gekühlten Mikrozentrifugen-Röhrchen von 1,5 ml. Mischen Sie langsam durch Pipettieren nach oben und unten; vermeiden Blasen einzuführen. Um alle Blasen zu entfernen, kurz die Mischung bei 4 ° C zentrifugiert werden. </li><li> Bereiten Sie eine Fixierungslösung um 16% Paraformaldehyd Verdünnung 1: 4 (v: v) in 1x PBS. </li><li> Bereiten Sie eine Kerne Markierungslösung durch den Bestand Kerne Markierungslösung verdünnt 1: 1000 (v: v) in 1x PBS. </li><li> Vorbereiten eines 0,3% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Detergens (PBST) Lösung, die durch Mischen von 1x PBS mit 0,3% (v: v) Waschmittel. </li><li> Bereiten Blocking-Puffer durch Verdünnen Ziegenserum 01.10 (v: v) in 0,3% PBST. </li><li> Bereiten eines primären Antikörperlösung für ein bestimmtes Protein von Interesse durch Verdünnen priMary Antikörper (beispielsweise Kaninchen-anti-focal adhesion kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in Blocking-Puffer. </li><li> Vorbereiten eines sekundären Antikörperlösung durch eine fluoreszierende Sonde konjugierte Antikörper verdünnt (beispielsweise Ziegen-anti-Kaninchen) 1: 1000 (v: v) in Blocking-Puffer. </li></ol> 2. Herstellung von Elastomer-Briefmarken für 3D-Mikrostrukturierung Hinweis: Elastomeres Stempel werden mit PDMS hergestellt. <ol><li> Machen Sie eine PDMS-Lösung im gleichen Verhältnis wie 1.3 in Schritt beschrieben und gründlich mischen. Platzieren der Mischung in einer Vakuumkammer für 15-30 min alle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischprozesses eingebracht wurden. </li><li> Gießen Sie die entgaste Lösung in eine Plastik wiegen Boot oder eine Petrischale mit einem Silizium-Master enthält, die lithographisch mit Eigenschaften der gewünschten Geometrie strukturiert wird. Für die besten Ergebnisse, heilen die PDMS-Lösung bei 60 ° C für ca. 12 Stunden. Hinweis: Die Silizium-Meister hochgradig anpassbar sind; Dieses Protokoll verwendet rechteckige Strukturen mit Abmessungen von 50&amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m Abstand 200 &amp; mgr; m voneinander entfernt. Die Silizium-Master können unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt werden. Kurz gesagt wird ein auf Epoxybasis Photoresist auf einem Siliciumwafer spinbeschichtet. Eine Maske, die gewünschten Stempel Funktionen Detaillierung ist auf der Oberseite des Photoresist beschichteten Wafer angeordnet, die dann mit UV-Licht ausgesetzt wird. Die gewünschten Eigenschaften, die nicht von der Maske blockiert werden dem Licht ausgesetzt und der Photoresist an diesen Stellen wird vernetzt, während der Rest der Photoresistschicht löslich ist, und kann weggespült werden. </li><li> Nachdem das PDMS um die gewünschten Funktionen auf dem Silizium-Master ausgehärtet ist, entfernen Sie die PDMS und Master aus dem Plastikbehälter. Trennen Sie sorgfältig die PDMS aus dem Siliziumwafer und den Überschuss entfernen PDMS aus um die geprägten Merkmale einer sauberen Rasierklinge. </li><li> Schneiden Sie nun die PDMS gemustert mit aufgedrucktem Funktionen in einzelne rechteckigen Stempel (~ 8 mm x 5 mm) mit einer Rasierklinge. Bewahren Sie diese Funktion Seite nach oben in einem cleein 100-mm-Durchmesser Petrischale. </li><li> Darüber hinaus verwenden die PDMS-Lösung 1.3 in Schritt beschriebenen Träger für die rechteckigen Stempel zu machen. </li><li> Verwendung einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung, verteilt ~ 2-3 g des PDMS-Lösung gleichmäßig auf einer 100-mm-Durchmesser-Petrischale und härten die PDMS für ~ 12 Stunden bei 60 ° C, wie in Schritt 2.1. Dann mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die dünne Schicht aus PDMS in Rechtecke (~ 5 mm x 2 mm). Hinweis: Zwei Stützen für jeden PDMS-Stempel in 2.3 Schritt gemacht benötigt werden. Die Träger können in der 100-mm-Durchmesser-Petrischale aufbewahrt werden, die die PDMS-Stempel enthält. </li><li> Bevor die PDMS-Stempel und Träger können für die Zellkultur verwendet werden, Sterilisieren durch Eintauchen in 70% Ethanol und trocken unter Verwendung eines Aspirator in einer biologischen Sicherheit Schrank (Zellkulturhaube). </li></ol> 3. Herstellung von 3D-Epithelgewebe <ol><li> In einem Biosicherheitsschrank, fügen Sie oben auf jeder Stempel einen Rückgang von etwa 50 &amp; mgr; l von 1% BSA in PBS. Legen Sie die Tröpfchen bei 4 ° C bedeckt Briefmarken für einen Minimum von 4 h, um sicherzustellen, dass das BSA an die Oberfläche des Stempels adsorbiert. </li><li> Absaugen BSA-Lösung aus den PDMS-Stempel. </li><li> Waschen der Oberflächen der zwei Mal mit Zellkulturmedium Tempel (50 &amp; mgr; l pro Wasch pro Stempel sollte ausreichend sein) und nach jeder Wasch Absaugen. </li><li> Behandeln Sie die sterilisierten PDMS-Stempel und Träger mit gebogenen Pinzette aus rostfreiem Stahl. In einem Biosicherheitsschrank, legen Sie ein 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale für jeden Stempel PDMS. In jedem Gericht, legte sich zwei PDMS unterstützt durch einen Abstand, der etwas kleiner als die Länge der Stempel PDMS getrennt. </li><li> Mit Hilfe der Pinzette, sterilisieren, so viele kreisförmige Glasplättchen (15 mm Durchmesser, # 1), da PDMS-Stempel unter Verwendung von 70% igem Ethanol sind. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Deckgläsern, während sie mit der Pinzette zu halten. Bewahren Sie die gewaschenen Deckgläser in einem separaten 100-mm-Durchmesser Petrischale. </li><li> Dispense ~ 50 &amp; mgr; l der Kollagenmischung zu gleichmäßig zu beschichten die Oberfläche jedes PDMS-Stempel. </li><li> Abholenjeweils mit Kollagen beschichteten PDMS-Stempel mit der Pinzette und invertieren sie sanft. Senken die invertierten Stempel auf der Oberseite des PDMS unterstützt gelegt in 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturklöpper, so dass das Kollagen zwischen dem Stempel und dem Boden der Gewebekulturschale ist. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Dispense ~ 50 &amp; mgr; l der verbleibenden Kollagenmischung auf jede der kreisförmigen Deckgläser (später, werden diese auf der Oberseite der engineered Gewebe platziert werden, um sie vollständig in Kollagen einkapseln) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Besorgen Sie sich einen 100-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale mit Epithelzellen (ex. EpH4 Maus Brustepithelzellen) bei ~ 40% Konfluenz. Absaugen Zellkulturmedium und wäscht einmal mit 10 ml 1x PBS. 2 ml Trypsin zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C für 5-10 min. </li><li> 8 ml frisches Kulturmedium auf die Gewebekulturschale mit Trypsin behandelt Zellen enthält, löst alle verbleibenden adhärenten Zellen von der Schale. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und bewegen Sie das Zellgemisch in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. </li><li> Absaugen Überstand aus dem konischen Rohr und Resuspendieren des Zellpellets in Zellkulturmedium. unter Verwendung eines Hämozytometers zählen die Zellen die Konzentration der Suspension zu bestimmen. Stellen Sie das Suspensionsvolumen um eine Endkonzentration von ~ 10 6 bis 10 7 Zellen / ml zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die gelierte Kollagenproben aus dem Inkubator. Mit der Pinzette, heben Sie vorsichtig die PDMS-Stempel gerade nach oben, sie aus dem geformten Kollagen zu lösen und sie zu verwerfen. </li><li> Dispense ~ 30 &amp; mgr; l der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengel Formhohlräume der gewünschten Geometrie enthält. Beachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop mit einem Objektiv 10x / 0,25 NA , während sanft die Gerichte Seite Schütteln zur Seite Zelle zu fördern innerhalb der Hohlräume nieder. Die Hohlräume sollten innerhalb von ca. 5 min gefüllt werden. </li><li> Um reMove die Hohlräume überschüssige Zellen aus der Umgebung, neigen jedes Schalenkultur Gewebe auf seiner Seite und sanft verzichtet ~ 400 &amp; mgr; l Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Saugen Sie die Flüssigkeit, und wiederholen Sie den Wasch 1-2 weitere Male, die Kollagen-Gelen unter dem Mikroskop in zwischen jeder Wäsche zu überprüfen. </li><li> Nachdem die überschüssigen Zellen aus um die Zelle gefüllten Hohlräume in der Kollagenform gelöscht wurden, legen die Gewebekulturschalen in einer Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min. Dann mit der Pinzette vorsichtig umdrehen, die mit Kollagen beschichteten Klasse Deck und legen Sie sie auf der Oberseite der Zelle gefüllten Kollagen Formen, so dass das Kollagen aus den Deckgläsern bildet eine Kappe über den Zell gefüllte Hohlräume. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Sobald die Kollagenkappen an die Zelle gefüllten Kollagen Form anhaften, verzichtet ~ 2-2,5 ml Zellkulturmedium langsam über das Deckglas auf der Gele. Kultur die Proben bei 37 ° C für 1-3 Tage. Hinweis:24 h nach der anfänglichen Aussaat können die epithelialen Geweben mit Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) behandelt Verzweigung zu induzieren. </li></ol> 4. Immunofluoreszenz und Bildanalyse <ol><li> Saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Gewebekulturschalen und fügen Sie genug Fixierungslösung, die zellhaltigen Gelen zu decken. Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Saugen Sie das Fixiermittel, füllen Sie die Gewebekulturschalen mit 1x PBS und Inkubation für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li> Zur Kennzeichnung der Kerne: absaugen PBS aus der Gewebekulturschale und ersetzen mit Hoechst Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15-20 min. Um FAK oder einen anderen Marker Fleck, der mit Antikörper nachweisbar ist, überspringen 4,5 Schritt. </li><li> Saugen Sie das Kernmarkierungslösung und waschen Sie die Zellen enthaltende gels dreimal mit 1x PBS, wie in Schritt 4.2. Befleckten Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li><li> Um sich für ein Protein von Interesse Fleck: absaugen PBS aus den Gewebekulturschalen, fügen Sie 300 ul 0,3% PBST und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Saugen Sie das PBS, decken Sie die Gele mit Blocking-Puffer und Inkubation auf einem Schüttler (200 UpM) bei Raumtemperatur für ca. 4 Std. </li><li> Saugen Sie den Blockierungspuffer, decken Sie die Gele mit primären Antikörperlösung und bei 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler inkubiert. </li><li> Aspirieren die primäre Antikörperlösung, Zugabe von 0,3% PBST-Lösung und Inkubieren auf einem Schüttler bei 200 rpm für 30 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PBST und wiederholen Sie alle 30 min für 3-4 Std. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8, diesmal mit der sekundären Antikörperlösung inkubiert. Wickeln der Gewebekulturschalen mit Aluminiumfolie gegen Ausbleichung des sekundären Antikörpers zu verhindern. Nach dem final Wäsche, Bunt Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li><li> Um Proben zu visualisieren, verwenden Sie einen 10X / 0,30 NA - Objektiv auf der Mittelebene der epithelialen Geweben konzentriert. </li><li> Zur Visualisierung Zellkerne, Bild fixierten Proben mit einem nuklearen Marker markiert mit einem 10x / 0,30 NA - Objektiv unter UV - Beleuchtung. </li><li> Zur Visualisierung Proben für ein Protein von Interesse gefärbt, Bild ein 10x / 0,30 NA - Objektiv auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Um Frequenz Karten von Proteinfärbung von mehreren Geweben erstellen (in der Regel 50 oder mehr) von identischen Ausgangsgeometrie, erste Import jedes der Bilder Standardbildanalyse-Software (siehe Materialien) und wandeln sie in 8-Bit-Graustufen. </li><li> Um Schwelle dieser Bilder, wandeln sie in binäre (dh Halbton / schwarz und weiß) durch ein Grau Cutoff - Punkt definieren; Grauwerte unterhalb der Schwelle schwarz werden, und diejenigen, oberhalb der Schwelle werden weiß. Dann kombinierenjedes der einzelnen binären Bilder in einer einzigen Bildstapel. </li><li> Als nächstes registrieren die gestapelten Bilder (dh ausrichten oder sie entsprechen) in der Analyse - Software. Viele Bildanalyse-Software-Pakete sind mit einem frei verfügbaren Registrierung Plugin. <ol><li> Verwenden, um jedes Bild in einem Stapel als Vorlage für die Ausrichtung des nächsten Bildes, so dass die Bilder in dem gesamten Stapel werden durch Ausbreitung ausgerichtet sind. Schließlich Overlay (Projekt) werden die Bilder in der ausgerichteten Bildstapel auf mittlere Intensität anhand eines einzelnen Bildes mit einer Pixelfrequenz Karte zu bilden. Dieses Bild kann dann farblich gekennzeichnet sein Bildbearbeitungssoftware der Wahl 10,11 verwenden. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung 1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und dieser Prozess wird fortgesetzt 3 eine epitheliale Baum zu erstellen. Obwohl viele wichtige biochemische Signale identifiziert wurden, ein umfassendes Verständnis der zellbiologischen Mechanismen, die diese komplexen Entwicklungsprozess führen derzeit fehlt. Darüber hinaus sind mechanistische Studien über die Einflüsse der spezifischen Signale nur schwer von Erfah zu dekonstruierenrungen in vivo sind so präzise Raum - Zeit - Störungen und Messungen oft nicht möglich. Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken, wie beispielsweise Vollorgankultur, primäre Organoiden und Zellkulturmodellen, sind nützliche Werkzeuge für die systematische Untersuchung der Mechanismen , darunter liegende Gewebe - Morphogenese 4-6. Dies kann besonders nützlich sein für die Bestimmung der Einflüsse von spezifischen Faktoren einzeln, wie mechanische Kräfte und biochemische Signale auf einer Vielzahl von Zellverhalten, einschließlich der Migration, Proliferation und Differenzierung. 6 Engineered Zellkulturmodellen, insbesondere leicht die Störung ermöglichen von einzelnen Zellen und deren Mikroumgebung. Eine solche Kulturmodell verwendet einen Mikro-basierten Ansatz Modell mammaepithelialen Gewebe zu konstruieren mit 3D-Struktur gesteuert, die konsistent und reproduzierbar Zweige bilden, die gemeinsam wandern, wenn sie mit dem eine induzierteppropriate Wachstumsfaktoren. Der große Vorteil des Modells ist die Fähigkeit, genau zu manipulieren und die Auswirkungen der physikalischen und biochemischen Faktoren, wie beispielsweise Muster der mechanischen Beanspruchung mit hoher statistischer Sicherheit messen. Diese Technik, die zusammen mit Computermodellierung, wurde bereits verwendet 7-11 die relativen Beiträge der physikalischen und biochemischen Signale in der Leitung von der normalen Entwicklung der Brust-Epithelgewebe und anderen verzweigten Epithelien zu bestimmen. Dargestellt ist hier ein detailliertes Protokoll für diese Modellgewebe Gebäude, das leicht auf andere Arten von Zellen und extrazellulären Matrix erweitert werden kann (ECM) Gele, und die dazu dient, als mögliches Instrument für die Prüfung von Therapeutika.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS curing agent</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographically patterned silicon master</td><td>self-made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weigh boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-diameter Petri dishes</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium : Ham&amp;rsquo;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Curved stainless steel tweezers</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspended in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td></tr></tbody></table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Allgemeines Schema von mammaepithelialen Gewebe Mikro Eine allgemeine schematische Darstellung der Mikrofabrikationsverfahren des experimentellen Arbeitsablauf umreißt in Abbildung 1 dargestellt ist. Das Ergebnis ist ein Array von Epithelgewebe identischer Geometrie und den Abstand, der in einer ECM - Gel vollständig eingebettet sind. Ein repräsentatives Experiment verwendet EpH4 Maus-Mamma-Epithelzellen kultiviert in einem Gel von bovinem Typ I bei einer Konzentration von 4 mg / ml Kollagen. Um die höchste Qualität von technischen Geweben zu gewährleisten, skizzierte die Techniken in dem Protokoll sollten genau verfolgt werden. Die Figuren 2A und 2B zeigen niedrige und hohe Vergrößerung Ansichten von Anordnungen von rechteckigen Vertiefungen , die in eine Art geformt wurden , I - Kollagen - Gel vor der Zellaussaat. Die Form der Vertiefungen ist durch die Form der Merkmale auf dem Silizium-Master bestimmt. Es ist wichtig, th zu hebene PDMS - Form vom Kollagen gerade nach oben , um nicht die Hohlraumgeometrie zu verfälschen. 2C zeigt rechteckige Vertiefungen in einer Typ - I - Gel - Kollagen , das mit Brustepithelzellen gefüllt wurden (überschüssigen Zellen wurden , um die Oberfläche des Kollagens abgewaschen). In diesem Beispiel jeweils 200 &amp; mgr; m x 50 &amp; mgr; m rechteckige Vertiefung enthält etwa 80-100 Zellen. Zugabe von Wachstumsfaktoren induziert Morphogenese 24 Stunden nach der Aussaat, können die Gewebe mit Wachstumsfaktoren wie HGF oder EGF kultiviert und über mehrere Tage behandelt zu modellieren Morphogenese Verzweigung. Typischerweise Zweige schon 4 Stunden nach Wachstumsfaktor - Stimulation zu bilden beginnen. 3A zeigt repräsentative Ergebnisse aus rechteckigen Brustepithelzellen Gewebe innerhalb eines Typ - I - Gel 24 Stunden nach dem Mikrofabrikationsverfahren Kollagen, wonach cells haben an das Kollagen und miteinander verklebt. Keine Verzweigungen werden vor der Wachstumsfaktor - Zugabe beobachtet. 3B zeigt eine repräsentative Rechteckgewebe , das 24 Stunden nach der Zugabe von HGF bei 10 ng / ml unterzogen wurde Verzweigung. In diesem Fall treten Verzweigungen an den Enden der Gewebe (im Gegensatz zu der Mitte gegenüber ), wo die Zellen den höchsten mechanischen Belastungen 9 auftreten. Mehrere Gewebe identischer Ausgangsgeometrie in dem gleichen Gel kann dann abgebildet werden, um Bevölkerung Mittelwerte der Zweigstelle und Astlänge bestimmen, Hochdurchsatzanalyse zu ermöglichen. Immunfluoreszenzanfärbung Proteinlokalisierung zu visualisieren Immunfluoreszenzfärbung der Gewebe - Arrays im Kulturmodell ermöglicht es uns , Proteinlokalisierung innerhalb eines Gewebes mit hoher statistischer Sicherheit zu bestimmen. 4A zeigt Vertresentativen Ergebnisse aus einer Verzweigung gefärbten rechteckigen mammaepithelialen Gewebe für focal adhesion kinase (FAK). Erstellen von Frequenz Karten von Geweben von identischer Geometrie können die mittlere räumliche Lokalisierung von Proteinen von Interesse in den Geweben zu visualisieren verwendet werden, die auch als Verzweiger Aktivität zur Lokalisierung von anderen Proteinen verglichen werden können. 4B zeigt eine Frequenzkarte von durchschnittlich FAK Färbung für 50 Gewebe zeigt FAK Anreicherung an den kurzen Enden der rechteckigen Gewebe, wo in der Regel tritt Verzweigung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische umreißt die Mikrofabrikationsverfahren. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2. Bilder während der Mikrofabrikationsprozess genommen. (A) Low und (B) und hoher Vergrößerung Phasenkontrastbilder von rechteckigen Hohlräumen in Kollagen Typ I eine elastomere PDMS - Form erstellt wurden. (C) Cavities von (A) und (B) werden mit Brustepithelzellen gefüllt. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> Abbildung 3. mikrofabrizierten Gewebe allerdings Verzweigung Morphogenese. (A) Phasenkontrastbild eines repräsentativen rechteckigen Gewebe 24 Stunden nach der Mikrofertigung . (B) Phasenkontrast - Bild eines Wiederpresentative rechteckigen Gewebe, das 24 Stunden nach der Zugabe von HGF bei 10 ng / ml unterzogen wurde gestartet Verzweigung. Weiße Pfeile zeigen neu Zweige gebildet. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung mikrofabrizierter Gewebe. (A) Immunfluoreszenzfärbung für FAK in einem mammaepithelialen Gewebe nach der Verzweigung Initiation. (B) eine Frequenzverteilung der durchschnittlichen FAK - Färbung in 50 Geweben. Maßstabsbalken, 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Aufrufe.  Princeton University.  Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten. 

Serie: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Forschung

Krebsforschung

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ECM also participates in cell migration, proliferation, and differentiation. Fibroblasts are the main type of cells modifying ECM fiber arrangement and production. In cancer, CAFs (cancer associated fibroblasts) are in permanent activation status, participating in ECM remodeling, facilitating tumor cell migration, and stimulating tumor-associated angiogenesis, among other pro-tumorigenic roles. The objective of this method is to create a three-dimensional matrix with a fiber composition that is similar to in vivo matrices, using immortalized fibroblasts or human primary CAFs. Fibroblasts are cultured in pre-treated cell culture plates and grown under ascorbic acid stimulation. Then, fibroblasts are removed and matrices are blocked for further cell seeding. In this ECM model, fibroblasts can be activated or modified to generate different kinds of matrix, whose effects can be studied in cell culture. 3D matrices are also shaped by cell signals, like degradation or cross-linking enzymes that might modify fiber distribution. In this context, angiogenesis can be studied, along with other cell types such as epithelial tumor cells.

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. Fibroblasts are seeded in a pre-treated culture plate and stimulated with ascorbic acid for matrix generation. Matrices are decellularized and blocked to culture relevant cells (e.g., endothelial cells).

Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Biotechnik

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

Rekonstitution der Zytoarchitektur und Funktion von humanem Epithelgewebe auf einem offenen Organchip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fortschrittliches zweischichtiges 3D-Co-Kultursystem für Epithel- und Fibroblastenzellen

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von 3D-Cokultur-Systemen mit nanofaserigen PVA-PCL-Membranen

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...