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이 논문은 단핵 세포의 미성숙 moDCs, tolerogenic moDCs 성숙한 moDCs에서 생성하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계들은 다음 단락에서 자세히 설명한다. 이는 인간 말초 혈액이 프로토콜 및 실시되어야 인간의 혈액 처리를위한 범용주의에서 출발 물질로서 사용하는 것이 중요하다. 그 인간 (24)에 골수 수지상 세포를 유도하기 위해 기술적으로 가능하지만, 말초 혈액에서 발견 된 세포에서 시험 관내 DC 분화 인해 골수에 비해 말초 혈중의 이용에 바람직하다. 말초 혈액에서 발견 된 세포 중에서 CD34 + 조혈 줄기 세포 및 단핵구는 일반적으로 수지상 세포의 시험 관내 생성을 위해 사용된다. 조혈 CD34는 + 세포가 다음 더 랑게르한스로 분화되어 따라 CD1a + 및 CD14 + 서브 세트를 유도하는 GM-CSF와 TNF-α와 배양 줄기세포와 수지상 세포 등을들 수있다. 반면, 단핵구는 미성숙 moDCs를 생성하는 GM-CSF 및 IL-4에서 배양한다. 여러 프로토콜은 말초 혈액에서 단핵 세포의 농축에 사용됩니다; 예를 들어, 플라스틱 접시, 세광과 분리 키트 (25), (26)을 준수하여 준수 프로토콜의 장점은 세포에 최소한의 손상이며, 상대적으로 그러나 순도가 손상 될 수 있습니다 세포 비용 효과적.; 및 추가 단계가 추가 실험을 위해 세포를 분리 할 필요가있다. 세광은 크기 및 밀도에 기초하여 세포를 분리하는 기술이다. 세광의 장점은 세포 생존하고 단핵구 쉽게 추가 실험을 위해 사용될 수있다; 그러나이 기술은 elutriator의 가용성과 유사한 침강 파라미터와 다른 세포 집단 (T 세포 및 단핵 세포)를 분리 할 수​​ 없다는 의해 제한된다. 시판 분리 키트 중 하나를 긍정적으로 선택 자성 마이크로 비드를 이용하거나부정적인 단핵구 인구를 선택합니다. 분리 된 단핵 세포는 (마커 또는 마이크로 비드에 구속되지 않음) &quot;그대로&quot;남아있는 일부 프로토콜은 음의 선택을 사용 단핵구 분리를 향해 바이어스된다. 이 프로토콜에서, CD14 구슬은 PBMC를 긍정적 인 선택 인간 단핵 세포를 사용 하였다. CD14는 세포질 도메인 부족과 CD14에 항체의 결합 신호 전달을 유발하지 않습니다. 또한, 마이크로 비드는 분화 과정을 방해하지 않는, 따라서 문화 후 단핵 세포에서 분리 한 것입니다. 또한, CD14 가장 강하게 단구와 약 호중구 및 일부 골수 수지상 세포, 다른 방법 (17)보다 순도 세포 분리의 결과에 따라서,이 방법을 나타낸다. 혈액 단핵 세포는 수지상 세포 나 대 식세포로 분화 될 수 있으며, 단핵 세포의 운명은 크게 사이토 카인 환경에 따라 달라집니다. 본 논문에서는 moDCs는 (GM을 과립구 - 대 식세포 콜로니 - 자극 인자를 첨가함으로써 생성된다-CSF) 인간 말초 혈액 단핵 세포에 인터루킨 4 (IL-4). GM-CSF는 단핵구 생존 및 IL-4 마크로파지 분화 억제 활성을 나타낸다 필요; 및 단핵구에 GM-SCSF 및 IL-4의 조합 또한 개별 사이토킨 27 비교 미성숙 moDCs 높은 백분율을 얻었다. 말초 혈 단핵구 28, 29, 30, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터페론 알파 (IFN-α) 및 인터루킨 13 (IL-13)을 첨가하여 moDCs를 생성하는 다른 프로토콜들이있다. GM-CSF와 IL-4의 결합은 이제 면역 원성 또는 tolerogenic moDCs로 분화하고받은 Th1, TH2 또는 Th17 홍보 moDCs에 편광 플라스틱 미성숙 수지상 세포를 생성하는 허용 프로토콜을 1990 년대에 최적화되었다. 미성숙 moDCs 비타민 D3와 덱사 메사 존의 첨가에 의해 tolerogenic moDCs로 분화된다. 예를 들어 tolerogenic의 수지상 세포를 생성하는 여러 가지 프로토콜을 통해있다핵 인자 - 카파 B (NF-kB) 억제, β 카테닌의 활성 비타민 D3, 덱사메타손 및 라파 마이신 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. 형 비타민 D3와 덱사 메사 존 모두 수지상 개별 약물을 사용하는 경우보다 더 큰 alloproliferation 억제 비타민 D3와 덱사 메사 존의 결과의 조합에 tolerogenic 효과를 유도하는 것으로보고되었지만. 따라서 tolerogenic 수지상 세포의 생성을위한 기존의 프로토콜은 비타민 D3와 덱사 메사 존의 조합으로 개질 하였다. 이 방법은 현재 치료 유틸리티 인간 tolerogenic 수지상의 모델로 인정되고있다. 재구성 비타민 D3 및 덱사메타손 짧은 수명을 가지고주의하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에서, 리포 다당류 (LPS)는 DC 성숙 유도제로서 첨가 하였다. 미성숙 moDCs은 염증성 칵테일을 사용하여 성숙을 유도 할 수있다 :(TNF-α), 인터루킨 1 베타 (IL-1β), 인터루킨 6 (IL-6) 및 프로스타글란딘 E2) 또는 전 염증성 사이토 카인 (TNF-α 및 인터페론 감마 (IFN-Γ)). 염증성 칵테일 높은 공동 자극과 이동성 기능을 가진 성숙한 moDCs를 생성하지만 그들은 IL-12 (38)의 상대적으로 낮은 수준을 생산하고 있습니다. TNF-α 또는 IFN-Γ 단독 안정한 표현형 돌기 (39)를 유도 할 수 없다. LPS는 수신자 같은 수용체 4 (TLR4)를 자극 DC 성숙을 유도하는 NF-kB와 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPKs)의 활성화를 매개한다. LPS에 의해 유도 DC 성숙은 DC 성숙 마커 (CD83, CD86, HLA-DR)의 업 규제를 보여주고 또한 IL-12p70의 생산되었다. 또한,이 단계는 또한 임상 암 백신 성숙한 수지상 세포를 제조 TLR3 작용제와 LPS 페어링하도록 변형 될 수있다. 본 논문에서는 tolerogenic 수지상 세포는 LPS 처리에 따라 성숙에 강한 것으로 표시됩니다. 이 DC가 면역 원성이 아니며 relea을하지 않는 것처럼 세미 - 성숙그 자체로는 염증성 사이토 카인 (40). 이 프로토콜의 제한은 분화 과정에서 거짓말. 이 과정은 높은 처리량 분석에 적용 할 수있는 어려움을 포즈 주 7 일 0 8 일이 소요됩니다. 프로토콜에서의 수정은 분화 과정을 단축 아직 다른 상태에서 실행 가능한 DC가 높은 숫자를 산출 할 필요가있다. 둘째, DC가이 프로토콜의 사이토 카인의 첨가에 의해 생성되고 이러한 사이토 카인은 오랜 기간 동안 DC 인구를 유지하지 않습니다. 또한, 사이토 카인 농도로 생체 내에서보다 훨씬 더 사용되며 생체 내 수지상 세포에 생리 학적으로 동일하지 않은 경로의 바이어스 개발 될 수 있습니다. DC 전구체의 시험 관내 배양 물, 예를 들어 생체 내에서 통상 41 DC 분화 필수적인 사이토킨 아니다 GM-CSF에 반응하는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 사이토 카인의 자극은 유전자에 유용한 방법이 될 수 있습니다실험에 대한 시험 관내에서 DC의 높은 숫자를 평가. 이러한 면역 형광 염색 등의 분석이 프로토콜에서 발생하는 이러한 세포를 대상 유동 세포 계측법 할 수있는 능력은,여보세요 반응 연구 및 대사 연구는이 방법의 유용성을 증가시킨다. 이 시험관의 DC는 생체 내 수지상의 희귀 번호와 함께 할 이전에 어려운 DC 개발, 성숙과 항원 제시의 지식을 향상시킬 수있는 좋은 모델이 될. 허용 오차에 비해 면역 면역을 조절하는 DC의 능력은 그들에게 암과자가 면역 질환 42, 43, 44, 45에 대한 치료제의 매력적인 후보를합니다. 이 프로토콜에서 발생하는 면역 원성 수지상은 감염성 질환 및 종양에 대한 백신 접종의 효능을 향상시키기 위해 사용될 수있다; tolerogenic 수지상 원치 않는 T 세포 반응을 제어하고 다음의 이식 거부를 방지하는데 사용될 수있다. 복잡한면역 관용의 균형은 DC 분화 상태에 상당히 의존한다. DC 차별화 여러 신호 전달 경로 및 신진 대사 운명의 적용을받습니다 조정 된 셀룰러 프로그램입니다. DC의 다른 차별화 상태는 생체 에너지 및 생합성의 요구에 차이가; 상태를 휴식에 DC가 비교 예를 들어, 활성화 된 수지상 세포 생존 및 마이그레이션을위한 중요한 더 많은 에너지 대사 적응을 필요로한다. 이것은 비타민 D3, 덱사메타손 및 라파 마이신이 tolerogenic 수지상 세포를 유도하는 능력에 대해 알려진 것이 중요하다 DC 대사에 영향을 설명 하였다. 본 논문에서는 서로 다른 분화 상태에서 moDCs의 에너지 대사는 세포 외 플럭스 분석기를 사용하는 것을 특징으로하고 tolerogenic moDCs 가장 높은 신진 대사 소성 및 LPS 유발 성숙이 가소성을 감소 보였다. 이화 대사에 영향을 tolerogenic DC (46)을 기능하는 동안 근육 대사는 DC의 성숙을 지원합니다. 수지상이 프로토콜에서 생성 된 치료제에 내성 및 허용 오차를 수정하는 열쇠를 쥐고 수지상 세포의 신진 대사 상태를 변경 여부를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 DC가 &#39;면역 기능을 연구하는데 중요한 미성숙, tolerogenic 성숙 moDCs의 생성을위한 프로토콜을 제시했다.

Jolles 1 참조하고 전문적인 항원 제시 세포 2로 인정 1973 년 랄프 된 Steinman과 Zanvil 콘을 특징으로 DC 먼저 19 세기 후반에 폴 랑게르한스 (랑게르한스 세포)에 의해 설명되었다. 수지상 세포는 말초 혈액에서와 같은 (랑게르한스 세포와 같은 현재) 피부로와 활성화 코, 폐, 위의 라이닝과 내장의 외부 환경에 노출 된 조직에 특히 풍부한 몸, 대부분의 조직에서 발견된다 그들은 외부 항원을 발생합니다. 미성숙 수지상 세포는 T 세포 (3)을 자극하는 세포 내 이입 능력이 있지만, 상대적으로 낮은 용량을 가지고있다. 미성숙 수지상 세포는 다양한 패턴 인식 수용체 (PRRS) 캡처 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)를 4 표현한다. 자기 분자가 T 세포 unresponsivene 될 동안 활성화 위험 신호 원성 수지상으로 성숙 이용시SS 및 세포 사멸 5. 면역 원성 수지상 세포는 MHC 분자와 공동 자극 표면 분자 및 주요 나이브 T 세포 6,7에 자신의 능력의 상향 조절을 특징으로한다. 미성숙 수지상 세포는 비타민 D3 대사 산물 (1A), 25 (O)이 D (3) 및 특정 면역 억제제 인터루킨 10 (IL-10) 등의 덱사메타손 및 8-9 라파 마이신에 반응 TREG 유도 또는 tolerogenic 상태 향해 숙성 될 수있다. Tolerogenic 수지상은 표면 수용체 및 리간드를 함유하는 면역 수용체 티로신 계 억제 모티프 (ITIMs)의 발현을 특징으로한다. tolerogenic 수지상에 ILT의 가족, ILT3 및 ILT4를 포함 ITIMs의 신호 전달은 alloproliferation을 억제 Foxp3의 + TREG 확장 (10, 11)를 구동한다. tolerogenic 수지상 세포의 이러한 독특한 특성은 생체 내에서 자신의 깊은 힘, 이식 된 동종 이식과 suppr에 내구성이 뛰어난 내성을 유도하는, 즉 능력으로 이어질자가 면역 질환의 발전을 ESS. Tolerogenic 수지상 세포는 면역 활성화의 억제 기능 성숙 편광 수지상의 하위 유형으로, 따라서 볼 수 있습니다. 형질 수지상 세포와 골수 수지상 12 : 현재, 인간의 말초 혈액에서 수지상 세포의 두 가지 일반적인 부분 집합이 있습니다. 순환 수지상 세포는 인간 혈액 중 백혈구의 2 % 미만으로 구성하는 희귀하고 이것은 그들의 면역 기능을 연구하는 수지상의 적절한 수의 분리에 어려움을 야기. 이 문제를 극복하기 위해, 단핵구 분화 된 수지상 세포는 수지상 세포의 기능 연구를위한 시험 관내 모델로서 사용된다. 이 시험관의 DC는 생체 내 수지상 세포에 비해 유사 수용체와 기능을 가지고 있습니다. 생체 내 수지상의 체외 생성 된 단핵구 유래 수지상 세포 (moDCs)에서 자세한 비교는 다른 실험실 13, 14, 15에 의해 조사한다. 또한 그 moDCs와 CD를보고1C + 수지상 세포는 항원 제시 및 T 세포의 기능 (15)을 유도에 상당 하였다. 본 논문에서는 말초 혈액 단핵 세포에서 미숙 moDCs를 생성 한 후 면역 원성 및 tolerogenic 수지상 세포로 분화하는 방법을 설명합니다. 이 단핵구 유래 수지상 세포 (moDCs)는 그 표면 마커, 사이토 카인 프로필, 면역 기능과 신진 대사 상태를 특징으로한다. 면역 원성 tolerogenic 수지상 세포는 동종 T 세포 또는 조절 T 세포 중 확대 될 다른 사이토 카인을 생산한다. 본 논문에서는 사이토 카인의 프로파일 링은 멀티 플렉스 기술을 사용하는 시스템으로 수행된다. 세포의 성장 매체는 항체 고정화 색상 코드 구슬 배양 및 소형 분석기에서 읽습니다. 수지상 세포의 대사 상태 당분 반영 산소 소모율, 세포 호흡의 지표 및 세포 외 산성화 속도를 측정 외 플럭스 분석기를 이용하여 분석수지상 세포에 플럭스. 이러한 생체 에너지 비율의 측정은 수상 세포 발달과 기능에 필수적인 세포 대사의 변화를 추적하는 수단을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>15 ml falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td><td>PBMC isolation</td></tr><tr><td>MACs kit</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Monocyte enrichment</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Monocyte enrichment</td></tr><tr><td>Cell culture grade water</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Phosphate&lt;br/&gt; Buffered Saline</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Vitamin D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>PerCP-conjugated HLADR&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD83&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD86&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>APC-conjugated CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated CD14&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE-conjugated BDCA3&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>APC-conjugated ILT3&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>Isotype matched&lt;br/&gt; PerCP- conjugated Mab</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>Isotype matched&lt;br/&gt; PE- conjugated Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>Isotype matched&lt;br/&gt; APC- conjugated Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>BD LSR II Flow Cytometer</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&amp;nbsp;</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>cytofix/cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>APC/CY7-conjugated CD25</td><td>BD pharmingen</td><td>557753</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PE/CY7-conjugated CD4</td><td>Biolegend</td><td>300512</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>PerCP-conjugated CD3</td><td>Biolegend</td><td>300428</td><td>Cytometry</td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Alloreaction study</td></tr><tr><td>EasySep magnet&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>Alloreaction study</td></tr><tr><td>Cell Trace CFSE cell proliferation kit</td><td>Molecular probes</td><td>C34554</td><td>Alloreaction study</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Alloreaction study</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Human&lt;br/&gt; Cytokine/Chemokine&lt;br/&gt; magnetic bead panel</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>Cytokine analysis</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene tube</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Cytokine analysis</td></tr><tr><td>Luminex Sheath Fluid&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Cytokine analysis</td></tr><tr><td>FLEXMAP 3D system with xPONENT software</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP 3D</td><td>Cytokine analysis</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Mitochondrial activity</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Mitochondrial activity</td></tr><tr><td>XF Assay Medium (OCR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102352-000</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>XF Base Medium (ECAR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&amp;nbsp;</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>XF Cell Mito Stress kit</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103015-100</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>XF Glycolysis Stress kit</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>Metabolic adaptation</td></tr><tr><td>Seahorse&amp;nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td>Metabolic adaptation</td></tr></tbody></table>

generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes

항원 비특이적 선천 면역 항원과 특정 적응성 면역계 사이의 복잡한 상호 작용으로부터 면역 반응 결과. 면역계는 분자 자체에 대한 내성을 유지하고 병원체에 빠르게 반응에서 일정한 균형이다. 수지상 세포 (DCS)는 적응 면역 시스템에 선천 면역 연결자가 아닌 자기의 적응 응답 균형 강력한 전문 항원 제시 세포이다. 성숙 신호에 따라, 미성숙 수지상 세포를 선택적으로 또는 면역 원성 tolerogenic 수지상 세포로 분화하도록 자극 할 수있다. 면역 수지상 세포 클론 확장 항원 특이 적 T 세포 증식에​​ 신호를 제공한다; tolerogenic 수상 세포는 항원 특이 적 T 세포 결실 또는 조절 T 세포의 클로 날 팽창에 의해 내성을 조절하면서. 이 때문에 고유 한 속성으로, 수지상 세포는 높은 암과자가 면역 dise 용으로 치료제 수요가있다ASE에. 수지상 세포는 시험관 내에서 특정 항원에 면역 원성 및로드 tolerogenic 모두 특정 면역 반응을 탑재 인체에 주입 할 수있다. 이 작품은 표면 마커의 발현, 기능과 신진 대사 표현형에 차이가 단핵 세포, 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포 (moDCs), tolerogenic 성숙 moDCs에서 체외에서 생성 할 수있는 수단을 제공한다.

단핵구 정화 및 수지상 세포 분화 단핵 세포는 CD14 + 미성숙 수지상 세포를 수득하는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 완전 배지에서 양성 선별 자기 분리 (도 1B) 배양 (이어서, 말초 혈액 (도 1a) 밀도 원심 분리 한 PBMC로부터 정제 된 도 2A). 비타민 D3 및 덱사메타손 후 GM-CSF와 IL-4를 첨가 tolerogenic moDCs (그림 2B)로 미성숙 moDCs의 분화의 결과. LPS는 성숙 (도 2D)에 대한 저항성을 확인 LPS로 자극 하였다 moDCs (도 2C) 및 tolerogenic moDCs 성숙 미성숙 moDCs의 성숙을 유도 하였다. 이 연구에 사용 된 혈액 샘플을 통보 이전에 건강한 공여자로부터 얻었다동의. moDC 특성 유동 세포 계측법에 의해 마커 특성 표면 DC 표면 마커 분석 성숙한 moDCs은 LPS 처리 tolerogenic moDCs, tolerogenic moDCs 미숙 moDCs (그림 3)에 비해 성숙 마커 HLA-DR, CD83 및 CD86의 가장 높은 수준을 표명 것으로 나타났다. 이러한 결과는 LPS 자극 다음 미숙 moDCs에 비해 tolerogenic moDCs가 성숙에 내성이 있다고 설명했다. 또한, tolerogenic moDCs를 LPS는 처리 및 tolerogenic moDCs은 미성숙과 성숙 moDCs에 비해 CD14, BDCA3 (CD141) 및 면역 글로불린 같은 성적 증명서 (ILT) 3의 발현 증가를 표시. 우리가 여기에서 생성 된 tolerogenic moDCs 이전 보고서 (23)과 일치한다. moDCs의 기능적 특성 성숙을위한 유도 moDCs은 면역 원성되고 CD4 + T 세포의 증식을 촉진 사이토 카인을 놓습니다. 우리는 공동 배양 된 T 세포의 증식을 측정함으로써 다양한 moDC 아형의 면역 원성을 평가 하였다. CD4 + T 세포의 낮은 alloproliferation (도 4a)에 도시 된 바와 같이 Tolerogenic moDCs는 성숙한 moDCs 비해 좋지 면역원이었다. Tolerogenic moDCs는 낮은 IFN-Γ CD4 + T 세포 (그림 4B)와 alloreaction 공동 문화, 낮은 IL-12p40, 높은 IL-10 사이토 카인 생산을 특징으로한다. 또한, 어른의 moDCs에 tolerogenic moDCs의 수를 증가 공동 배양 유도 allospecific CD4 + T 세포는 CD25 + 고 Foxp3를 조절 T 세포 (도 4C)의 주파수를 증가. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;FO : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 미토콘드리아 활동 분석 레드 CMXRos는 moDCs의 미토콘드리아 막 전위 레벨을 분석 미토콘드리아 활성을 반영하는데 사용된다. Tolerogenic moDCs는 다른 moDC 분화 아형 (도 5a)에 비해 높은 미토콘드리아 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. 다음에, 미토콘드리아의 산소 소모 속도 (OCR)는 bioanalyzer를 사용하여 다른 moDC 아형에 대해 평가된다. OCR 측정을 포함하지만 이에 기초 호흡, 호흡 공급 능력, 양자 누출 및 비 미토콘드리아 호흡에 한정되지 정보를 제공 대사 프로필 고해상도 통계를 허용한다. OCR의 측정은 스트레스에 반응하는 세포의 능력을 평가하는 수단을 제공한다. 세포는 대사 적으로 연속하여 세 가지 화합물의 첨가에 의해 교란된다. 첫 번째 주입은 올입니다ATP 합성을 억제하는 상기 전자 전달계 (ETC)의 복소 V 억제 igomycin (ATP 커플러). 이 단계는 ATP 합성에 소비되는 산소의 비율과 미토콘드리아 내막을 가로 질러 양성자 누설을 극복하기 위해 소비 된 산소의 비율을 구별한다. 두번째 주사는 않고, 미토콘드리아 막에 걸쳐 대신 미토콘드리아 막전위의 붕괴 에너지와 산소의 급속한 소모 리드 복합 V.의 양자 채널을 통해 수소 이온 운반에 의해 ATP 합성을 방해 FCCP (ETC 촉진제) 인 ATP의 생성. FCCP 처리는 세포의 예비 호흡 용량을 계산하는데 사용될 수있다. 스트레스 조건에서 예비 호흡 능력의 유지는 세포 생존에 중요하다. 이 용량은 등에 관여하는 효소의 기질의 가용성 및 기능 용량 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다 세 번째 주입 로테 논하는 COMPL의 조합예 내가 억제제 및 Antimycin A, 복잡한 III 억제제. 이 조합은 미토콘드리아 호흡을 종료하고 OCR은 미토콘드리아 기능 장애 (도 5C)의 결과로서 감소하는 것으로 관찰된다. Tolerogenic moDCs 성숙한 moDCs (그림 5D)보다 더 높은 기저 OCR 수준을 표시. 또한, tolerogenic은 LPS-tolerogenic, 미숙 moDCs 성숙한 moDCs (그림 5E)에 비해 예비 호흡기 용량을 증가 보였다. moDCs의 대사 특성 락트산 및 양성자 당분 동안 세포로부터 방출되기 때문에, 우리는 세포 외 산성화 (ECAR) (도 6b)의 속도를 실시간으로 분석을 행하여 moDCs 당분의 활성을 분석 하였다. 포도당의 존재하에 모든 moDCs의 당분 레이트와, 기저 단에 비해 증가미성숙 moDCs (그림 6D)보다 높은 당분 비율을 나타내는 성숙한 moDCs. Tolerogenic 미성숙 moDCs은 LPS 처리 moDCs (도 6b)와 비교하여 (글루코스의 존재에 의해 유도 oligomycin)보다 최대 해당 작용을 나타냈다. tolerogenic 미숙 moDCs의 당분 용량은 성숙 moDCs (그림 6E)보다 높았다. 높은 당분 속도는 대조적으로, 당분 예약 성숙한 moDCs (그림 6 층)에서 가장 낮았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> 그림 1 :. 말초 혈액에서 단핵구 정제 (A)는 혈액 25 ml를 조심스럽게 원심 분리 전에 50 ML 튜브 당 피콜 15 ml의에 적층된다. PBMC를는 밀도 원심 분리 후 플라즈마 아래 층에 집중된다. (B)는 PBMC를 접속사있는 마이크로 비드와 인큐베이션<html> 인간 CD14 항체 (이소 : 마우스의 IgG2a를) 단일 클론하는 비공 액. CD14 + 단핵 세포를 분리하는 분리기의 자기장에 배치 된 컬럼에로드 된 다음과 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> 그림 2 : moDCs의 형태 학적 특성. (A) GM-CSF 및 IL-4 중에는 200ng / ㎖ 미성숙 moDCs를 생성하는 0 일, 4, 6에서 정제 CD14 + 단핵 세포에 첨가되고; 및 (B) 100 nm의 비타민 D3와 5 일에 10 나노 덱사메타손과 자극의 추가 단계는 tolerogenic moDCs를 생성합니다. 미성숙 moDCs 및 tolerogenic moDCs은 (C)를 ​​생성 moDCs를 성숙 (D) LPS-tolerogenic moDCs하기 위해 6 일에 1 μg의 / ml의 LPS로 자극한다.ttps : //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> 그림 3 :. 유동 세포 계측법 tolerogenic의 표면 마커 HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3과 LT3의 발현 수준 (녹색), LPS-tolerogenic (검정), 미숙 (빨간색)에 의해 표면 마커 특성, 성숙 (파란색) moDCs. 아이소 타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다. 각 세포 유형에 대한 개별 히스토그램 형광 강도와의 겹쳐 X 축에 대해 로그 Y 축 세포 수를 플롯한다. 모든 히스토그램 네 번의 독립된 실험의 대표 값이다. 10.4049 / jimmunol.1303316 (2015년 6월 1일) :이 수치는 J Immunol 194 (11), 5174-5186, 도이에서 수정되었습니다. 재현 및 저작권 허가를 게시. 저작권 2015 년 미국 협회면역학, Inc.는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> 그림 4 : moDCs의 기능 특성. (A) tolerogenic의 증가 숫자와 공동 배양에 의해 유도 된 CD4 + T 세포의 alloproliferation 주파수의 정량 (TOL, 녹색), LPS-tolerogenic (L-TOL, 검정), 미숙 (IMM 적색)과 성숙 ​​(MAT 청색) moDCs. 데이터는 네 개의 독립적 인 실험으로부터 풀링시켰다 던넷 다중 비교 사후 테스트와 양방향 ANOVA로 분석 하였다 성숙한 moDCs 대 모든 moDCs 사이 + SEM 통계의 차이를 의미한다. IFN-Γ (왼쪽 패널), IL-12p40 (가운데 패널) 및 IL-의 (B) 사이토 카인 분석 10 (오른쪽 창하나 tolerogenic (녹색), 미숙 (빨간색) 또는 성숙 (파란색) moDCs의 수를 증가 공 배양 CD4 + T 세포 사이의 alloreactions에서 상층 액에서 리터). 데이터는 여섯 독립적 인 실험에서 풀링 된되었다; ± SEM (C) CD4 + T 세포와 alloproliferation tolerogenic moDCs의 수가 증가의 존재 하에서 성숙한 moDCs와 공 배양에 의한 조절 T 세포의 확장을 의미한다. 왼쪽 Y 축, CD4 + T 세포 증식의 주파수. 오른쪽 Y 축, CD25 + Foxp3의 높은 증식 성 CD4 + T 세포 상에 게이팅 셀의 주파수. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험으로부터 모으고; ± SEM을 던넷 다중 비교 사후 검사로 일방향 ANOVA로 분석 하였다 tolerogenic moDCs 부재 대 존재 간의 통계적 차이를 의미한다. (D) CD4 + T 세포 alloproliferation (왼쪽)와 CD25highFoxP3 + 세포의 주파수 (우) 공동에 의한 tolerogenic moDCs와 문화성숙한 moDCs의 수가 증가가 존재한다. 데이터는 세 개의 독립적 실험으로부터 모으고; 성숙한 moDCs의 부재가 던넷 다중 비교 사후 테스트와 양방향 ANOVA로 분석 하였다 대비 ± SEM에게 존재 사이의 통계적 차이를 의미한다. 10.4049 / jimmunol.1303316 (2015년 6월 1일) :이 수치는 J Immunol 194 (11), 5174-5186, 도이에서 수정되었습니다. 재현 및 면역학의 저작권 허가. 저작권 2015 년 미국 협회 게시, Inc.는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> 그림 5 : moDCs의 미토콘드리아 활동의 분석. (A) moDCs의 미토콘드리아 막 전위의 레벨 (적색 CMXRos)를 F로 수득낮은 세포 계측 분석. 네 개의 독립적 인 실험의 데이터를 모았다. ± SEM (B) 실시간 미토콘드리아 호흡의 도식 표현을 의미한다. 기초 호흡로부터 oligomycin의 첨가 (단지 V 억제) FCCP (최대 호흡 유도) 및 로테 논 / A 혼합물 antimycin (전자 전달계 [ETC] 억제) 후에 시작 OCR 분석. 미토콘드리아 SRC (최대 호흡에서 차감 최대 기초)는 OCR 곡선에서 파생됩니다. (C) tolerogenic의 미토콘드리아 OCR (pmol의 / 분) (녹색 TOL)의 대표 운동 연구, LPS-tolerogenic (L-TOL, 블랙) , 미숙 (IMM, 적색)과 성숙 ​​(MAT, 파란색) oligomycin의 순차적 인 추가 (OLIG) moDCs 및 기초 호흡, FCCP 및 로테 / A (ROT-AA)를 antimycin. (D) OCR 정량을 사용하여 moDCs ( E는) moDCs의 호흡 용량을 아끼지. 데이터 다섯 독립적 인 실험에서 풀링 하였다. ± SE 평균10.4049 / jimmunol.1303316 (2015년 6월 1일) : M.이 수치는 J Immunol 194 (11), 5174-5186, 도이에서 수정되었습니다. 재현 및 면역학의 저작권 허가. 저작권 2015 년 미국 협회 게시, Inc.는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> 그림 6 : moDCs의 대사 특성. (A) 실시간 당분의 도식 표현. ECAR 분석 (최대 셀 당분 복잡한 V 억제를 유발한다) oligomycin, 세포를 포도당 (당분 유도)에 첨가하여 당이없는 배지에서 배양하는 기저 ECAR에서 시작하고, 마지막으로 2- 데 옥시 D- 포도당(해당 작용 억제). 당분 비율 (기초 ECAR에 대한 감산 해당 작용 유도), 당분 해 능력 (기초의 ECAR에 대한 감산 최대 당분), 및 당분 예약은 (최대 당분이 당분 유도를 위해 감산)을 ECAR 곡선에서 파생됩니다. (B)의 대표 운동 연구 당분에 의존 tolerogenic의 ECAR (MPH / 분) (녹색 TOL), LPS-tolerogenic (블랙 L-TOL), 미숙 (빨간색 IMM), 그리고 성숙 (MAT, 파랑) 포도당 (Gluc)의 순차적 인 추가를 사용하여 moDCs, oligomycin (OLIG), 2-DG. (C) 바 기저 ECAR 수준 (D) 당분 속도 (E) 당분 용량 및 (F) moDCs의 당분 예약을 보여줍니다. 데이터는 세 개의 독립적 인 실험으로부터 모으고; 6 SEM을 의미한다. 통계적인 차이점은 Tukey의 다중 비교 사후 검사로 일방향 ANOVA로 분석 하였다. 10.4049 / jimmunol :이 수치는 J Immunol 194 (11), 5174-5186, 도이에서 수정되었습니다0.1303316 (2015년 6월 1일). 재현 및 면역학의 저작권 허가. 저작권 2015 년 미국 협회 게시, Inc.는 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.9K 조회수.  Agency for Science, Technology and Research. Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

비디오: Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

면역학 및 감염병학

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

의학

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided into conventional DCs (cDCs) and plasmacytoid DCs (pDCs). cDCs specializes in presenting antigens to and activate na&#239;ve T cells. On the other hand, pDCs can produce large quantities of type I interferons (IFN-I) during viral infection. The specification of DCs occurs at an early stage of DC progenitors in the bone marrow (BM) and is defined by a network of transcription factors (TFs). For example, cDCs highly express ID2, while pDCs highly express E2-2. Since more and more subsets of DCs are being identified, there is a growing interest in understanding specific TFs controlling DC development. Here, we establish a method to screen TFs critical for DCs differentiation in vitro by delivering lentivirus carrying short hairpin RNA (shRNA) into an immortalized hematopoietic stem and progenitor cell (iHSPCs) line. After the selection and in vitro differentiation, cDC and pDC potential of the stable knockdown cell lines are analyzed by flow cytometry. This approach provides a platform to identify genes potentially governing DC fates from progenitors in vitro.

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Here we provide a protocol for screening potential transcription factors involved in the development of dendritic cell (DC) using lentiviral transduction of shRNA to obtain stable knockdown cell lines for in vitro DC differentiation.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Sialidase 처리를 사용하여 분리된 PBMC에서 탈-시알릴화된 단핵구 유래-DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

저자 스포트라이트: 세포 표면의 Sialidases-Based Enzymatic Treatment를 사용한 수지상 세포 성숙 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

요약

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마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

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