Name: generation of large numbers of myeloid progenitors and dendritic cell precursors from murine bone marrow using a novel cell sorting strategy
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy at JoVE.com

우리는 앨리슨 교회 새에 어 번 대학교 학교의 수의학 흐름 Cytometry 시설, 오 번 대학에서 분자 생물학 프로그램 및 휴대 하는 NIH에서 EHS R15 R15 AI107773 하 고 자금에 대 한 기술 지원에 대 한 감사 여름 연구 자금 PBR을에 대 한.

모든 동물 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 권장 사항에 따라 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 골 수 컬렉션에 대 한 준비
<ol><li>로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민과 0.22 μ m 진공 필터 플라스 크 단위의 상단에 50 µ M 2-mercaptoethanol 보충의 솔루션을 추가 하 여 250 mL 완전 한 미디어를 준비 하 고 진공을 적용. 참고: 완전 한 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 개월까지.</li>
	<li>150 mL 살 균 H2O 500 mL 플라스 크에 100% 에탄올의 350 mL를 혼합 하 여 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>4 ° c 설정된 원심 분리기</li>
	<li>포 셉, 메스, 및 70% 에탄올에가 위를 소독.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세 60 mm 페 트리 접시에 완전 한 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브를 완전 한 미디어의 30 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>2입니다. Murine 골 수 세포 수집
<ol><li>안락사에 대 한 2013 미국 수의 의학 협회 (AVMA) 지침에 의해 설정 된 규칙에 따라 CO2 마 취 법에 의해 C57BL/6 마우스를 안락사.</li>
	<li>
제거 하 고 뒷 다리를 제거.
	<ol>
<li>75% 에탄올, 뒷 다리와 몸통을 포화 곡선된 조직이 위 고관절 주위 피부를 통해 얕은 상처를 확인. 근육을 드러내는 발목 쪽으로 엉덩이에서 피부를 당겨 단단히 집게를 사용 하 여. 가 위를 사용 하 여 제거 피부 플랩.</li>
		<li>전체 뒷 다리 대 퇴 골/고관절 보다 뼈를 통해 서 절단 하 여 제거 합니다. 참고: 살 균 그 지역을, 뿐만 아니라 에탄올 제공 하 고 깨끗 한 상처에 도움이 되며 샘플을 오염에서 머리카락을 방지.</li>
		<li>다리 골 수확에 대 한 새 위치로 전송 됩니다, 경우 완전 한 미디어에 다리 잠수함.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 biosafety 내각에서 working 전송 다리 접시는 이전 준비 중.</li>
	<li>그냥 잘라가 위를 사용 하 여 발목 아래 신중 하 게 최대한 근육과 탄성 결합 조직 제거. 두 번째 준비 페 트리 접시를 청소 뼈를 전송 합니다. 참고: 모든 근육을 제거 하지 않아도 됩니다, 하지만 너무 많은 나머지 조직이 어려울 수 있습니다 그것은 골 수 밖으로 플러시.</li>
	<li>
대 퇴 골, 무릎 및 경골을 구분 합니다.
	<ol>
<li>집게를 사용 하 여 무릎에서 다리를 개최 하 고 골 수를 찾습니다. 참고: 골 캐비티 내부에 뼈는 대 퇴 골 및 경골의 끝으로 상단에 희미 한 붉은 선으로 표시 됩니다.<ol>
<li>가 위를 사용 하 여 다음과 같이 3 개의 상처를 확인 합니다.<ol>
<li>바로 골 수 끝에 나타나는 위에 경골을 잘라.</li>
				<li>무릎 관절 아래 그냥 잘라.</li>
				<li>무릎 관절 위에 그냥 잘라.</li>
				<li>고관절 대 퇴 골에 여전히 연결 되어, 바로 고관절 아래 컷.</li>
			</ol>
</li>
			<li>페 트리 접시에 3 개의 파편을 반환 하 고 다른 다리에이 과정을 반복.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대 퇴 골과 경골에서 골을 플러시.
	<ol>
<li>23 G 바늘으로 50 mL 원뿔 튜브, 및 모자에서 완전 한 미디어 10 mL 주사기를 채우십시오.</li>
		<li>세 번째 준비 페 트리 접시 위에 집게와 뼈를 잡고, 뼈 운하에 바늘을 삽입 하 고, (또는 여러 클러스터는 그대로 "플러그"로 나타날 수 있습니다) 세포 밖으로 홍 조를 통해 미디어를 밀어. 뼈를 통해 서 더 많은 색깔을 볼 수 있다 때까지 반복 합니다. 필요에 따라 미디어와 주사기를 다시 채우십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
epiphyses 호감.
	<ol>
<li>두 번째 페 트리 접시에 무릎 모자 집게, 단단히 잡고 하 고 주사기의 팁과 무릎을 매쉬. epiphyses 빨간색 이상 될 때까지 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사기를 사용 하 여 전송 셀에서 두 번째 및 세 번째 페 트리 접시 50 mL 튜브. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 덩어리를 해체. 거품을 생성 하지 마세요. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>
붉은 혈액 세포를 lyse
	<ol>
<li>혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고, 터치 하 여 펠 릿을 꺼내 실 온에서 1 분에 대 한 ACK (염화 염화 칼륨) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 배양 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse.</li>
		<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼의 40 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 필터링 셀 비록 70 µ m 셀 거르는 새로운 50 mL 원뿔 관으로. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 완전 한 미디어의 40 mL로 세척 하 고 표면에 뜨는 셀을 제거 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기. 참고:이 단계에서 계보 긍정적인 세포 FACS 또는 자기 열 정화에 의해 제거할 수 있습니다. 그러나, 림프 톨 문화에 긴 기간을 유지 하지 됩니다. 거의 모든 결 석 하는 혈통 긍정적인 세포의 많은 수는 Ly6C-CD115-인구 비보 전골 수에에서 존재, 하루 5 (그림 2).</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 상쾌한, 제거 하 고 골 셀 1 x 106 셀/mL의 조밀도에 재조합 마우스 GM-CSF의 10 ng/mL와 함께 완전 한 미디어 문화. 참고: 일반적으로, 4 x 107 총 세포 수 수 수확 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 후. 그러나, 기대 2 x 107 조금 초보자를 위한 최대 5 x 107 셀 경험된 수확기에 대 한.</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세포 조직 문화 접시에 전송 하 고 37 ° c 5% CO2에서 품 어. 각 씨앗 24-잘 접시를 사용 하 여 경우 세포 현 탁 액 2 mL와 잘.</li>
	<li>모든 48 h 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어의 절반을 제거 하 고 신선한 완전 한 미디어와 GM-CSF 대체. 참고: 문화 수 유지 9 일. 그러나, 구성 시간이 지남에 변경 됩니다. 자세한 내용은 섹션 3을 참조 하십시오.</li>
</ol>3. 선택 정렬의 하루
<ol><li>시간이 지남에 셀 인구 구성 변화로 원하는 셀의 가장 높은 번호를 생성 하는 일을 선택 합니다.</li>
	<li>1 x 107 셀 당 GM-CSF에 문화의 3, 5, 및 7 일 후 각 인구의 예상된 셀 항복 게시물 정렬 표 1을 참조 하십시오.</li>
</ol>4. 얼룩이 전략
<ol><li>셀의 작은 aliquots를 사용 하 여 제어 샘플을 준비 하. 흠 없는 컨트롤, 보상 제어 샘플 하나만 형광 항 체 각, 물 포함 고 형광-마이너스-1 제어 하나, 일반적인 형광 해당 채널에 대 한 제어를 제외 하 고는 모든 항 체에 추가 합니다. 기본, 보조, 포함 간접적인 라벨을 사용 하 고 모두 기본 및 보조. 참고: Phycoerythrin (PE) 및 allophycocyanin (APC) 태그 항 체 제공 최소한의 출혈과 뚜렷한 분리에 함께 사용 될 때. 그러나, 형광 색소 옵션이 제한 됩니다, 경우 CD115는 표현 상대적으로 낮은 수준에서 Ly6C은 매우 높은 수준에서 표현 하는 동안. 따라서, 밝은 형광은 필요한 안티-CD115, 그리고 안티-Ly6C 형광 이상의 출혈을 방지 하기 위해 선택 됩니다.</li>
	<li>3 mL 50 mL 원뿔 튜브, 혈 청 태아 종 아리와 함께 냉장된 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 97 mL를 혼합 하 여 100 mL FACS 워시 버퍼 (FWB)의 준비 하 고 얼음 목욕에.</li>
	<li>한 피 펫을 사용 하 여 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 플라스틱 셀 아래로 느슨하게 부착 셀을 꺼내 려.</li>
	<li>
혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
	<ol>
<li>셀 볼륨 50 mL를 초과 하는 경우 튜브의 필요한 수를 셀을 전송 하 고 착 단계에서 결합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다. 참고: 높은 세포 죽음을 예상 하는 경우 셀 세척 될 수 있다와 FWB와 낮은 0.5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS). 이 세포 응집 되지 것입니다.</li>
	<li>
일시 중지 하 고 항 체 제조 업체의 지시 당 세포 얼룩.
	<ol>
<li>5 x 107 셀 FWB의 1 mL를 일시 중단 하 고 2 µ g 각 안티-Ly6C 및 안티-CD115 (의 연구자의 선택) fluorophores 표시를 추가 합니다. 더 CMP 구별 moDC (둘 다은 Ly6C-CD115-), 추가 안티-CD11c 항 체의 2 µ g (CMP는 CD11c-; moDC는 CD11c+). 얼음에 30 분 동안 품 어. 참고: 그림 3 Ly6C-PE와 CD115 APC를 사용 하 여 생성 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g 에서 FWB, 그리고 원심 분리기의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.</li>
	<li>셀을 중단 하기 전에 철저 하 게 펠 릿을 꺼내 려 튜브를 터치 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 1 x 107 셀/mL FWB의 세포를 중단 하 고 35 µ m 셀 필터를 통해 필터링. 폴 리 프로필 렌 튜브에 필터링 된 셀 전송 정렬 준비가 될 때까지 얼음에 배치 하는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 합니다. 참고: 지금까지 폴 리 프로필 렌, 사용할 수 없는 경우에 단백질 코팅 (무 지방 건조 우유 또는 FCS) 폴리스 티 렌 튜브 바인딩을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 설정 제어 샘플에 따라 게이츠
참고: 고속 흐름 스트림의 압력 때문에 세포 파쇄를 방지 하려면 셀 정렬에 대 한 100-130 µ m 노즐을 사용 합니다.
<ol><li>
흠 없는 컨트롤 실행 (단계 4.1 참조) 셀 정렬 통해 작은 파편 (낮은 앞으로 분산형;를 제외 하려면 게이트를 적용 하 고 FSC) 및 매우 세분화 된 (높은 쪽 분산형; SSC) 입자입니다.
	<ol>
<li>분석에 후기 (monocytes, moMac/MoDP, 및 MoDC), 더 큰 셀 (높은 FSC)만 포함 하도록 게이팅 적용 됩니다.</li>
		<li>생존 얼룩 사용 중인 경우 사용 하 여 이러한 스테인드, 비-가능한 이벤트 (예를 들어 그림 1에 설명 된다)를 제외 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 정렬 통해 단일 형광 제어 샘플을 실행 하 고 필요에 따라 보상을 조정 합니다.</li>
	<li>다중 표시 된 샘플의 샘플을 실행 합니다. 4 개의 명료한 인구를 관찰: Ly6C + CD115-(GMPs) Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), 및 Ly6C-CD115-(CMPs/moDCs). 각 4 개의 주요 인구를 분리 하는 게이트를 적용 합니다. 참고: CMPs와 moDC Ly6C-CD115-표현 형을 공유합니다. 그러나, 그들은 분화 될 수 있다 CD11c 식에 따라: CMP 부족 CD11c, MoDCs 익스프레스 CD11c 반면.</li>
</ol>6입니다. 고립 된 인구의 수집
<ol><li>적어도 20%를 달성 하기 위해 충분 한 FCS를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 최종 농도 전체. 예를 들어 5 mL 튜브를 사용 하는 경우 정렬, 전에 FCS의 1 mL을 추가 하 고 5 mL 전체 볼륨에 도달할 때 튜브를 제거.</li>
	<li>
막 회전율과 항 체 이해를 방지 하기 위해, 일종에 걸쳐 4 ° C에서 모든 샘플 (혼합 및 정렬)을 유지 합니다.
	<ol>
<li>만약 이것이 가능 하지, 유지 가능한 얼음에 정렬 하 고 필요에 따라 정렬에 aliquots를 전송 하는 셀을 포함 하는 관.</li>
		<li>또한, 모든 20-30 분 얼음 정렬된 샘플 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 셀 수를 수집한 후에 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새로운 원뿔 튜브에 세포를 전송. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.<ol>
<li>각 수집 된 인구에서 작은 aliquots에 정렬 후 분석 순도 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제거는 상쾌한, FWB 및 두 세척의 총 10 분 반복에 대 한 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기의 10 mL에 일시 중지. 참고: 그것은 펠 릿을 dislodging 없이 모든 상쾌한을 제거 하려면 어려울 수 있습니다. 피 펫 팁 진공 라인을 연결 제거 도울 수 있습니다. 사용할 수 없는 경우는 상쾌한 펠 릿 분리의 경우 신선한 튜브에 수집 될이 좋습니다.</li>
	<li>두 번째 세척 후에 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>경우 사용자의 실험 디자인 셀 다시 경작 될 지시, 단계 2.12-2.14. 그렇지 않으면, 셀 즉각적인 분석을 위해 사용 될 경우 원하는 프로토콜에 따라 셀을 준비 합니다. 참고: 일반적인 기능 분석의 예는 그림 4에 포함 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 충돌이 있다.

이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. 이전 연구에 격리.
창시자 및 생체 외에서 골 수에서 생성 하는 선구자의 격리에 대 한 이전 프로토콜 골수성 세포 18의 마커로 CD31와 Ly6C 얼룩 또는 증식 조상 세포 17 식별 CFSE 얼룩에 의존 . CFSE Naik에 의해 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자 17세대에 사용 하기 위해 설계 되었습니다. 우리 GM-CSF 문화 시스템에이 접근을 시도 했을 때 우리는 두 가지 주요 문제가 발생 했습니다. CFSE는 다소 개발 세포에 세포 독성 고 했다 그래서 밝은 (분할된 셀)에 보상을 어려운 만든 그것. 이 접근 방식은 높은 증식 (CMPs/GMPs) 고도로 발달된 (MoDC/MoMac) 하에서 발달 스펙트럼 셀 뿐만 아니라 초기 세포 유형 (창시자), 격리의 우리의 목표에 적합 하지 않을을 입증 했다. 우리는 또한 GM-CSF 기반 셀 CD31 Ly6C 18에 근거 했다 Leenen의 그룹에 의해 설명 된에 대 한 정렬 전략을 시도 했다. 그러나, 우리가 발견 CD31 문제가. 그것은 매우 낮은 수준 (인구 깨끗 한 정렬에 대 한 해결 하기 어려운 만들기)에서 표현 되었다 셀, 그리고 문화 기간 동안 초기만 vanishingly 작은 하위 집합으로. 사실, CD31 식 하루 2 GM-CSF 10문화의 과거 발견할 수 아니었다.
그러나 Ly6C,, 식 10의 변이 패턴으로 인해 개발의 다른 단계에서 세포를 분리 하기 위한 매우 유용한 분자 이었다. CD115의 추가 CD31 가능 했다 개발의 중간 및 저장 단계에서 세포를 더 밀접 하 게 분별을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 초기 셀 10의 큰 숫자를 분리의 희망 CD117, CD34 등 창시자의 다른 마커를 검사 합니다. 그러나, 달리 Flt3L 시스템에 보고, 우리는 발견 CD117, CD34 세포의 아주 작은 부분 집합에도 표현 되었다 거의 결 석 했다 문화 17의 3 일에 의해. 그러나 이러한 줄기 세포 마커 미래 연구에 유용한, CMP 또는 GMP 인구 내에서 하위 집합을 구별할 수 있습니다.
몇 가지 잠재적인 수정 원하는 세포 인구의 수익률에 영향을 미칠 수 있습니다 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 사용자는 어떤 죽은 세포를 제외 하는 생존 얼룩에 적용할 선택할 수 있습니다. 관측을 바탕으로, 전형적인 앞으로 및 사이드 분산형 게이트 내에서 죽은 세포의 상대적으로 낮은 일반적 이며 문화, 혈통 긍정적인 세포 감소와 일치의 처음 몇 일 동안에 문제를 제기. 그러나, 어느 셀에 숫자 정확 해야 응용 프로그램에 대 한 생존 얼룩 죽은 세포의 배제를 보장 합니다.
두 번째 잠재적인 수정 문화 전에 리니지 양성 세포의 고갈 이다. 우리는 정기적으로 Ly6C-CD115-세포 인구에서 관찰 된 혈통 긍정적인 세포의 작은 인구를 해결 하기 위해이 방법을 시도 했다. 전체 셀 항복 했다 5, 6, 일에서 약간 낮은 고 순도 상당히 높은 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 순도 감소 된 수확량을 정당화 하지 않았다. 마찬가지로, 사용자, 정렬 5 일에 또는 후에 계획 하는 경우 문화 내에서 세포의 주파수 1% 아래 이며 문제를 선물 하지 해야 합니다.
마지막으로,이 전략은 분리 하도록 설계 되었습니다 때문에 큰 발달 스펙트럼 사용자 셀 최대한 원하는 인구의 많은 수집에 그들의 정렬의 타이밍에 맞게 한다. 이 정렬 전략 충실 하 게 문화의 셀 정렬 됩니다 하루에 표시 된 셀 형식을 생성 합니다. 여부 그들은 정렬 하 고 하루 3 또는 5의 문화에 고립 된 마찬가지로 GMP 표현 형 및 기능 사실 Ly6C + CD115-CD11c-는 표현 형으로 세포 예를 들어. 그러나,이 세포의 주파수 이므로 보다 훨씬 날 3에 5, 3 일에 정렬을 권장 것 이다 목표 고립이 셀 형식의 경우. 그것은 또한 주목할 만한 셀 경우 그들은 5 또는 7 (그림 3)에 정렬 했다 보다 느린 속도와 연속적인 발달 단계를 통해 3 일 진행에 정렬.
이 메서드는 명확한 묘사 그리고 발달 스펙트럼을 따라 5-6 가지 인구의 고립에 대 한 수 있습니다, 하는 동안 많은 더 많은 인구 또는이 통로 따라 과도 적인 단계 가능성이 있다. 각 5 개의 설명된 인구 개발의 약간 다른 단위에서 여러 하위 인구 수 있습니다. 예를 들어 우리는 "고유" 중간 수준으로 CD115와 Ly6C는 인구 얼마나 많은 moMac와 moDC는 측면에서 개발의 약간 다른 패턴을 받아야 생성 (데이터 표시 되지 않음) 관찰. 그것은 또한 인구를 이전 vivo에서 문화 및 분류 시스템에 존재 하지만 이들은 그들의 매우 낮은 주파수 때문에 식별 하기 어려운 되었습니다 관찰 가능성이. CMOP 19, 민주당 20또는 CDP 21 등 인구 가능성이 현재, 하지만 더 큰 인구 이내 가려질 수 있습니다. 미래 연구 차별화의 특정 마커를 추가이 정렬 프레임 워크 내에서 고립 될 수 있는 수많은 발달 단계를 더 명확 하 게 필요 합니다. 이 정렬 전략의 값은 DC 그렇습니다 동안 발달 단계로의 큰 숫자의 일관 된 절연을 허용 한다.

Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 5의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) 9,,1011의 큰 하위 집합 뿐 아니라 실제로 많은 moDC 되었다. 우리 자신의 연구 더 적은 개발된 세포, monocytes, moDC 전 (moDP) 등의 다른 하위 집합 107 일 후에 낮은 주파수에서 문화에 남아 있는 것을 보여주는이 발견을 확대 했습니다. 따라서, 수지상 세포 (DC) 함수 사용 하 여이 시스템에 의해 생성 된 셀의 연구 이전 감사 보다 세포 유형의 광범위 한 코 호트의 응답을 반영 수 있습니다.
우리는 훌륭한 제의로 GM-CSF 생성 moDC 차별화 12,,1314의 마지막 단계에서 이러한 세포의 기능에 관련 된 연구에서 배웠습니다. 그러나, 우리가 이해 크게 이들의 발달 경로 대 한 세포 2,,1516 어떻게 그리고 언제 그들은 구체적인 전시의 같은 기능: 병원 체 관련 분자에 응답 패턴 (PAMPs), 식 균 작용, 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션 13, 그리고 항균 활동. 기존의 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자의 많은 수의 격리 프로토콜 보고 17되었습니다. 이러한 고유한 인구의 격리 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 사용 하 여 달성 되었다-스테인드 골 수 세포 (세포를 분할 추적)와 3 일 동안 Flt3L에 문화. 셀은 비재귀 긍정적인 세포의 고갈 그리고 조상과 전조 인구 CD11c 식 17을 기반으로 정렬 했다. GM-CSF 중심 문화에서 DC의 이른 창시자를 식별 하기 위해 Leenen의 그룹에 의해 또 다른 방법은 CD31 Ly6C 18에 따라 셀을 정렬 했다. 초기 목표는 창시자 및 GM-CSF 기반 moDC의 선구자는 비슷한 방법을 만드는 것 이었다. GM-CSF에 의해 생성 된 특정 세포 유형으로 인해 우리는 접근 및 전략 개발의 초기 및 이후 단계에서 표현 했다 분자의 식에 따라 정렬 적응. 우리가 궁극적으로 결정 하는 Ly6C, CD115 (CSF-1 수용 체), CD11c 10종류 구별이 셀에 대 한 최고의 마커를 했다.
여기, 우리 GM-CSF에 의해 구동 하는 차별화의 통로 따라 개발의 일부의 단계에서 세포의 분리 방법 제시: 일반적인 골수성 조상 (CMP), Granulocyte Macrophage 조상 (GMP), monocyte, monocyte 파생 된 대 식 세포 (MoMac) 및 monocyte 파생 된 DC (MoDC). MoMac 인구 수 추가 분리 될 기반 MHC 클래스 II 식의 수준에 moDC 전조 인구 (moDP) 10공개. 우리가 활용 고속 형광 활성화 셀이 5 인구 Ly6C, CD115, 및 CD11c의 식에 따라 분리 (FACS) 전략을 정렬 합니다. PAMP 자극에 대 한 답변을 공개 하는 기능 분석에서 이러한 셀의 시험 다음 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>to supplement complete medium and FWB</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>to supplement complete medium</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>MP Biomedical</td><td>190242</td><td>to supplement complete medium</td></tr><tr><td>75 mM Vacuum Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>to sterilize complete media</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>to lyse red blood cell</td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>to rescue leukocytes after red blood cell lysis</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco&#039;s</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>must be endotoxin free; chilled at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m Cell filter</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>to break apart clumps before running through cytometer.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>usable concentration of 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Tissue cultured treated plate</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>for bone marrow cells after harvest</td></tr><tr><td>Anti-Ly6C, Clone HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, Clone AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c, Clone HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>to differeniate CMP and MoDCs</td></tr><tr><td>MoFlo XPD Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Female; 10-20 weeks old</td></tr><tr><td>Biosafety Hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&amp;nbsp;R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

generation of large numbers of myeloid progenitors and dendritic cell precursors from murine bone marrow using a novel cell sorting strategy

문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.

가능 하 고, 실행 가능한 세포로 분석을 위해 사용할 수 있는 많은 채널을 유지 하기 위해에서 매우 작고 매우 세부적인 이벤트 (일반 게이트 모든 적용 됩니다 도트 그림 1A에플롯)를 제외 하 고 측면 분산형에 따라 선택 일상적으로 했다. 이 제어 전략은 안정적으로 죽은 세포를 제외 하는 경우를 확인 하려면 우리는 7-아미노 악티노마이신 d (7-AAD) (그림 1B) 스테인드. 7AAD는 DNA 죽음과 죽어가는 세포 막 침투성 때문에 얼룩 그리고 가능한 세포에 의해 제외 됩니다. GM-CSF 배양된 골 수 세포 수확 후 (PH)와 1, 3, 그리고 5 박사 셀 분석 PH 즉시 즉시 분석의 일반 FSC/SSC 게이트 뼈에서 갓 격리 된 셀에 적용 된 7 AAD 긍정적인 세포의 약 10%를 했다 수 (그림 1, 수확 후). 죽은 세포의 비슷한 비율 또한 하루 1 (~ 12%)과 문화 (그림 1, 1 일 PH 및 PH 3 일)를 하루 3 (~ 11%)에 존재 했다. 하루 5, 게이트 내에서 죽은 세포의 수는 ~ 5% (그림 1, 5 일 산도)로 감소 되었다. 따라서, 이러한 생존 게이트를 사용 하 여는 일반적으로 정렬 후 5 일에 적합 합니다. 따라서, 사용자는 그들의 사용 가능한 매개 변수에서 제한 됩니다, FSC/SSC 게이팅 경우 일반적으로 적절 한. 그러나, 더 민감한 분석 실험 (특히 만약 그들이 정확한 핸드폰 번호에 의존)에 대 한 생존 얼룩 (제안)를 통합.
수지상 세포의 전파에 대 한 많은 프로토콜 혈통 긍정적인 세포, 특히 세포 문화 11,17전에 골 수에서 고갈을 것이 좋습니다. 이 절차는 GM-CSF 중재 차별화 시 복구 하는 세포의 순도 높이기 위해 생각 됩니다. 일반적으로, T 세포 (CD3)의 마커를 표현 하는 세포 B 세포 (CD45R 또는 CD19), 그리고 NK 세포 (NK1.1) 자석 구슬 또는 11,17,18정렬 셀을 사용 하 여 긍정적인 선택에 의해 고갈 될 수 있습니다. 그러나, 자란 시스템을 바탕으로, 림프 톨은 거의 복구 또는 이러한 분석 실험에서 발견. 따라서, 우리는 Ly6C-CD115-사이 인구 GM-CSF 기반 셀 (그림 2A)에서 유지 관리 하는 림프 톨의 장 수를 평가 하고자 했다. GM-CSF 배양 골 수 세포 (그 계보 고갈 되지 않았다) (동일한 fluorophore)에서 CD3, CD45R, 및 NK1.1 항 체와 스테인드 했다 고 매일 cytometry (그림 2B)에 의해 측정. Ly6C-CD115-인구, 내 CD3/CD45R 긍정적인 세포 일 0-3 (그림 2B)을 통해 강력 하 게 유지 됩니다. 4 일 몇 CD3/CD45R 긍정적인 셀만 남아, 고 하루 5, 6에 의해 아무 CD3/CD45R 현재 셀을 표현 했다. 따라서, GM-CSF에 문화 4 일 이내 혈통 긍정적인 세포 기본적으로 결 석 했다 고 일 5와 6의 문화에서 전혀 검색 되지 했다.
GM-CSF 기반 세포 배양 매일 변경 셀이이 시스템에서 개발 하 고 (표 1; 차별화의 구성 그림 3)입니다. 초기 시간 지점에서 가장 풍부한 셀 창시자와 선구자, 있으며 나중 시간 셀의 대부분은 더 차별화 된 10. 확인 하려면 어떻게 정렬 문화의 다른 일에 영향을 미칠 수 후속 발달 경로 또는 속도 론, 종류 3, 5, 7 일 산 (그림 3A)도 수행 했다. MoMac 인구의 개발 (Ly6C-CD115 +) 다음에 추적 되었다 문화에 더 일을 2-3 (그림 3B-3D).
3 일 PH, Ly6C의 40%만을 정렬 하는 경우-CD115 + 셀 정렬 후 24 h (PS) (그림 3B) 안에 CD115 식 감소 했다. 48 h PS, 했다 다운-규제 CD115 분수 66% 이었고 72 h에 의해 세포의 70%가 표현이 형을 했다. 이 phenotypic 구성 유지 되었다 (70 ~ 72 %Ly6C-CD115-) 문화 (데이터 표시 되지 않음)의 추가 일 후에. 5 일 PH, 정렬 ~ 75% 했다 Ly6C-CD115-CD115-48 h 후 했다 24 h PS, ~ 80% 내에서 빠르게 다운 규제 CD115 데. 이 배포 후 72 h (그림 3C) 유지 되었다. 마지막으로, 7 일 PH, 정렬 때 다운 레 귤 레이 션 CD115의 매우 빠른도 했다. 24 h PS, 이내 셀 ~ 75% 아래로 CD115 식, 졌고이 추세 후 48 h (그림 3D) 유지 되었다. 흥미롭게도, 7 일에 정렬 하는 경우 CD115 식의 전반적인 수준 있던 CD115 + 인구 내의 셀에.
따라서 이러한 연구 결과 개발의 속도 다소 느린 초기 하루에 정렬할 때, 하루 등 3 정렬 더 급속 한 발전에 비해 전지와 차별화 5 또는 7에 정렬 한 후 관찰을 나타냅니다. 이러한 결과 바탕으로, 사용자가 moDC의 더 큰 숫자를 추구 한다 가능성이 하루 5 또는 7에 정렬.
DC의 성숙 응답 잘 설립된 6,7,,1214이다. 다양 한 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)로 치료 하면 미 숙 DC 최대-규제 MHC와 costimulatory 분자 프로 염증 성 cytokines의 식을 그들의 T 세포 활성화 용량 6강화. 그러나, 그것은 덜 분명 개발 셀 PAMP 자극 하 고 그들은 전시 수도 DC 성숙의 어떤 기능에 대응 하는 능력을 얻을. 정렬 된 인구 중 성숙 자극에 반응할 것을 확인 하려면 각 인구 나 PAMPs 폴 리 등의 칵테일 정렬 후 치료: C, lipopolysaccharides (LPS), 및 포장 소비재 DNA 수용 체 통행세 같이 (TLR) 3 (TLR3), 방 아 쇠를 TLR4 및 TLR9, 각각. 셀은 치료 (치료) 24 h에 대 한 그리고 CD86 및 MHCII의 표현을 cytometry (그림 4A-4B)에 의해 측정 되었다. 또한, 일리노이-12 p 40/70과 일리노이-6 생산 cytokine 배열 (그림 4C-4D) ELISA는 supernatants에서 측정 했다.
CMPs와 MHC 표현 GMPs 매우 낮은 수준의 클래스 II 그리고 CD86 unstimulated 상태에 이러한 표현 패턴 PAMPs (그림 4A 및 4B)의 칵테일에 노출 시 크게 변화 하지 않았다. 마찬가지로, MHC 종류 II는 monocytes에 의해 표현 되었고 또한 낮은 PAMP 노출 (그림 4A)에 따라 약간 변경. 그러나, CD86 표현 monocytes 24 h에 중간 정렬 후 이었고 더 다음 24 h 자극 증가. 높은 기저 식의 MHC 종류 II와 CD86 MoMacs와 MoDCs에서 관찰 되었다, 고 두 인구 전시 PAMP 자극 시 이러한 분자의 강한 유도. MHC 클래스 II 식 자극 다음에서 MoMacs와 MoDCs는 별개의 그룹을 형성 하는 동안 CMPs, GMPs, 및 monocytes, 통계 차이 했다. 그러나, CD86 식 점에서 CMPs GMPs 세포 했다 통계적으로 다른 MoMacs 및 MoDCs. 그러나, monocytes MoMacs 또는 MoDCs에 차이가 없었습니다.
우리는 다음 상대 5 인구의 각각의 생산 능력을 cytokines TLR 자극에 대 한 응답에서을 평가 하 고 싶었다. 따라서, 우리가 수행 cytokine 분석 결과 정렬 된 인구에 TLR 길 항 제 칵테일의 유무에서 문화 위에 사용 후. 셀 24 h에 대 한 자극으로 경작 했다 다음 supernatants 수집 했다. 우리는 아주 작은 IL-12 p 40/70 또는 일리노이-6 생산 CMPs TLR 자극 (그림 4C-4D) 시 관찰. 두 번째 인구 GMPs, IL-12 p 40/70 (그림 4C)을 생산 하지 못했습니다 하지만 이러한 세포 자극 PAMPs (그림 4D)에 의해 따라 일리노이-6의 낮은 금액을 생산. Cytokine 생산의 상부는 후자 3 개의 인구에서 관찰 되었다. Monocytes 그리고 MoMacs는 매우 비슷한 패턴 및 cytokine 생산의 규모를 했다. 둘 다 크게 증가 하는 IL-12 p 40/70 하 고 겸손 하 게 일리노이-6 생산 자극 (그림 4C-4D)를 증가. 흥미롭게도, PAMPs MoDCs 존재 증가 하지 않았다 IL-12 p 40/70 분 비; 그러나,이 인구는 크게 생산 일리노이-6 (그림 4C-4D) 증가 했다. 이러한 결과 정렬 된 인구 격리 후 그들의 면역 기능을 유지 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57365/57365fig1.jpg"> 그림 1: 사이드 흩어 게이트 대 앞으로 내 가능한 셀. 마우스 골 수에서 GM-CSF, 경작 했다 그리고 생존 7-AAD (7-아미노-악티노마이신 D) 수확 후 (PH)와 1, 3, 5 일 수확 후 얼룩을 사용 하 여 측정 했다. (A) 가능한 셀 생략 FSC 그리고 SSC에 기반 하는 작고 고도로 세분화 된 이벤트 게이트 (실용적)을 적용 하 여 선정 됐다. (B) 히스토그램 7 AAD 얼룩의 실용적 (FSC/SSC) 게이트 내의 이벤트에서 생성. 이벤트 7-AAD에 대 한 긍정적인 세포 apoptosis를 받은 나타냅니다. 화살표는 가능한 셀 게이팅 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57365/57365fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57365/57365fig2.jpg"> 그림 2: Ly6C-CD115-인구 내의 림프 톨. GM-CSF에 마우스 골 수 배양 했다 그리고 림프 구 마커 (CD3, CD145R, 및 NK1.1) 매일 cytometry에 의해 분석 되었다. (A) 셀 Ly6C-CD115-셀을 식별 하는 Ly6C PE와 CD115 APC 물 했다. 사분면 게이트 단색 컨트롤에 따라 적용 됩니다. 모조 색상 도트 줄거리 하루 하루 6까지 수확 (0 일)의 하루에 Ly6C-CD115-셀의 0 (B) CD3, CD45R, 및 NK1.1 식 분석에서 생성 된. 셀 계산 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모드를 정상화 했다. 화살표 표시 Ly6C-CD115-게이팅. <a href="/files/ftp_upload/57365/57365fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57365/57365fig3.jpg"> 그림 3: Ly6C의 개발의 활동-CD115 + 셀 다른 일에 정렬 후. (A) 마우스 골 수확 되었고 GM-CSF에서 경작. Aliquots 1 x 107 셀의 수확된 (B) (C) 5, 3, 또는 (D) 7 일 후 수확 (PH) 했다. 지정 일 PH, Ly6C-CD115 + 셀 혼합 문화 (사전 정렬) 정렬 되었고 즉시 분석 후 정렬 (PS). 정렬된 셀 GM-CSF에 다시 경작 그리고 Ly6C/CD115 식에서 변화 했다 cytometry 매일 분석. 상자와 화살표 정렬 게이트를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57365/57365fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57365/57365fig4.jpg"> 그림 4: TLR 자극에 따라 성숙과 cytokine 식. 셀 5 인구로 GM-CSF에서 3 일에 정렬 했다. 그들은 다음 PAMPs의 칵테일으로 치료 했다 (LPS, 폴 리 나: C, 및 포장 소비재 DNA) 24 h. 의미 (A) MHC 종류 II의 형광 강도 (MFI)와 (B) CD86 정렬 후 (PS) 및 24 시간 여 PAMPs 없이 흐름 cytometry 즉시 분석 했다. 오차 막대는 3-5 복제 실험의 표준 편차를 나타냅니다. (C) IL-12 p 40/70과 supernatants 3 풀링된 샘플에서에서 (D) 일리노이-6와 PAMPs 없이 24 시간 후 cytokine 배열 점 오 애 란에 의해 측정 되었다. RLU; 상대 빛 단위; -/ + 지정 된 인구에 대 한 세포 표면 감 적의 존재를 나타냅니다. <a href="/files/ftp_upload/57365/57365fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2" style="text-align: center;">3 일</td>
			<td colspan="2" style="text-align: center;">5 일째</td>
			<td colspan="2" style="text-align: center;">7 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>표현 형</td>
			<td style="text-align: left;">셀 유형</td>
			<td style="text-align: center;">분</td>
			<td style="text-align: center;">최대</td>
			<td style="text-align: center;">분</td>
			<td style="text-align: center;">최대</td>
			<td style="text-align: center;">분</td>
			<td style="text-align: center;">최대</td>
		</tr>
<tr>
<td style="text-align: left;">Ly6C-CD115-CD11c-</td>
			<td style="text-align: left;">CMP</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">4 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">5 x 105
</td>
			<td style="text-align: center;">1 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
		</tr>
<tr>
<td style="text-align: left;">Ly6C + CD115-</td>
			<td style="text-align: left;">GMP</td>
			<td style="text-align: center;">2 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">2 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
		</tr>
<tr>
<td style="text-align: left;">Ly6C + CD115 +</td>
			<td style="text-align: left;">모노</td>
			<td style="text-align: center;">2 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">2 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">5 x 105
</td>
			<td style="text-align: center;">1 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td style="text-align: left;">Ly6C-CD115 +</td>
			<td style="text-align: left;">MoMac</td>
			<td style="text-align: center;">5 x 105
</td>
			<td style="text-align: center;">1 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">4 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">4 x 106
</td>
		</tr>
<tr>
<td style="text-align: left;">Ly6C-CD115-CD11c +</td>
			<td style="text-align: left;">MoDC</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
			<td style="text-align: center;">N/a</td>
			<td style="text-align: center;">5 x 105
</td>
			<td style="text-align: center;">1 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">3 x 106
</td>
			<td style="text-align: center;">4 x 106
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 최소 및 최대 셀 개수 당 1 x 107 셀 정렬 후 회복 예상. CMP (일반적인 골수성 原); GMP (granulocyte/macrophage 原) 모노 (monocytes); MoMac (monocyte 파생 된 대 식 세포); MoDC (monocyte 파생 된 모 수석 세포); N/a (사용할 수 없음); 최소 (1 x 107 세포에서 최소 셀 수확량); 최대 (1 x 107 세포에서 최대 셀 수확량).

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Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.0K 조회수.  Auburn University. 여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

비디오: Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

연구

생물학

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

발생학

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

면역학 및 감염병학

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...