Name: optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons at JoVE.com

We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).

본 연구의 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 생물학적 연구 솔크 연구소, 라호야, 캘리포니아에서 동물 처리를위한 프로토콜을 승인하여 수행 하였다 1. UAA Kir2.1의 설립 및 기본 신경 문화의 결과 PIRK의 발현 <ol><li> DNA 건설 <ol><li> UAA 법인에 대한 Kir2.1의 대상 사이트를 선택합니다. 광 감응성 UAA 법인으로 선택한 사이트 Kir2.1 기능 (21)의 광 변조를 할 수 있도록, Kir2.1의 구조와 기능에 대한 사전 지식과 정보를 이용한다. </li><li> 태그 황색 정지 코돈에 돌연변이 선택한 사이트와 재조합 DNA 인코딩 Kir2.1 유전자를 구축합니다. 포유 동물 발현 플라스미드에 Kir2.1-TAG의 DNA를 복제하는 표준 복제 기술 (25)를 사용합니다. </li><li> UAA 특정하고 응답하여 UAA 통합 클론의 tRNA / 합성 유전자다른 포유 동물 발현에 TAG 정지 코돈 21 플라스미드. 주 : 최적 UAA의 혼입 (tRNA에, 합성 및 Kir2.1에 대한) 다른 프로모터 및 유전자 카세트의 조합은 서로 다른 플라스미드에서 시험 할 수있다. </li><li> 미니 프렙을 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 확보 또는 제조사의 프로토콜에 따라 상업 키트를 maxiprep. 280 분의 260 비율의 1.9 주위에 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우 상기 DNA 수험 공부 (25)의 순도를 확인하기 위해, 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다. 고순도 수퍼 코일 플라스미드 DNA는 신경 세포의 형질 전환을위한 최고입니다. </li></ol></li><li> 문화 쥐 해마 차 뉴런 <ol><li> 장소 커버 글라스 (원, 12 직경 mm) 24 웰 플레이트의 각 웰에 하나 coverslip에, 코트 각 웰 0.5 mg을 250 μL / ㎖ 폴리 D 라이신 (100 밀리미터의 붕산 완충액 : 1.24 g의 붕산 증류 된 탈 이온수 400 ㎖ 중의 산 1.90 g 소듐 테트라 보레이트 또는 H 2 O 2 DDH </su실온에서 10 시간 동안 pH가 8.5에서 B&gt; O)를, 밀봉. 강아지 당 약 10 ~ 12 코팅 된 커버를 준비합니다. </li><li> 해부의 날, 이소 플루 란으로 그들을 마취하고, 목이 이후 출생 쥐 새끼 (1-4 출생 후의 일)에서 신생아의 뇌를 수집합니다. 이소 플루 란 (2-4%)를 포함하는 마취 챔버 새끼 마취. 그들은 의식을 잃고 촉각 자극에와 발의 곤란에 응답하지 않을 때까지 기다립니다. </li><li> 표준 기술 (26)을 사용하여 (~ 37 ° C) 식염수 (10 mM의 HEPES 및 행크의 균형 잡힌 염 용액에 첨가하는 20 mM D- 글루코오스) 따뜻한 뇌로부터 해마를 해부하고, 4.5 ㎖의 따뜻한 염수 원뿔형 튜브 해마 수집 . </li><li> 해마 (0.25 % 최종 트립신 농도) 2.5 %의 트립신의 500 μl를 추가하고 37 ° C에서 물을 욕조에 10 분 동안 품어. </li><li> 철저히 식염수 (3 × 10 mL) 및 씹다와 조직을 헹군다. </li><li> 1 ml의 w에있는 해리 신경 세포를 복구5 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충 된 최소 필수 매체 (MEM)를 포함하는 암 성장 배지, 21.2 mM의 D- 글루코오스, 2 mM L- 글루타민, 2 % B-27, 및 0.1 % 혈장 증량제. 참고 : 신선한 성장 미디어를 준비하기 위해 절개의 날에 L 글루타민 및 B-27를 추가합니다. </li><li> 혈구와 신경 세포를 계산하고, 1.0-1.5 × 10 5 세포에서 24 웰 플레이트에 커버 슬립에 그들을 판 / 잘 500 μl의 성장 미디어와 밀도 후 40 μm의 나일론 메쉬로 여과. </li><li> 5 % CO 2에서 35 ° C에서 신경 세포 문화를 품어 : 95 % 공기 가습 인큐베이터를 2-3주 위해. 최상의 결과를 위해, 배양 중에 최대한 배양을 방해하지 않도록. </li></ol></li><li> 기본의 연결을 문화의 인산 칼슘 (칼슘-P) 형질 <ol><li> 39 ° C에서 원액 저장을 0.5 M BES를 (N은, N은 비스 [2- 히드 록시 에틸] -2- 아미노 에탄 술폰산) 버퍼 (10 배); 150 밀리미터 나 2 HPO 4 (100 배) 2.8 M의 NaCl (10X); 멸균 DDH 2 O; 멸균 1 N NaOH를. </li><li> 형질의 날, 0.22 μm의 필터 DDH 2 O에 신선한 2.5 M CaCl2를 솔루션과 살균 필터를 확인합니다. 0.22 μm의 필터로 pH 7.00 (NaOH를 사용하여 pH를 조절) 및 살균 필터에서 50 밀리미터의 BES 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 280 mM의 NaCl을 함유하는 신선한 배의 BES 완충 식염수 (BBS) 버퍼를 확인합니다. 주 : 형질 할 CaCl2를 용액 및 커버 슬립의 수에 따라 BBS 버퍼의 양을 계산한다. 또한 1.3.4 봐. </li><li> 500 μL 신선한 사전 예열 형질 전환 성장 미디어 문화 성장 미디어를 교체합니다. (형질 미디어는 MEM 플러스 21.2 mM의 D-포도당으로 만들어 질 수있다). 참고 : 기존의 미디어를 버리지 마십시오. </li><li> DDH 2 O의 양을 계산하고 1.65 μL CaCl2를 0.7 μg의 DNA, 및 16.5을 포함하는 형질 감염 용액 (각 커버 슬립 당 33 μL)를 확인하기 위해 추가 제조# 181; 리터 2 배 BBS. </li><li> 문화에 추가하기 전에 즉시 형질 솔루션을 준비합니다. 천천히 튜브를 교반하면서 준비하려면, 먼저 염화칼슘 2 DDH 2 O를 결합한다. 용액에 DNA를 추가 천천히 교반을 계속합니다. 교반하면서 마지막으로, 배 BBS 버퍼가 드롭 현명 추가 할 수 있습니다. </li><li> 바로 신경 세포 배양의 각 coverslip에로 형질 전환 솔루션의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 45 분 - 1 시간 동안 95 %의 공기 가습 인큐베이터 : 용액을 혼합하고 5 % CO 2에서 35 ° C에서 배양하는 배양 접시를 몇 번 바위. 신경 세포는 형질 감염 용액과 함께 배양 한 후, 미세한 CA-P 석출물 뉴런을 덮는 층을 형성한다. </li><li> 500 ㎕를 미리 예열 세척 완충액 (135 mM의 염화나트륨, 20 mM의 HEPES, 4 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나 2 HPO 4, pH가 7.3에서 10 mM의 포도당, 멸균에게로 형질 미디어를 교체 0.22 μm의 필터로 여과) 35 부화6; C 5 % CO 2 : 15 ~ 20 분 동안 95 %의 공기 가습 인큐베이터. CA-P 석출물의 세척 단계 후에 사라질 것이다. </li><li> 500 ㎕를 새로운 성장 배지로 세척 버퍼를 교체합니다. 다시 말하지만, 저장된 원본 미디어와 성장 미디어를 교체합니다. </li><li> 1 mM의 최종 농도에 도달하는 문화 (50 μl의 따뜻한 성장 미디어의 사전 혼합)를 UAA CMN을 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2에서 35 ° C에서 형질 문화를 품어 : 95 % 공기 가습 인큐베이터를 분석하기 전에 12-48 시간 동안. </li></ol></li><li> 빛 활성화와 전체 셀 녹음 <ol><li> 추가 / 세포 내 솔루션을 준비합니다. 세포 내 솔루션은 135 MM의 칼륨, 글루 콘산, 10 mM의 NaCl을, 2 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 HEPES, 1mM의 EGTA, 2.56 mM의 K 2 ATP, pH를 7.4에서 0.3 mM의 리튬 2 GTP가 포함되어 있습니다. 세포 외 기록 용액은 150 mM의 NaCl을 3 밀리미터의 KCl을 포함하고 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 mM의 CaCl2를 5 mM의 포도당 및 pH 7.4의 10 mM의 HEPES. </li><li&gt; 전체 셀 패치 클램프의 전기 생리학 장비를 설정 : 현미경은 4 배 및 20 배 목표, 미분 간섭 대비 (DIC) 및 mCitrine 필터 장착 (: 10분의 495 nm의, 방출 : 여기 25분의 525 ㎚); 속이는 사람; 패치 클램프 증폭기; 디지타이저; 데이터 수집 및 분석 소프트웨어. <ol><li> 45 ° 각도에서 1cm 거리에서 초점이 광을 전달하기 위해 장비에 현미경으로 385 nm의 방출을 가진 발광 다이오드 (LED)를 설치한다. 광 파워 미터와 LED의 전원이 켜져 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 3-6 MΩ 피펫 저항을 가지고 상업 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 전극에서 패치 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫 풀러를 설정하는 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 피펫 저항을 테스트하기 위해, 먼저 세포 용액을 피펫을 채우고 전극 홀더에 위치. 현미경 페이지에 배치 된 세포 외 용액으로 가득 35mm 배양 접시에 피펫을 찍어latform. 회로를 완료하기 위해 음식에 접지 전극을 담근다. </li><li> 앰프 / 디지타이저를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 막 시험 프로토콜 피펫 저항을 모니터링한다. </li></ol></li><li> 인큐베이터에서 신경 세포 문화의 커버 슬립을 가지고 세포 외 용액에 한 번 헹군다. 진공 그리스를 사용하여 신선한 세포 외 용액으로 가득 35mm 배양 접시의 중간에 커버 슬립을 누르고 있습니다. </li><li> 전기 생리학 현미경 플랫폼에서 커버 슬립 / 접시를 놓습니다. </li><li> 표준 패치 클램프 기술을 이용하여 형광 mCitrine 27 뉴런 패치. 현재 클램프 (I-클램프) 방법을 사용하여 녹음 신경 활동. 첫째, 작은 전류를 주입하여 약 -72 MV에 휴식 잠재력을 조정합니다. 그리고, 활동 전위의 연속 소성 (5-15 Hz에서)를 유도하는 단계 전류 (10-200 펜실바니아) 주사. </li><li> 수동 또는 상기 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여 펄스를 플래시 (죄신경 세포에 LED 빛을 100 밀리 초 -1 초 기간)의 GLE 펄스는 기록 및 활동 전위이 영향을 받는지 볼 수있다. </li><li> 목욕에 0.5 mM의 BaCl 2를 추가하고 활동 전위를 복구하는 경우 확인합니다. </li></ol></li></ol> 2. UAA Kir2.1의 설립 및 생체 내에서 마우스 배아 뇌에서 생성 된 PIRK의 발현 <ol><li> DNA 건설 <ol><li> 단계 1.1에서와 마찬가지로 플라스미드 DNA를 디자인합니다. 생체 내 발현를 들어, CAG (CMV 증강 치킨 베타 - 액틴 프로모터) 등의 강력한 프로모터를 사용합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신 무 maxiprep 상업용 키트 DNA를 정제 하였다. (2-5 μg의 / μL에 응축) 매우 높은 품질의 DNA를 취득 에탄올 침전 (25) 다음에 페놀 - 클로로포름 추출을 수행합니다. </li></ol></li><li> 마우스 배아 신피질에 자궁 Electroporation에에서 참고 : 기본 TECHNI을자궁 내 전기에 대한 케는 이전에 28 설명 하였다. <ol><li> 나트륨 펜토 바르 비탈 (복강 내 주사, g 체중 당 50 μg의) 또는 이소 플루 란 (흡입 2-4 %)와 배아 일 14.5 (E14.5)에서 초과 임신 한 마우스를 마취. 의식의 손실과 촉각 자극에 전혀 반응을 확인하여과 발의 곤란에 마취 깊이를 모니터링합니다. </li><li> 복부 정중선에 작은 절개를합니다. 부드럽게 집게와 손가락으로 자궁 뿔이 노출됩니다. </li><li> 자궁 벽을 통해 삽입 된 유리 피펫 각 한배의 새끼의 측면 뇌실에 약 1 ㎕의 DNA 용액 (각 플라스미드의 2-5 μg의 / μL, 구조물에 따라)을 주입한다. 대부분의 경우, 총 배아의 약 60-80%가 주입된다. </li><li> electroporator (33-35 V, 50 밀리 초 지속 시간 950 밀리 초 간격, 4-8 펄스)로 배아를 Electroporate. </li><li> 대한 부드럽게 복강에 자궁 뿔을 돌려줍니다CEPS와 손가락. 근육 벽 봉합 수술 후 봉합으로 피부는 배아 발달을 계속하도록. </li></ol></li><li> UAA 미세 주입 <ol><li> E16.5 다시 복부 정중선에 작은 절개를하고, 부드럽게 집게와 손가락으로 자궁 뿔이 노출됩니다. </li><li> 일렉트릭 측 또는 자궁벽을 통해 삽입 유리 피펫 뇌실의 양측에 약 2-5 μL CMN-의 Ala (500 mm)를 주입한다. 생체 내 21 CMN을 제공하기 위해 디 펩티드 CMN-알라 (CMN 알라닌)를 사용, CMN의 생체 이용률을 증가합니다. </li><li> 다시 말하지만, 집게 손가락 끝으로 부드럽게 복강에 자궁 뿔을 반환합니다. 근육 벽 봉합 수술 후 봉합으로 피부는 배아 발달을 계속하도록. </li></ol></li><li> 급성 뇌 조각을 얻기 <ol><li> 119 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.3 mM의의 MgCl 2, 2.5 mM의 염화칼슘을 함유 한 L 인공 뇌척수 (ACSF)를 확인 <sUB&gt;이, pH가 7.3에서 1 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 26.2 밀리미터의 NaHCO3 및 11 mM의 글루코오스. </li><li> 20 ~ 30 분 -80 ° C에서 200 ML의 ACSF 빠른 동결을 가져 가라. 버블 5 % CO 2 ACSF의 나머지 95 % O 2 가스를 실온에서 첨가 하였다. </li><li> 준비 및 배아에서 뇌를 수확 수술 도구를 소독. 또한 얼음 양동이를 준비합니다. </li><li> 전자 레인지에서 가열 플라스크에 ~ 100ml의 4 % 저 융점 아가로 오스 솔루션을합니다. 이 응고 시작하기 전에 약 5 분 동안 용액을 냉각. </li><li> CO 2 과다 복용에 의한 CMN-알라 주입 후 마우스 12 ~ 24 시간을 안락사. 복부에 큰 절개를 확인하고 미세 가위와 집게로 자궁에서 전기 천공 / 미세 주입 배아를 해부하다. </li><li> 미세 가위와 집게로 배아에서 수확 두뇌. </li><li> 얼음 통에 배치 10cm 배양 접시에 각각의 뇌를 놓습니다. 날카로운 날을 사용하여 두 개의 반구를 나누고, 각각의 장소접시의 바닥을 감동 midsagittal 비행기와 함께 접시에 반구. 신속하게 (반구 ​​당 500 ㎕의 주위에) 머리 위에 아가로 오스 솔루션을 통해 붓는다. </li><li> 날카로운 칼날을 사용하여 사각형 뇌 내장 아가로 오스 블록을 만들기 위해 뇌 주위 아가로 오스를 잘라. </li><li> 조직 접착제를 사용하여, vibratome위한 장착부에 아가 블록 midsagittal 평면을 접착제. 사전 냉장 ACSF와 vibratome 챔버를 입력하고 200 μm의 시상 뇌 조각을 잘라. </li><li> 95 % O 2 가스 : 5 % CO 2와 버블 링하면서 42 분 동안 33 ° C에서 3 밀리미터 미오의 -inositol, 0.4 MM의 아스 코르 빈산, 2 mM의 피루브산 나트륨 보충 ACSF 급성 슬라이스를 품어. </li><li> 42 분 후, 히터를 끄고 버블 링 실온에서 슬라이스를 배양하는 것을 계속한다. 히터를 끄고 전체 셀 패치 기록을 최소 15 분을 시작합니다. </li></ol></li><li> 빛 활성화와 전체 셀 녹음 <ol><li> INTRAC 준비130 mM의 칼륨, 글루 콘산 4 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 HEPES, 1.1 mM의 EGTA, 3.4 mM의 나트륨이 ATP, 10 mM의 나트륨 크레아틴 포스페이트 및 KOH로 조정의 pH 7.3, 0.1 mM의 나트륨 3 GTP 함유 ellular 용액. </li><li> 3-6 MΩ 피펫 저항을 가지고 상업 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 전극에서 패치 피펫을 당깁니다. </li><li> 전체 셀 패치 클램프에 대한 슬라이스 전기 생리학 장비를 설정하고 2 ㎖ / 관류 펌프 분 속도로 ACSF로 기록 챔버를 superfuse. 약 33 ° C로 챔버 온도를 조정합니다. 참고 : 슬라이스 전기 생리학 장비는 관류 챔버, 침수 목적 및 온도 조절 장치가 장착되어 있습니다. 또한, GFP 필터 (여자 : 30분의 480 nm의, 방출 : 40분의 535 ㎚) 및 mCherry 필터 (여자 : 20분의 580 nm의 방출 : 130분의 675 nm의)가 필요합니다. <ol><li> 45 °에서 1cm 거리에서 초점에 빛을 전달하기 위해 장비에서 현미경으로 385 nm의 방출에 LED를 설치하십시오각도. 광 파워 미터와 LED의 전원이 켜져 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 조심스럽게 관류 챔버에 유리 피펫 및 장소 뇌 조각을 선택합니다. 하프와 슬라이스를 누르십시오. </li><li> 신피질 영역 (27)에서 mCherry / GFP의 형광을 가진 신경 세포 패치. 전압 클램프 (V-클램프) 방법을 사용하여 기록 PIRK 활동. 첫째, -60 MV에서 막 잠재력을 보유. 그런 다음, 고정 부정적인 막 전위 (-100 MV) 또는 전압 램프 (+40 MV -100 MV)에 기록 전류. 특히, -100 MV에서 Kir2.1 특정 안쪽으로 전류를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 수동 또는 상기 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여, 기록하면서 신경에 LED 광 펄스 (100 밀리 초 시간 -1의 단일 펄스) 플래시 및 PIRK 단백질이 활성화되어 있는지. PIRK가 활성화되면, -100 Mv로 내향 전류가 크게 증가 할 것이다. </li><li> 목욕에 0.5 mM의 BaCl 2를 추가하고 PIRK 다시 불 활성화되어 있는지 확인. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

효율적인 광 변조를 달성하기 위해, 중요한 초기 단계 여기서 표적 단백질의 감응성 UAA를 통합하기로 결정한다. 표적 단백질의 구조 및 기능 정보는 후보 위치의 선택을 안내하기 위해 매우 유용하다. 동시에, 광 조절의 목적은 최적 인 위치를 결정한다. 후보 사이트를 선택한 후, 우리는 차 신경 세포와 생체 내에서 진행하기 전에 이러한 인간 배아 신장 (HEK) 쉽게 문화와 조작을위한 세포와 같은 포유 동물 세포 라인의 사이트를 테스트하는 것이 좋습니다. Kir2.1 photoactivati​​on에 대한 사이트를 확인하려면, Kir2.1의 기공을 따라 여러 사이트는 처음 HEK 세포에서 테스트되었습니다. CMN 측쇄는 이온 통로를 차단하는 C169 상주 Kir2.1 공경 CMN 측쇄를 수용 할 수있을만큼 충분히 크지 만 작기 때문에 Kir2.1의 C169은 최적 발견되었다. CMN은 Kir2.1에 C169에 통합 될 때 HEK 세포에서 발현, t그는 돌연변이 Kir2.1가 비활성 상태였다 결과 만 성공 PIRK 개발 (21)을 확인, 빛의 짧은 가냘픈 소리로 울다에 활성화되었다. 효율적인 직교의 tRNA 합성 효소 발현 및 세포 및 생체 내에서 높은 UAA 혼입 효율을 얻는 것이 중요하다. 직교 합성 효소 유전자를 효율적으로 종종 포유 동물 세포 및 뉴런에서 사용되는 중합 효소 II 프로모터 및 폴리-A 신호를 이용하여 표현된다. 이전 18,20 바와 같이 함께 3&#39;- 플 랭킹 서열과 같은 여기서 사용 H1 프로모터 직교 tRNA의 특별한 유형 -3- 효소 III 프로모터의 발현을 위해 필요하다. 생체 내 연구를 위해, 우리는 tRNA의 발현 카세트 3 부를 하나의 복사본 (도 5a)에 비교 CMN 혼입 효율을 증가하였습니다. 포유 동물 세포에서 다른 연구에서, tRNA의 발현 카세트의 수를 늘리면 UAA 혼입 효율 (30) 증가 하였다. THERUAA 혼입 효율 개선이 필요한 경우는 efore, 우리는 다른 Uaas 세포 및 표적 단백질의 tRNA 발현 카세트의 수를 최적화하시기 바랍니다. 세포 및 생체 내에서 Uaas의 생체 이용률은 UAA의 통합에 대한 또 다른 중요한 요소입니다. 이전 연구는 Uaas의 에스테르 화는 포유 동물 세포 (31)에 자신의 흡수를 증가 보여 주었다, 그리고 디 펩티드 형태로 Uaas의 준비는 예쁜 꼬마 선충 (32)의 세포로 UAA 흡수를 증가시킨다. 우리는 직접 신경 세포 배양 배지에 CMN을 공급하는 생체 (21)의 마우스 뇌 통합하기위한 Kir2.1에서 CMN 법인 배양 차 신경 세포에서 발현 충분하지만, 불충분 한 것으로 나타났습니다. 따라서, 디 펩티드 CMN-알라 합성 마우스의 뇌에 주입 하였다. 올리고 펩티드 수송 PEPT2은 매우 신경 세포로 디 펩티드의 수송을 용이하게 할 수있다 쥐의 뇌 (33)로 표현된다. 내재화 DIPEptide는 통합에 대한 UAA CMN을 생성하는 세포 펩 티다 제에 의해 가수 분해 될 것이다. 사실,이 최적화 우리는 신피질, 시상과 시상 하부 (21)를 포함하여 배아 마우스 뇌의 여러 영역에서 신경 세포의 단백질로 효율적인 CMN의 통합을 달성했다. 신경 세포의 성공적인 PIRK 식 건강의 연결을 문화의 준비에 크게 의존한다. 프로토콜의 모든 단계는 정밀하고 섬세한 방식으로 수행되어야한다. 문화의 준비 후에는 방해하지 않고 인큐베이터에있는 문화를 유지하는 것이 가장 좋습니다. 열기 및 인큐베이터 문을 닫는뿐만 아니라 및 인큐베이터에서 배양 접시를 이동, 문화의 질을 훼손를 추가 할 수 있습니다. 낮은 인큐베이터 온도 (대신 37 ° C 35 ° C)는 흥분 독성을 줄일 수 있습니다. 비슷한 메모에서, CA-P 형질 전환은 추가주의해야합니다. 배 BBS 버퍼의 준비는 중요한 단계입니다. 칼리하는 것이 좋습니다새로운 DNA 구조 또는 최상의 상태로 준비가 형질 전환 조건을 변경할 수 있기 때문에, pH가 6.90-7.15 사이 2 배 BBS 버퍼에 대한 최적의 pH를 brate. 이 일관성있는 결과를 달성하는 데 도움이 경우 버퍼 pH는 0.01 자리 정밀하게 조절 될 수있다. 형질 감염 전에, 신경 세포 배양의 성장 배지를 신선한 것으로 교환된다. 원래 성장 배지를 저장하고, 원래 상태를 복원하는 형질 감염 후 배양에 다시 추가하는 것이 중요하다. 이 같은 신경 세포에서 방출 성장 인자로 세포 증식을위한 핵심 분자가 부족하기 때문에 형질 전환 후 신선한 미디어에서 신경 세포 문화를 유지하는 것은, 복구에서 뉴런을 방해 할 것입니다. 배양 된 세포 및 조직 조각에서 PIRK의 빛 활성화, 적절한 광원 및 전달 방법에 대해 결정해야합니다. CMN은 긴 중파 자외선 등 (280-400 nm의)를 흡수한다. 그러나, 특히 단파장 UV 광을 셀에 유해한 것, UV 광에 노출을 연장. 샘에서전자 시간은 원적외선 빛이 세포를 교란 시료를 가열 할 수있다. 따라서, 단일 파장의 방출을 가진 LED는 PIRK 활성화를위한 가장 좋습니다. 선택되었다 CMN의 광분해를 들어, 385 나노 미터 (Prizmatix ~ 40 MW)의 방출과 LED. LED는 외부 현미경 근처에 설치되고, 광섬유가 초점에서 신경 세포에 정확히 빛을 전달하는 데 사용된다. 재생 가능한 데이터 수집의 경우, 광학 섬유는 1cm 거리에 초점이 신경 세포에서 45 ° 각도로 설정되어 있습니다. 시료에 광 전력은 40 mW의 / cm 2로 측정 하였다. 또한, 주기적으로 광 파워 미터를 이용하여 LED의 성능을 확인하기 위해 추천된다. 우리는 자궁에서 전기 유전자 생체 Uaas을 포함하는 효과적인 방법임을 보여준다. 약간의 수정과 함께 이전 34 설명한대로 마우스 배아 신피질으로 플라스미드 DNA의 자궁 전기 행한다. neonata에서 PIRK 단백질을 표현하는리터 마우스의 뇌는 두 수술 (그림 5B)가 필요합니다. 첫 번째 단계는 일렉트로 다음 PIRK 발현 유전자 작 제물을 주사한다. 이틀 후, 제 뇌 분사 CMN-의 Ala를 전달하기 위해 수행된다. 이 능숙 너무 많은 동물을 강조하지 않고 수술을 수행하는 데 실제로 필요하다. 각각의 수술 후, 동물은 보살펴되어야하며, 회수에 걸쳐 정기적으로 조사했다. 뇌의 CMN의 충분한 적시 여부는 적절한 PIRK 발현을 위해 필수적이다. CMN-의 Ala (500 mM)을 2-5 μL은 전형적으로 배아 뇌에 주입된다. 때로는 확장 된 CMN 공급 일렉트릭 측에 확산되는 것 모두 일렉트릭과 반대측에서 CMN-알라 보낸 반대쪽 반구의 뇌실 CMN-의 Ala를 주입하도록 돕는다. 자궁의 전기에서의 일반 유틸리티를 고려하면,이 기술은 신피질 뉴런뿐만 아니라 신경 세포에뿐만 아니라 적용 할 수이러한 전기 / 주사 부위가 각 지역 조정 줄무늬, 간뇌, 그리고 소뇌와 같은 다른 뇌 영역입니다. 배아 / 신생아의 뇌는 성인 뇌보다 훨씬 부드럽고, 그래서 전기 생리학 실험에 급성 슬라이스를 얻을 어렵습니다. 아가로 오스 삽입은 vibratome 절단 배아의 뇌 구조를 안정화하는 데 도움이됩니다. 저 융점 아가로 오스는 뇌 조직에 온도 충격을 최소화 할 수 있지만 차가운 두뇌를 통해 아가로 오스 녹아 쏟아져 때주의가 필요하다. 아가 매립의 조직 온도 충격의 효과는 전체 셀 기록시 띄지이었다. 유 전적으로 그 나라의 환경에서 빛으로 다양한 신경 세포 단백질의 활동을 제어하기 위해 optogenetic 기술을 감당할 여기 PIRK의 예로, 배양 신경 세포와 생체 내에서 광 감응성 Uaas을 것입니다 인코딩. 현재 프로토콜 PIRK 발현 및 활성화 제가 실험을 수행하기위한 단계별 과정을 제시신경 세포 배양 시험관 및 포유 동물의 뇌에 사용하는 UAA 시스템의 최초의 성공적인 개발을 나타내는 생체 내에서 쥐의 뇌에서 N. 그것은 많은 천연 단백질의 연구뿐만 아니라 질병에 자신의 의미를 혜택을 가능성이있다. 예를 들어, α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 및 N- 메틸 -D- 아스파 테이트 (NMDA) 수용체 채널 Kir2.1와 마찬가지로 트랜스 구조를 공유한다. 그러므로 이러한 리간드 관문 이온 채널 PIRK 방법을 적용 가능하다. 또한, PIRK 기술은 또한 안데르센 증후군과 심장 짧은 QT 증후군 (35, 36)로 Kir2.1 관련 유전 질환의 병태 생리를 해결하기 위해 이용 될 수있다. &quot;블록 - 방출&quot;외에 CMN 통해 Cys이고, 예컨대 티로신, 세린, 라이신, 글루탐산, 아스파르트 산, 글리신 등의 아미노산 여러 상이한 photoreleasable 기 (37)에 갇힌되었다. 따라서, 유사한 전략을 사용 할 수 있습니다D에 대한 시험 관내 및 생체 내에서 신경 세포에서 이러한 아미노산을 사진 - 조절한다. 또한, 가역적 광 제어 Uaas를 아조벤젠을 함유하여 달성 될 수있다, 이러한 Uaas 해주기 유전자 E.으로 인코딩 된 대장균과 포유류 세포 (38, 39). 요약하면,이 프로토콜은 광이 그 나라의 설정에서 신경 단백질의 활성을 조절하는 일반적인 방법을 제공한다. 옵신 - 가족과 다른 빛에 민감한 단백질 또는 도메인을 포함하는 다른 optogenetic 방법에 비해,이 방법은 유 전적으로 빛에 민감한 Uaas 변경에게 단 하나의 잔류 물을 인코딩 사용합니다. 따라서 연구중인 표적 단백질의 기능, 인신 매매 및 지역화에 대한 최소한의 간섭을해야한다. 높은 사이트 선택은 상세한 분자 조사를 위해 더 큰 유연성과 특이성을 제공하기 위해 이러한 유전자 인코딩 된 빛 응답 Uaas 달성 할 수있다. 이 프로토콜은 또한 제 CO 제공mprehensive, 쉽게 따라 성공적으로 생체 외 및 생체 내에서 신경 세포에서 단백질로 Uaas을 통합하는 방법 절차를. 체외에서 신경 세포 및 생체 내에서 유전자 인코딩 Uaas를 통해 일반적으로 단백질의 광 제어는 기본 및 병진 모두 과학에 도움이 할 수있는 큰 잠재력을 가지고 있으며,이 프로토콜은 응용 프로그램을 홍보하는 데 도움이됩니다.

종래의 전기 자극에 비해 photostimulation는 시편의 생리적 시스템에 최소한의 간섭이 큰 시간과 공간 분해능을 제공합니다. 1971 1 뉴런을 자극하는 레이저를 사용하여 데모 때문에 많은 창의적인 방법은 외인성 광 신경 세포 활성도를 조절하도록 고안되었다. photocaged 작용제의 광 방출은 긴 리간드 2,3,4에 신경 네트워크의 생리적 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 기술로 인해 갇힌 작용제의 확산에 특이성을 제한하고있다. 유전 적 특이성은 ectopically 표현하는 빛에 민감한 옵신 채널에 의해 달성 5,6,7 펌프, 그리고 성공적으로 다양한 모델 생물에서 선택한 신경 네트워크를 조절하는 적용된된다. 그러나, 다른 단백질로 옵신 단백질로부터 photoresponsiveness 그래프트 때문에, 각종 광학 신경 단백질을 제어하기 위해이 방법을 적용하기 어렵다 woul연구중인 단백질의 고유 특성을 변경할 수 강렬한 공학 필요할 거라고. 화학적 단백질 외인성 감광성 리간드 채널 8,9,10 단백질의 기능을 제어하는 다른 방법을 설명했다 테 더링. 리간드 제시하거나 아조벤젠 부분의 광 이성화를 통해 단백질의 결합 부위로부터 배출된다. 더링 화학 세포 내 측면 및 세포 내 단백질을 제외하고, 주로 막 단백질의 세포 외 측 애플리케이션을 제한한다. 광 감응성 Uaas는 단백질에 통합 된 후, 광 단백질을 조작 할 수있는 일반적인 전략을 제공합니다. photocaged Uaas 그들의 구조 - 기능 관계 12,13,14 이해를 고급 막 수용체 이온 채널 (11)로 Uaas를 통합하는 제노 푸스 난 모세포에 미세 주입 하였다 이른 노력에서 tRNA를 화학적 실화.이 미세 주입 방식은 주로 큰 난자로 제한됩니다. UAA 유전 혼입 생균 15,16,17,18에서 내인성 단백질 번역을 통해 UAA를 포함하는 직교의 tRNA / 합성 쌍을 사용하여 아실 tRNA에 미세 주입 및 기술적 도전을 우회. 신경 세포의 단백질로 UAA의 통합은 기본 신경 세포와 신경 줄기 세포 (19, 20)에서 입증되었다. 최근 광 감응성 UAA 유전자 처음 21 생체 내에서 포유 동물의 뇌에서 신경 세포 단백질에 통합되었다. 이러한 발전은 그 나라의 셀룰러 환경에서 Uaas와의 연결 단백질을 연구하는 것이 가능합니다. 내향 정류 칼륨 채널 Kir2.1 셀 중 이상으로보다 용이 K + 전류를 통과 강한 정류기이며, 흥분성 세포, 혈관 톤, 심박수, 재를 포함한 생리 과정 조절에 필수적인최종 소금 흐름과 인슐린 (22)를 놓습니다. Kir2.1 과발현 이하 흥분성 23,24된다 표적 뉴런의 막전위를 hyperpolarizes. 광학의 기본 세포에서 Kir2.1를 제어하려면, 강 등은. 유전자 Kir2.1에 사진 응답 UAA는 포유 동물 세포, 신경 세포 및 배아 마우스의 뇌 (21)로 표현 된 통합. 빛의 짧은 펄스 따라서 목표 Kir2.1 단백질의 활성화, 천연 아미노산을 시스테인으로 변환 UAA 수 있었다. 이 사진 - 유도 내향 정류 칼륨 (PIRK) 채널 단백질 래트 해마 뉴런의 기본 발현되면, 광 활성화에 응답 신경원 발화를 억제 하였다. 또한 PIRK 채널은 마우스 배아 신피질로 표현하고, 대뇌 피질의 신경 세포에 광 활성화 PIRK 전류를 측정 하였다. 포유 동물 뇌의 생체 내에서 UAA 기술의 성공적인 구현은 광학 신경 단백질을 제어하는 문을 열어그 나라의 환경에서, 분자 레벨에서의 연결 프로세스 및 메커니즘 광 박리를 가능하게한다. 이 프로토콜에서 우리는 문화와 생체 내에서 배아 마우스 뇌의 기본 뉴런에 Uaas의 유전 설립을위한 절차를 설명합니다. 감응성 UAA CMN 및 Kir2.1 과정을 설명하기 위해 사용된다. 방법 성공 UAA의 통합 및 제공되는 신경 세포의 단백질 활성의 광학 제어를 평가합니다. 이 프로토콜은 유전자 신경 세포와 생체 내에서 Uaas를 인코딩 및 광학적 광 감응성 UAA를 통해 신경 세포의 단백질 기능을 조절하는 데에 명확한 지침을 제공합니다. 우리는이 프로토콜은 신경 과학 및 optogenetic 생물학적 연구를위한 생체 UAA 기술의 채택을 촉진 할 전망이다.

<table><tbody><tr><td>Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Iris Spatula-curved</td><td>Fine Science Tool</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Knife - Fine Angled Tip</td><td>Fine Science Tool</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, &lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>LED LIGHT SOURCE &amp;ndash; Black LED 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

유전자 신경 세포에서 단백질로 UAA를 통합하려면 첫 번째 중요한 단계는 적절한 유전자 전달 및 신경 세포에 효율적으로 유전자를 표현하기 위해 구축 설계하는 것입니다. UAA 혼입 세 유전 요소가있다 : (1) UAA 혼입 (2) 돌연변이 TAG 정지 코돈을 인식하는 직교 tRNA는, (3), 직교 아미노 아실 대하여 선택된 사이트에 도입 TAG 앰버 정지 코돈과 표적 유전자 -tRNA 합성 효소는 직교 tRNA의 상 UAA를 충전합니다. 각 구성 요소는 적절한 프로모터에 의해 구동 될 필요가있다. 이러한 세 가지 유전자 카세트는 하나의 플라스미드를 포함하거나 여러 플라스미드를 분리 할 수​​있다. 신경 세포에서 PIRK을 표현하기 위해, 광 반응성 UAA CMN은 직교 tRNA에 레우 CUA / CmnRS (CMN-의 tRNA 합성 효소) CMN 21,29에 대해 구체적으로 진화 쌍을 사용하여 Kir2.1에 포함된다. Kir2.1 유전자의 잔류 Cys169은 TAG 황색 정지 코돈 (Kir2으로 변이된다.1-TAG) 및 mCitrine는 신경 세포 문화 PIRK 식을 시각화 Kir2.1의 C 말단에 융합하는 형광 단백질 (그림 1). 좋은 품질의 연결을 문화를 얻는 것은 성공 PIRK 실험의 전제 조건입니다. 출생 후의 일 1-4 스프 라그 돌리 쥐 새끼는 일반적으로 신경 세포 배양 제조에 사용되는, 아직 쥐의 배아도 자주 사용된다. 1.0-1.5 × 105 세포 / 웰 밀도로 24 웰 플레이트에 커버 슬립에 도금 할 때, 하나는 너무 많이하지 미세 아교 세포 또는 다른 파편 (그림 2A)와 잘 구분 건강한 신경 세포를 볼 수 있습니다. 건강한 신경 광범위한 공정을 가지며, 균체 (소마) (도 2B) 통통이다. 특유 볼 수 suborganelle 구조는 일반적으로 건강에 해로운 문화의 상징이다. 신경 세포 배양은 5 % CO 2에서 35 ° C 2-3 주 동안 유지 될 수있다 : 95 % 공기를 가습 인큐베이터. 기음alcium 인산 (CA-P) 형질 민감한 신경 세포 배양에 적합한 매우 부드러운 형질 전환 방법이다. 그러나 신경 세포에 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해 극도의 정밀도와주의가 필요합니다. 스톡 용액은 4 ℃에서 보관하고, 형질 당일 배 BBS 완충액을 혼합 할 필요가있다. 정확한 pH 조절은 재현 성공적인 결과를 얻을 수있는 열쇠입니다. 2.5 M CaCl2를 용액은 형질 당일 신선한하여야한다. 모든 버퍼를 필터링 할 필요가있다. 또한, 고순도 품질 신선한 DNA 플라스미드 결과를 향상시킨다. 최상의 결과를 얻으려면 하나의 신선한 DNA의 미니 - 수험 공부를 얻을 수 없습니다 자란 대장균 문화 (~ 진탕 배양기에서 37 ° C에서 12 시간). 모든 버퍼들이 준비가 된 후, 조직 배양 후드에서 솔루션을 제공하고 형질 전환을위한 준비. 혼합하면서 저속으로 와류를 사용하여, 형질 감염 용액을 교반한다. 즉시 신경 CU에 혼합 용액을 추가lture, 다시 배양기에 배양 접시를 가져온다. 45 분 - 1 시간 후 형질를 중지하고 연속 배양의 문화에 원래 성장 미디어를 추가 할 수 있습니다. 형질 감염은 (도 3)이 종료 된 후 형질 뉴런은 6 시간에서 가시화 될 수있다. 배양액에서 CMN의 존재 PIRK이 발현되고 발현 PIRK 뉴런 인해 PIRK의 C 말단 (도 3D)을 융합 단백질 mCitrine 녹색 형광체이다. PIRK 발현하는 신경 세포는 정상적인 생리 기저 있고 그들은 주입 전류 (도 4)에 응답하여 활동 전위를 소성 할 수있다. 그러나, 활동 전위의이 시리즈는 셀 (그림 4A)에 빛나는 짧은 광 펄스로 즉시 억제된다. 0.5 mM의 BaCl 2에서, Kir2.1 특정 억제제는, 욕조에 첨가되는 경우, 소성 후 신경 이전 억제가 L에 의해 Kir2.1의 활성화에 기인 것을 나타내는 재개ight (그림 4B). 형질 감염되지 않은 제어 뉴런은 빛이나 바 2+ (그림 4C, D)에 응답하지 않습니다. 생체 내에서 PIRK을 표현하기 위해, 고순도 농축 DNA 플라스미드 (2-5 μg의 / μL)를 제조한다. 이 실험에 사용 된 특정 플라스미드를도 5a에 나타낸다. 직교 tRNA에 레우 CUA / CmnRS 쌍을 대상 Kir2.1-TAG 유전자, 태그 돌연변이 (GFP-TAG)와 함께 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자 외에도 형광 기자로 공동 일렉트로입니다. GFP의 TAG 억제가 tRNA에 레우 CUA과 CmnRS을 필요로 둘 것이기 때문에 GFP의 형광 검출, 세 플라스미드의 성공적인 전달을 나타냅니다; 두 유전자가 동일한 셀에 존재하기 때문에 GFP-TAG에 CMN 법인은 잘 Kir2.1 - TAGas에서 CMN의 설립을 제안했다. 세 유전자 작 제물 모두 인제있다E14.5에 마우스 배아의 측면 뇌실 (그림 5B, 왼쪽 패널)에 cted. 전기 천공 후, 배아 발달을 계속하도록 복강에 배아를 반환한다. 이틀 후, DNA 주입 (도 5B, 중간 패널)와 유사한 방식으로, 일렉트릭 측 또는 뇌실의 양측에 약 2-5 μL CMN-의 Ala (500 ㎜)에 주입. 다시 말하지만, 지속적인 개발을위한 복강에 배아를 반환합니다. 배아 화상 또는 전기 생리 학적 분석을 위해 E17.5 수거 할 수있다. 예상 한 바와 같이, 단 CMN-알라 분사와 녹색 형광 세포는 마우스 신피질에서 관찰된다. 빨간색과 녹색 두 형광을 가진 세포는 CMN은 PIRK 채널 (도 6a)를 만들기 위해 Kir2.1-TAG에 통합해야합니다. 이 신경 세포 문화에 완료로 배아 신피질 조각에서 전체 셀 녹음 유사하게 이루어집니다. 녹색과 빨간색 형광 뉴런은 북동에서 더 안쪽으로 현재이 없다gative는 잠재력을 보유하지만, 빛의 짧은 펄스가 빠르게 안쪽으로 전류 (그림 6B)를 활성화합니다. 전류는 완전히 그것을 PIRK 의해 생성되는 것을 확인 학사 2+ 첨가에 의해 차단된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig1.jpg" /> 그림 1 :. 신경 세포 배양 체계가 신경 세포 문화 PIRK 표현하기위한 예시적인 플라스미드 디자인을 보여주는 PIRK 발현 플라스미드를 설정합니다. 상위 플라스미드는 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터 하에서 C169 사이트에서 하나의 아미노산 돌연변이와 Kir2.1 유전자 (회색)을 인코딩한다. C169은 UAA CMN이 통합 될 것 TAG 황색 정지 코돈에 돌연변이된다. Kir2.1 유전자 mCitrine 유전자 (녹색)에 의해 이어진다. mCitrine는 PIRK 발현 세포를 시각화하기 위해 Kir2.1 유전자의 C- 말단에 융합된다. 하단 플라스미드는 마우스 포스 포 글리세 레이트 키나제 1 (mPGK) 프로모터에 의해 구동 CmnRS (핑크)에 CMN 특정 합성을 암호화한다. tRNA의 <sup<html> &gt; 레우 CUA (청색), 직교 tRNA의 21도이지만, 역방향에서, H1 프로모터에 의해 구동되는 동일한 플라스미드에서 발현된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig2.jpg" /> 그림 2 : 쥐 해마 차의 연결을 문화 건강한 쥐의 해마 신경 세포의 문화를 보여주는 대표적인 사진.. (A) 체외에서 10 날의 연결을 문화의 DIC 이미지 (DIV). 그들이 수상 돌기 및 축삭을 분기로 신경 세포가 성숙. 미세 아교 세포 (프로세스없이 작고 둥근 세포) 공존하지만 문화를 압도하지 않습니다. (B) 건강 배양 된 신경 세포의 확대 DIC 이미지입니다. 건강한 신경 세포가 통통 세포체 (소마)를 전시 및 수상 돌기 / 축삭 발음. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53818/53818fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;_content <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig3.jpg" /> 그림 3 :. 배양 차 뉴런에서 PIRK 식 DIC 및 체외에서 배양 및 PIRK 발현도 1에 도시 된 유전자 구조와 형질 전환 쥐의 해마 신경 세포의 형광 이미지. CMN은 형질 감염 (A 및 B) 후 배양액을 첨가하지 않은 경우에는 녹색 형광 신경 세포에서 검출되지 않는다. 성장 미디어 CMN (1 ㎜)의 존재, 형질 전환 된 뉴런 따라서 녹색 형광 (C와 D)를 보여, 전체 길이 PIRK - mCitrine 단백질을 발현 할 수있다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53818/53818fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> .JPG &quot;/&gt; 그림 4 :. PIRK의 빛 활성화는 쥐의 해마 신경 세포에서 발사 억제합니다은 (A) 하나의 광 펄스는 PIRK을 표현하는 해마 신경 세포의 활동을 억제한다. 대표적인 전압 트레이스 전류 클램프에 연속적으로 기록된다. 활동 전위 소성 (20)는 pA 전류 주입 (I 단계)에 의해 유발된다. 빛 노출 (385 나노 미터, 40 mW의 / cm 2, 1 초, 화살표로 표시)은 신속하고 완전하게 신경 발사를 억제한다. 소성 선택적 Kir2.1 채널을 억제하는 세포 외 500 mM의 BaCl 2로 복원됩니다. (B) 자외선 (UV) 조명 (385 나노 미터, 40 mW의 / cm 2, 6 초, 노란색 상자로 표시)을 제어 형질 감염되지 않은 신경 세포의 흥분을 변경하지 않습니다. 활동 전위 소성 50 pA에 전류 주입 (I-공정)에 의해 유발된다. (C와 D) 어느 UV 조명도 BaCl 2 (500 mM)을 제어 신경의 흥분에 영향을 미칩니다. 강력한 액션IAL 50 pA에 전류 주입 (I-공정)에 의해 유발된다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig5.jpg" /> 그림 5 : 생체 내에서 마우스 신피질에서 PIRK 발현을위한 절차. (A) PIRK 발현 플라스미드를 설정합니다. 최고 플라스미드 : 내부 리보솜 항목 사이트 (IRES)를 통해 CAG 프로모터 및 mCherry에 의해 구동 CmnRS의 플라스미드. mCherry 형광은 CmnRS의 성공적인 발현을 확인합니다. 중동 플라스미드 : tRNA에 레우 CUA, CMN의 설립 (21)에 대한 직교 tRNA의 세 사본과 함께 Kir2.1 유전자의 플라스미드. 아래 플라스미드 : GFP_Y182 태그의 플라스미드. GFP의 유전자는 사이트 (21)에 태그를 CMN의 성공적인 통합을 시각화하기 위해 허용 Tyr182 사이트에서 황색 정지 코돈 (GFP_Y182의 TAG)으로 설계되었습니다. (B) 만화 소날개 생체 내에서 PIRK 식에 대한 실험 절차. PIRK 발현 유전자 구조는 마우스 신피질 (E14.5)에 주입 및 자궁 (왼쪽 패널)에 전기 천공된다. 이틀 후, CMN-알라는 일렉트로 측의 심실 또는 대뇌 반구의 양면 (중간 패널)에 주입된다. 슬라이스 영상과 전기 생리 학적 분석은 E17.5-E18.5 (오른쪽 패널)에서 수행 될 수있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig6.jpg" /> 그림 6 : 마우스 신피질 빛 활성화에 PIRK 식입니다. 생체 내에서 GFP 및 Kir2.1 단백질에 CMN의 결합을 보여주는 마우스 배아 대뇌 피질의 뉴런의 (A) 형광 이미지. 도 5a에있는 세 개의 유전자 구조는 자궁 내에서 전기 천공된다. mCherry 형광은 CMN 특정 상테의 성공적인 표현을 보여줍니다아제 유전자 CmnRS. GFP의 형광 GFP 태그와 Kir2.1 TAG의 가능성 CMN 법인에서 CMN의 통합을 나타내는 만 CMN-알라 주입 (아래)로 검출된다. 따라서, 녹색 및 적색 형광 세 플라스미드 및 CMN의 통합을 성공적으로 표현을 나타냅니다. PIRK의 빛에 의존 활성화를 보여주는 신피질 뉴런 쥐에서 기록 된 전류의 (B) IV 플롯. 도 5a에서의 유전자 구조는 전기 천공 된 이틀 후, CMN-알라는 자궁에 주입 하였다; 12-48 시간 CMN-알라 주입 한 후, 신피질 급성 조각은 배아에서 제조 하였다. 모두 빨간색과 녹색 형광에 의해 검출 된 조각에 신경을 PIRK가 발현 (검은 색) 전에 기록되어있다 (파란색) 빛 노출 (385 nm의, 8 mW의 / cm 2, 포화 노출 10 초) 후. BaCl 2 (500 mM)을 photoactivation (오렌지) 후 PIRK 특정 전류를 확인하기 위해 추가됩니다.

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Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.9K 조회수.  Tufts University. Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

생화학

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical properties, the amino acid has multiple uses in biochemical applications. This report describes a protocol for the genetic incorporation of biosynthesized DOPA and its application to protein conjugation. DOPA is biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase (TPL) from catechol, pyruvate, and ammonia, and the amino acid is directly incorporated into proteins by the genetic incorporation method using an evolved aminoacyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pair. This direct incorporation system efficiently incorporates DOPA with little incorporation of other natural amino acids and with better protein yield than the previous genetic incorporation system for DOPA. Protein conjugation with DOPA-containing proteins is efficient and site-specific and shows its usefulness for various applications. This protocol provides protein scientists with detailed procedures for the efficient biosynthesis of mutant proteins containing DOPA at desired sites and their conjugation for industrial and pharmaceutical applications.

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

Here, we present a protocol for the genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized from simple starting materials and its application to protein conjugation.

Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

화학

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

행동분석학

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

생체공학

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

요약

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손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

전압 클램프 형광 측정법

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Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

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Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합

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자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

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연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

형광 단백질에서 프롤린 유사체에 의한 프롤린의 잔기 특이적 교환 : 백본의 "분자 수술"이 폴딩 및 안정성에 미치는 영향

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는 방법