This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

동물 작품은 프리 부르, 스위스의 수의학 사무실의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 우리 기관에서 동물 관리 및 실험에 대한 가이드 라인을 따른다. 격리 된 동맥의 배양을위한 셋업 1. 준비 <ol><li> 37 ° C로 가열하고, 탄소 가스 탱크 95 % O 2, 5 % CO 2 통기 될 수 기관 욕 시스템을 구축. </li><li> 다음 조성물의 농도가 필요한만큼 크렙스 - 링거 중탄산 버퍼 준비 (118 mM의 염화나트륨, 4.7 mM의 KCl을 2.5 mM의 CaCl2를 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 NaHCO3을, 0.026 mM의 EDTA, 11.1 mM의 글루코오스 D). </li><li> 얼음에 주식 버퍼를 유지하고 95 % O 2 5 % CO 2와 버퍼를 공기에 쐬다. </li><li> 오르간 조 시스템 스위치는 37 ° C의 온도를 설정 한 각 실에 즉시 사용 완충액 5 mL를 추가95 %의 O 2 5 % CO 2와 버퍼를 폭기 유지. </li><li> 30 분 동안 크렙스 - 링거 버퍼에 한 번 실을 씻으십시오. </li><li> 각 실에 5 ml의 크렙스 - 링거 버퍼를 추가하고 증발을 방지하기 위해 챔버 커버. </li></ol> 마우스 대동맥 2. 분리 <ol><li> 마우스를 희생 150 밀리그램 / kg의 농도로 복강 0.9 % 염화나트륨에 용해 펜토 바르 비탈을 주사. </li><li> 수술 보드 드러 마우스를 놓습니다. </li><li> 위생 및 습기의 목적 70 % 에탄올로 가슴 영역 모피 스프레이. </li><li> 리브 주위에 절단 엽니 다 흉강은 심장과 폐를 노출하고, 폐를 제거합니다. </li><li> 종이 티슈로 부드럽게 흉강에 혈액을 제거합니다. </li><li> 집게로 조심스럽게 마음을 잡고 수술 가위로 대동맥과 척추 사이의 혈관 주위 지방 조직을 절단하여 흉부 대동맥을 분리합니다. </li><li> 즉시도 ë 몰입얼음 감기 (4 °에 C) 크렙스 - 링거 버퍼 전자 조직. </li><li> 해부 현미경으로 심장과 대동맥 궁을 제거하고 버퍼에 흉부 대동맥 세그먼트를 유지합니다. </li><li> 수술 가위와 집게와 현미경으로 혈관 주위 조직을 준수없는 대동맥을 해부하다. </li><li> 집게와 대동맥의 끝 가장자리를 잡고 조심스럽게 26 G × 1 / 2&quot; 주사기 크렙스 - 링거 버퍼를 세척하여 혈관 내강의 혈액을 멀리 세척합니다. </li><li> 3mm 길이 세그먼트로 청소 대동맥 고리를 잘라. 참고 : 내피 층을 손상하지 않도록이 단계에서주의를 기울이십시오. </li></ol> 3. DHE와 DAF-2DA 염색 <ol><li> 37 ° C에서 크렙스 - 링거 버퍼 가득 기관 목욕 챔버에 집게로 청소 대동맥 세그먼트를 이동시켜 95 % O 2, 5 % CO 2 폭기. 집게로 대동맥 반지의 터치 만 외막 측과 B를 고정하지 않습니다 참고들 (100d) 선박. </li><li> 30 분 기관 욕 실 동맥 평형. </li><li> 최종 농도 1 μM의 장기 욕조에 아세틸 콜린 (ACH)를 추가하고 10 분 동안 동맥을 품어. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 미리 예열 크렙스 - 링거 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 된 각 염료의 5 μM) DHE / DAF-2DA 용액 1 ㎖를 준비합니다. 빛의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 감싸. </li><li> 자극 후, 37 ° C에서 마이크로 원심 튜브 DHE / DAF-2DA 용액 오르간 조로부터 대동맥 고리를 전송할 95 % O 2, 5 % CO 2 통기하고, 30 분간의 대동맥 고리를 배양한다. 참고 :이 단계에서, 어둠 속에서 항상 대동맥을 유지합니다. </li><li> 세척 크렙스 - 링거 버퍼와 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥 고리를 전송하고 1 분 이내에 세탁을 세 번 반복한다. </li><li> 30 고정 용 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 대동맥 링을 이동시켜분. </li><li> 준비 1 ml의 4 &#39;, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 300 nm의) 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 솔루션입니다. 3 분 동안 대동맥을 Counterstain과. </li><li> 1 분 동안 세척 PBS 버퍼 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥을 전송합니다. 세탁 세 번 반복합니다. 주 : 대동맥 고리를 고정 또는 내피 층이 손상되지 않도록주의를 기울이십시오. </li></ol> 설치 4. 욕실 얼굴 <ol><li> 슬라이드에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. </li><li> 겹쳐서 대동맥이 평평하고 유리 슬라이드 아래로 향하게 내피 세포와 설치 매체에 얼굴 엉 마운트, 현미경 미세 수술 가위로 길이 방향으로 대동맥 고리를 잘라. 앞뒤로 대동맥를 이동하지 마십시오. </li><li> 커버 슬립과 슬라이드를 덮고 매니큐어와 슬라이드를 밀봉. </li><li> 빛 보호 아래 공기 건조 후, 무서운 이미징에 대한 슬라이드를 사용ctly 또는 시간 이내에 다음 몇 일 동안 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 이미징 <ol><li> 형광 신호를 검출하는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용한다. 시스템에서 스위치 및 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택으로 이미지 설정을 최적화 할 수 있습니다. <ol><li> 이 프로토콜의 경우, 024 × 024 픽셀의 200 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 ㎛ 인 Z-스텝 크기를 사용한다. 반면 514 nm에서 DHE에서 형광을 흥분과 605 nm의 방출에 감지, 488 nm의 아르곤 레이저로 DAF-2DA에서 형광을 자극하고 515 nm에서 검출한다. </li></ol></li><li> DAPI 신호가 자외선 선명해질 때까지 샘플에 초점을 10 배 배율을 사용하고 40X 배율로 목표를 조정합니다. </li><li> 조작부 Z 위치를 조정함으로써 내피 층의 범위를 정의한다. DAPI 염색 핵의 신호 내피 층 타원형 또는 둥근 점이다. </li><li> 상단에서 스캔내피 세포 신호 및 기록 이미지의 전체 두께를 통해 샘플의 (루멘 국경에 내피 층). 각각의 샘플을 스캔 적어도 3 개의 필드를 선택합니다. </li></ol> 이미지 6. 분석 <ol><li> 공 초점 현미경으로 스캔 데이터를 엽니 소프트웨어를 사용합니다. 분석을 위해 필드 당 세 개의 연속 이미지를 선택하고 샘플 당 적어도 3 가지 분야를 평가한다. 선택한 이미지를 내보내고 JPEG 파일로 저장합니다. </li><li> 이미지 처리 소프트웨어로 염색 DAF-2DA, DHE 및 DAPI에서 이미지를 정량화. DAPI 염색의 이미지를 들어, &#39;플러그인&#39;을 선택 → DAPI 긍정적 인 핵의 수를 계산 → &#39;셀 카운터를&#39;분석 &#39;. <ol><li> DAF-2DA 및 DHE 염색에서 이미지의 경우, 신호의 강도를 분석 → &#39;측정&#39;을 &#39;분석&#39;을 선택하고, 상대적 신호 강도로 &#39;평균&#39;값을. DAF-2DA의 비율로 존재 그 결과DAPI 긍정적 인 핵 또는 DAPI에 DHE의 비율. 각 샘플에 대해, 각 필드 화상의 평균값을 취. </li></ol></li><li> 배 변화를 얻을 대조군의 평균으로 모든 샘플의 결과를 나눈다. 통계 분석은 던넷 또는 페로 니 사후 테스트와 짝이 학생 t 테스트 또는 ANOVA를 수행 하였다. SEM ± 평균과 같은 데이터를 제공합니다. P &lt;0.05 14에서 상당한으로 평균값의 차이를 고려한다. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

NO 또는 O (2)의 검출 .- 형광 염료 자주 조직 저온부 (23)에 또한 배양 된 내피 세포에서 많은 연구에 사용 하였다. 여기에서 우리는 얼굴 NO의 검출 및 O 2 .-, 비교적 간단하고 직관적 인 효과가 각각 DAF-2DA 및 DHE,와 내피 층의 수준 도중, 즉 그대로 살아있는 혈관에이 방법을 확장했다. 동맥 미디어 탄성 섬유, 특히 저온부에서 대동맥 특정 NO 또는 O이 방해 할 수있는 매우 강한 형광도 신호를주고 이후 혈관 저온부의 방법에 비해,이 방법은 낮은 배경 프로그램 등 정량적이다. - 내피 세포에서 생성 된 신호. 또한, 내측 평활근 세포의 NADPH 산화 효소 또는 다른 효소에 의해 특이 O 2 .- 생성은 방해 할혈관 저온부와 방법의 문제점을 나타내는 부분의 혈관에서 혈관 내피 세포에서의 신호들. 반면, 실내면의 염색 방법은 그대로 혈관 세그먼트의 내피 층으로부터 특이 신호를 검출하고, 따라서, 더 정확한 분석을 제공한다. 동결 절단 (Cryosections) 준비를위한 저온 유지 장치 기계는 비싼 투자입니다. 다른 생화학 적 방법에 비해,이 방법의 주요 한계 이하 정량적이지만, 샘플 사이의 상대적인 비교를위한 좋은 선택이다. 또한, 비싼 공 초점 레이저 주사 현미경의 요구도이 방법의 한계 일 수있다. 다기관 챔버 시스템 편리 이것은 실험실에서 사용할 수없는 경우 튜브 혈관이되도록 한 쉽게 수욕 규제 시스템 탄소 가스 탱크에 연결되어있는 튜브 시스템을 구축 할 37 ° C로 유지하고 95 % O 2, 5 % CO 통기 <suB&gt; 2. 한주의를 지불해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 혈관 주위 조직이 쉽게 장착을 위해 청소되어 있는지 확인합니다. 그들은 인공 신호가 발생하여 형광 신호를 방해 할 수 있기 때문에 혈관 내강에 혈전이 떨어져 플러시해야합니다. 혈관 제제, 배양, 세척, 절단 및 장착하는 전체 공정 중에 하나는 혈관 내피 층이 손상되지 않도록 매우주의해야한다. 준비의 모든 절차를 수행하는 동안 혈관 건조하게하지 마십시오. DHE와 DAF-2DA 그래서 대동맥 항상 빛 노출로부터 보호되어야한다 염색 단계에서 시작, 모두 형광 프로브입니다. 고정하기 전에 대동맥의 혈관 내피 세포가 살아 있어야 단계, 그래서 대동맥은 항상 95 % O 2 5 % CO 2와 탄산 크렙스 - 링거 버퍼에 보관해야합니다. 샘플 이미지는 준비 후 가능한 한 빨리주의해야한다. 형광후부 신호도 결과의 정확성에 영향을 미칠 수있는 설치 매체의 보호와 며칠에 약한 될 것입니다. 이 방법은 너무 두꺼운 혈관 벽 혈관에 대한 적용되지 않을 수도 있습니다. 두 염료가 함께 혈관에 첨가하는 경우에있어서, 손상 혈관의 내피 층 동시 NO의 상상력과 O 2 .- 제조 할 수있다. 하나는 격리 된 혈관 체외에서 NO와 O 2 .- 생산에 약물의 약리 효과를 평가하기 위해이 방법을 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 세정 대동맥 보통 한 제어하고 다른 약물 치료, 그리고 DAF-2DA 및 DHE 단계 염색 전에 약물이 평형 후 배양 버퍼에 추가되어야 두 부분으로 절단된다. 이 방법은 고립 된 혈액 V의 혈관 운동 응답의 분석, 예를 들어, 다른 방법과 함께 사용하는 경우는, 특히 유용하다essels 내피 세포의 생리 기능을 확인할 수있다. 이 방법은 질병 모델 혈관 손상 및 기전에있는 내피 (DYS) 함수의 분석에도 적합해야한다. 요약하면, 우리는 동시에 형광 공 촛점 현미경으로 그대로 혈관 내피 층에 NO와 O 2 .- 생산을 검출하는 간단한 프로토콜을 제시 하였다. 우리는이 방법이 성공적으로 비만 마우스 모델에서 근무 방법을 보여줍니다. 이 방법은 많은 혈관 질환 조건하에 내피 NO의 조사와 O 2 .- 생산에 유용한 기술이다.

혈관 내피 세포는 혈관 활성 인자 1을 해제하여 혈관 기능 및 구조적 무결성을 유지합니다. 이러한 요인 중 내피 NO 신타 제 (eNOS의)를 통해 L 아르기닌으로부터 생성 내피 - 유도 질소 산화물 (NO)이 심혈관 생리학에서 가장 중요하고 가장 특징 요소이다. NO 따라서 혈관 질환 개발 3 보호에 피하 공간으로 혈소판 응집 및 염증 세포의 부착 및 침윤을 억제 평활근 이완을 유발하고 세포 증식을 억제한다. 등 노화, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 등 많은 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 특징 내피 기능 장애는 NO 생체 이용률을 감소하지 않고 O 2 .- 생산이 존재하고 동맥 경화증 2의 발병을 촉진 증가했다. 최근의 연구에서 eNOS의 언 커플 링이를이 있음을 입증다양한 상기 조건 1,4에서 eNOS의 효소는 O 2를 생성하는 내피 기능 장애, .- 대신 NO의 중요한 메커니즘. 따라서, 혈관 내피 기능의 분석, 특히 NO 생산 내피없고 O 2 .- 생성 심혈관 질병 및 합병증에 대한 실험적 연구에 중요한 것이다. 분석 및 생물학적 샘플에서 NO 생성을 측정하지하기 위해 개발 된 다양한 방법 론적 접근 방법이있다. 및 NO 3 - - 때문에 쉽게 NO 2로 산화되어 NO의 매우 불안정한 특성으로 3 초 6의 반감기, 어떠한 직접 측정하지 어렵다. / NO 3 - - NO 2 판정 따라서 유체 시료는 세포 나 조직을 5 NO 방출의 지표로서 사용 하였다. 절차가 비교적 용이하지만, 상기 방법은, 그러나, EA/ NO 3 - - 솔루션에 포함 된 sily 안정 NO 2의 높은 배경에 의해 영향을. NO가 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP) 6을 생산하는 가용성 구 아닐 레이트 사이 클라 제를 자극하기 때문에, 세포의 cGMP 수준은 NO 릴리스 7 견적 않음 결정되었다. 다시이 간접적 인 추정 및 C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP) 일부 내피 세포 유래 인자는 입자상 아닐 레이트 시클 라제의 활성화를 통해 8의 cGMP 수준을 향상 할 수 있기 때문에, 특정하지 않을 수있다. NO 부산물 (9), L - 시트룰린 생산의 측정 따라서도 NO 생성을 추정하지하는 간접적 인 방법으로 사용되는로 L - 시트룰린의 생성과 L 아르기닌에서 생산되지 않습니다. 이 방법의 주요 단점은 방사성 그것은 생체 활성 NO 수준을 측정하지 않도록하고, O 2 NO 빠르게 불 활성화 될 수있는 해제 이후 .-; 또한, L - 시트룰린은 L- 재활용 할 수있다10 아르기닌. 이러한 화학 발광 검출 (11), 전자 스핀 공명 (12), 또는 전기 포르피린 NO 센서 (13)를 같은 다른 화학적 방법은 여러 연구자에 의해 사용됩니다. 이 방법은 일반적으로 검출 절차 운영에 쉽지 않다 및 특수 장비가 필요합니다. 그것은 많은 연구 또는 내피 기능을 평가하고 간접적으로 내피 세포 유래 NO 매개 혈관 이완을 측정 할 수있는 내피없이 격리 된 혈관과 장기 목욕 실험을 적용 할 것을 언급 할 수도있다. 그것은 주로 생리 학적 상황에 가까운, 그러나 있지만 그러나이 방법은, 엄격하게 말을, 어떠한 기능을 측정하지 않습니다, 오히려의 생산 eNOS의 기능의 순 효과를 반영 일반적으로 내피 세포 매개 성 혈관 운동 반응을 평가 다른 내피 세포 유래 휴식 계수 및 내피 - 유도 수축 인자 O 2 .-의 생산 및 평활근 세포의 응답도이러한 요인이다. eNOS의 기능 또는 NO 생산의 구체적인 분석은 일반적으로 3 필요합니다. 우리 포함한 많은 연구 그룹은 NO 14-19 세포의 생산을 검출하는 형광 염색 방법을 사용 최근있다. 이 방법에서, 세포 투과 형광 표시 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA)은 시험 관내 또는 생체의 조직과 세포를 살아있는 무료 NO 및 NOS 함수를 측정 하였다. 원리는 살아있는 세포에서 DAF-2DA는 비 형광 4,5-diaminofluorescein에 세포 내 에스 테라 제에 의해 탈 아세틸되는 것을 다음 NO와 반응하여 DAF-2 트리아 졸 (DAF-2T)를 형광등으로 전환되었다 (DAF-2) . DAF-2T에서 형광을 형광 현미경 또는 형광 공 초점 현미경 (14)으로 관찰 할 수있다. 세포 내 형광 강도 따라서 세포에서 세포 내 NO의 생산 그대로 혈액 vesse에서의 내피 세포를 반영엘. 이러한 dihydroethidium (DHE)와 같은 특정 형광 염료와 조합 한 동시에 세포 또는 혈관 (14)에 세포 NO와 O 2 .- 발생을 평가할 수있다. 마찬가지로 DHE는 세포 투과성 O 2에 의해 산화되는 화합물 .- 균체 내에하고 핵산과하게 인터 형광 현미경, 형광 ​​공 촛점 현미경으로 정량적 검출 밝은 적색을 방출하는 산화 생성물도이다. 그것은 본질적으로 슈퍼 옥사이드 라디칼 감지 세포에 의해 잘 유지되고, 심지어 가벼운 고정 (20)를 허용 할 수 있으므로 DHE는 O 2 .- 생물학적 시료에서의 검출을위한 매우 구체적인 염료이다. 이 형광 염색 방법의 장점 중 하나는 검출에 직접 생체 혈관 내피 손상 층 en 얼굴 NO 및 / 또는 O 2 .- 가시화한다는 것이다. 본 논문에서는,우리는이 형광 염료 NO를 감지하는 방법 및 O 2 .- 우리가 얼굴 NO의 검출 및 O 2 욕실 개조 한 설명 .- 높은 지방 다이어트 (HFD) 공급에 의해 유도 된 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에서. 우리는이 방법이 성공적으로 안정적 NO와 O 2 .- 수준을 측정하고 비만에서 갓 고립 그대로 마우스 대동맥의 내피 층에서 eNOS의 (DYS) 기능을 평가할 수 있다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>dissolve with water to 300&amp;nbsp;&amp;micro;mol/L as 1,000x stock, stored at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector labor. (reactolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&amp;#969;&lt;/sub&gt;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&amp;nbsp;</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DM6000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors&amp;nbsp;</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical scissors&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip round diameter 15&amp;nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Tips 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tips 200 &amp;#956;l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

내피 NO-합성 효소 (eNOS의)에서 생산 내피 세포에서 파생 된 질소 산화물 (NO) 심장 혈관 생리학에서 가장 중요한 vasoprotective 분자의 하나입니다. eNOS의의 언 커플 링이 슈퍼 옥사이드 음이온에서 NO 생체 이용률 및 증가 감소 리드로 장애 eNOS의 예 (O 2 .-) 생산, 차례로 심혈관 질환을 촉진한다. 따라서, 내피 세포에서 NO와 O 2 .- 수준의 적절한 측정이 심혈관 질환과 합병증에 대한 연구를위한 중요한 있습니다. 때문에 NO와 O 2 .-의 매우 불안정한 특성 때문에 NO 측정하고, O 2 .- 직접 혈관에 어렵다. 수많은 방법은 NO 측정 및 O 2 .- 생산하기 위해 개발되었습니다. 이것은, 그러나, 어느 둔감 또는 비특이적 또는 기술적으로 요구하고, 특수 장비를 필요로한다. 여기에 우리가 적응을 설명얼굴의 동시 검출 및 세포 NO와 O 2의 시각화 도중에 .- 유도 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에 각각 세포 투과성 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하는 형광 염료 방법 높은 지방 다이어트 먹이로. 제어 린 마우스에 비해 우리는 비만 마우스의 갓 고립 그대로 대동맥 2 .- 수준을 세포 내 NO 감소 O를 향상 것을 보여줍니다 수 있습니다. 우리는이 방법은 직접 검출 및 시각화 NO와 O 2를위한 쉬운 기술 .- 그대로 혈관에 널리 (물리 치료사) 병리학 적 조건에서 내피 (DYS) 함수의 조사를 위해 적용 할 수 있다는 것을 보여줍니다.

비만은 허혈성 심장 질환의 주요 위험 인자와 관련된 어떠한 생물학적, 동맥 경화성 혈관 질환 (21)의 특징 내피되지 감소된다. -eNOS의 언 커플 링 (22), 죽상 동맥 경화증, 비만 14 노화 등 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 내피 기능 부전의 중요한 메커니즘으로 도시되었다. 따라서, 우리가 대표 NO의 결과와 O 2 .- 대동맥의 수준을 보여 마른 비만 쥐를 비교합니다. 10.6 %, 지방 27.6 %의 단백질, 57 %의 탄수화물, 섬유 4.8 % 에너지 함량 7 주 세의 나이에 시작, 수컷 생쥐 (C57BL / 6J)는 중 정상 우 (NC 14 주 동안 무료로 액세스 권한을 부여했다 ) 또는 고지방식이 (HFD 에너지 함량 : 55 %, 지방 21 % 단백질 및 24 % 탄수화물). HFD 마우스 14 주했다 후희생과 흉부 대동맥 해부 및 준수 조직의 청소했다. DAF-2DA 및 DHE 단계를 염색하기 전에, eNOS의는 LN G -Nitroarginine 메틸 에스테르 (L-NAME) (1 ㎜)이 eNOS의 활동 (14)을 차단하는 1 시간 동안 목욕 챔버에 추가 억제제. 대표 공 초점 형광 결과를 그림 1에 나타내었다. 상단 패널에 푸른 색은 DAPI으로 얼룩진 내피 세포의 핵을 나타냅니다. 중간 패널에서 녹색이 아닌 형광 DAF-2 NO함으로써, 녹색 신호의 강도가 크면 수단으로부터 변환 DAF-2T의 형광 신호이고, 세포에 더 이상 존재한다. 마찬가지로, 상기 하부 패널의 붉은 색 O 2 .- 의해 산화 DHE에서 형광 신호이므로, 더 붉은 색을 나타내는 샘플은 더 O 2 .- 셀을 갖는다. 공 초점 형광 현미경은 감소 밝혀D 쥐의 대동맥 내피 층에서 NO 생성 (DAF-2DA 염색) 증가 L-NAME에 민감한 O 2 .- 세대 (DHE 염색), 쥐의 그 NC (그림 1) 14 공급에 비해 HFD을 공급하지 이노스 - 언 커플 링 제안 비만. 신호는 정량 및 막대 그래프 (14)에 발표되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53718/53718fig1.jpg" /> 그림 비만 1. eNOS의-언 커플 링. 얼굴 NO의 검출 및 O 2 엔 공 초점 현미경 .- 각각 DAF-2DA 및 DHE 염색에 의해. N = 5; *** p &lt;NC 대 0.005, ††† p &lt;HFD 그룹 대 0.005. 스케일 바 = 0.1 mm. (데이터 참조 14이었다) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53718/53718fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </P&gt;

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En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

9.5K 조회수.  University of Fribourg.  이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다. 

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Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

연구

의학

Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The endothelium acts as a barrier, preventing leukocyte adhesion and aggregation, as well as controlling permeability to plasma components. Functionally, the endothelium affects vessel tone.
Endothelial dysfunction is an imbalance between the chemical species which regulate vessel tone, thombroresistance, cellular proliferation and mitosis. It is the first step in atherosclerosis and is associated with coronary artery disease, peripheral artery disease, heart failure, hypertension, and hyperlipidemia.
The first demonstration of endothelial dysfunction involved direct infusion of acetylcholine and quantitative coronary angiography. Acetylcholine binds to muscarinic receptors on the endothelial cell surface, leading to an increase of intracellular calcium and increased nitric oxide (NO) production. In subjects with an intact endothelium, vasodilation was observed while subjects with endothelial damage experienced paradoxical vasoconstriction.
There exists a non-invasive, in vivo method for measuring endothelial function in peripheral arteries using high-resolution B-mode ultrasound. The endothelial function of peripheral arteries is closely related to coronary artery function. This technique measures the percent diameter change in the brachial artery during a period of reactive hyperemia following limb ischemia.
This technique, known as endothelium-dependent, flow-mediated vasodilation (FMD) has value in clinical research settings. However, a number of physiological and technical issues can affect the accuracy of the results and appropriate guidelines for the technique have been published. Despite the guidelines, FMD remains heavily operator dependent and presents a steep learning curve. This article presents a standardized method for measuring FMD in the brachial artery on the upper arm and offers suggestions to reduce intra-operator variability.

Endothelial dysfunction is associated with numerous disease states and is predictive of adverse cardiovascular events in humans. Flow-mediated vasodilation (FMD) is a non-invasive ultrasound method of evaluating endothelial function. Methodological choices and operator experience may affect results. A systematic approach to FMD in human studies is discussed here.

임상 연구에서 상완 동맥의 초음파 평가 내피 의존 흐름 매개 혈관 확장

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

생물학

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Detection of Superoxide Anion in Platelets Using Fluorescence Imaging and EPR을 사용한 과산화물 음이온 검출

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ability to react with important biological molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Superoxide anions are important ROS generated by the reduction of molecular oxygen reduction (i.e., acquisition of one electron). Despite their initial implication exclusively in aging, degenerative, and pathogenic processes, their participation in important physiological responses has recently become apparent. In the vascular system, superoxide anions have been shown to modulate the differentiation and function of vascular smooth muscle cells, the proliferation and migration of vascular endothelial cells in angiogenesis, the immune response, and the activation of platelets in hemostasis. The role of superoxide anions is particularly important in the dysregulation of platelets and the cardiovascular complications associated with a plethora of conditions, including cancer, infection, inflammation, diabetes, and obesity. It has, therefore, become extremely relevant in cardiovascular research to be able to effectively measure the generation of superoxide anions by&#160;human platelets,&#160;understand the redox-dependent mechanisms regulating the balance between hemostasis and thrombosis and, eventually,&#160;identify novel pharmacological tools for the modulation of platelet responses leading to thrombosis and cardiovascular complications. This study presents three experimental protocols successfully adopted for the detection of superoxide anions in platelets and the study of the redox-dependent mechanisms regulating hemostasis and thrombosis: 1) dihydroethidium (DHE)-based superoxide anion detection by flow cytometry; 2) DHE-based superoxide anion visualization and analysis by single platelet imaging; and 3) spin probe-based quantification of superoxide anion output in platelets by electron paramagnetic resonance (EPR).

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: ROS 검출을 위한 혁신적인 기법 및 혈소판 연구에 대한 시사점

The generation of superoxide anion is essential for the stimulation of platelets and, if dysregulated, critical for thrombotic diseases. Here, we present three protocols for the selective detection of superoxide anions and the study of redox-dependent platelet regulation.

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ...

면역학 및 감염병학

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

요약

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질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

임상 연구에서 상완 동맥의 초음파 평가 내피 의존 흐름 매개 혈관 확장

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

개발 및 특성화의