This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

Tier Arbeit wurde von der Ethikkommission der Veterinäramt Fribourg, Schweiz genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien für die Tierpflege und Experimentieren an unserer Hochschule. 1. Herstellung eines Set-up für die Inkubation von isolierten Arterien <ol><li> Konstrukt ein Organbad System , das auf 37 ° C erhitzt werden kann und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 aus einem Kohlenstoffgastank. </li><li> Bereiten so viel Krebs-Ringer - Bicarbonat - Puffer , wie mit der Konzentration der folgenden Zusammensetzung benötigt: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA und 11,1 mM D-glucose). </li><li> Halten Sie die Lager - Puffer auf Eis und belüften den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schalten Sie das Organbad System, stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C, 5 ml der ready-to-use-Puffer zu jeder Kammerund halten Sie den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2 Belüften. </li><li> Waschen Sie die Kammern einmal mit Krebs-Ringer-Puffer für 30 min. </li><li> 5 ml Krebs-Ringer-Puffer in jeder Kammer und die Abdeckung die Kammer Verdampfung zu vermeiden. </li></ol> 2. Isolierung von Maus-Aorten <ol><li> Injizieren Pentobarbital, die in 0,9% NaCl intraperitoneal in einer Konzentration von 150 mg / kg, gelöst wird, um die Mäuse zu opfern. </li><li> Legen Sie die Maus supinely auf einem OP-Brett. </li><li> Besprühen das Fell des Brustbereich mit 70% Ethanol für die Zwecke der Hygienisierung und Feuchtigkeit. </li><li> Offenen Brusthöhle um die Rippe durch Schneiden des Herzens und der Lunge, zu belichten und die Lungen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Blut in den Brustraum leicht mit einem Papiertuch. </li><li> Fassen Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange und entfernen Sie die thorakalen Aorta durch die perivaskulären Fettgewebe zwischen der Aorta und der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Schere schneiden. </li><li> Tauchen Sie sofort die whole Gewebe in eiskaltem (4 ° C) Krebs-Ringer-Puffer. </li><li> Entfernen Sie das Herz und Aortenbogen unter einem Präpariermikroskop und halten den thorakalen Aorta-Segment im Puffer. </li><li> Präparieren Sie die Aorta frei von anhaftenden perivaskulären Gewebe unter dem Mikroskop mit einer chirurgischen Schere und Pinzette. </li><li> Fassen Sie die Stirnkante der Aorta mit einer Zange, und spülen das Blut in das Gefäßlumen entfernt durch sanftes Spülen Krebs-Ringer-Puffer mit einem 26 G × 1 / 2&quot; Spritze. </li><li> Schneiden Sie die gereinigten Aorten-Ringe in 3 mm lange Segmente. Hinweis: Achten Sie bei diesem Schritt nicht Endothelschicht zu beschädigen. </li></ol> 3. DHE und DAF-2DA Anfärben <ol><li> Übertragen die gereinigten Aorten - Segmente mit einer Pinzette in das Organbad Kammern gefüllt mit Krebs-Ringer - Puffer bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2. Hinweis: Berühren Sie nur die adventitiellen Seite der Aorten-Ringe mit einer Pinzette und sie klemmen nicht blood Gefäße. </li><li> Äquilibrieren die Arterien im Organbad Kammer für 30 min. </li><li> Hinzufügen Acetylcholin (ACh) in das Organbad auf die Endkonzentration 1 uM, und inkubiere die Arterien für 10 min. </li><li> Bereiten Sie 1 ml DHE / DAF-2DA-Lösung (5 &amp; mgr; M jedes Farbstoffs, von 1000 × Lager verdünnt) mit vorgewärmten Krebs-Ringer-Puffer in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie gegen Licht zu vermeiden. </li><li> Nach der Stimulation übertragen die Aortenringen von Organbad zur DHE / DAF-2DA Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 und der Aortenringen für 30 min inkubieren. Hinweis: Von diesem Schritt halten die Aorten immer in Dunkelheit. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Krebs-Ringer-Puffer zum Waschen und wiederholen Sie die Wäsche dreimal innerhalb von 1 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf 4% Paraformaldehydlösung zur Fixierung für 30Minute </li><li> Vorbereitung 1 ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Lösung (300 nM, von 1000 × Vorrat verdünnt) mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) -Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Gegenfärbung der Aorten 3 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS-Puffer zum Waschen für 1 min. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Aorten-Ringe zu klemmen oder die endotheliale Schicht beschädigt werden. </li></ol> 4. En Face Montage <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Medium auf den Schlitten der Montage. </li><li> Schneiden Sie die Aorten - Ringe in Längsrichtung mit mikro Schere unter dem Mikroskop, machen die zusammengerollten Aorten flach und montieren es en face auf dem Eindeckmedium mit dem Endothel auf dem Glasträger nach unten zeigt . Sie nicht die Aorten hin und her bewegen. </li><li> Decken Sie die Folie mit Deckglas und versiegeln Sie die Folie mit Nagellack. </li><li> Nach dem Trocknen an der Luft unter Lichtschutz, verwenden Sie die Folien für dire Abbildenctly innerhalb von Stunden oder lagern Sie sie bei -20 ° C für den nächsten paar Tage. </li></ol> 5. Konfokalmikroskopische Imaging <ol><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop die Fluoreszenzsignale zu erkennen. Schalten Sie die Maschine und optimieren die Abbildungseinstellungen wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stack. <ol><li> Für dieses Protokoll verwenden, um eine 200 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 1.024 × 1.024 Pixeln und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Excite Fluoreszenz von DAF-2DA mit 488 nm Argonlaser und erfassen bei 515 nm, während erregen Fluoreszenz von DHE bei 514 nm und erfassen bei 605 nm Emission. </li></ol></li><li> Verwenden 10x Vergrößerungen auf die Probe zu konzentrieren, bis das DAPI-Signal mit ultravioletten Strahlen klar ist, und stellen Sie dann das Ziel zu 40X Vergrößerung. </li><li> Definieren Sie den Bereich der endothelialen Schicht durch Einstellen der Z-Position auf dem Bedienfeld. Die Signale von DAPI-gefärbten Kerne sind oval oder rund Punkten in der Endothelschicht. </li><li> Scannen von oben(Endothelschicht auf der Lumen Grenze) der Probe durch die gesamte Dicke der endothelialen Signal und Aufzeichnen von Bildern. Wählen mindestens 3 verschiedene Felder für jede Probe abtastet. </li></ol> 6. Analyse der Bilder <ol><li> Verwenden Sie Software, um die Daten zu öffnen, durch konfokale Mikroskop gescannt. Wählen Sie drei aufeinander folgende Bilder pro Feld für die Analyse und Bewertung von mindestens 3 verschiedenen Feldern pro Probe. Exportieren Sie die ausgewählten Bilder und speichern Sie sie als JPEG-Dateien. </li><li> Quantifizieren Sie die Bilder von DAF-2DA, DHE und DAPI Färbung mit Bildverarbeitungs-Software. Für das Bild von DAPI-Färbung, wählen Sie &quot;Plugins&quot; → &quot;Analysieren&quot; → &quot;Zellzähler&quot; die Anzahl der DAPI positiven Kern zu zählen. <ol><li> Für die Bilder von DAF-2DA und DHE-Färbung, wählen Sie &quot;Analysieren&quot; → &quot;Maßnahme&quot; die Intensität der Signale zu analysieren, und nehmen Sie die &quot;mittlere&quot; Wert als die relative Signalintensität. Vorhanden dann die Ergebnisse als Verhältnis von DAF-2DA zuDAPI positiven Kerne oder das Verhältnis von DHE zu DAPI. Für jede Probe nehmen Sie den Mittelwert von jedem Bild und Feld. </li></ol></li><li> Teilen Sie das Ergebnis jeder Probe durch den Mittelwert der Kontrollgruppe die Falte Änderung zu erhalten. Die statistische Analyse wurde mit ungepaarten Student t-Test oder ANOVA mit Dunnett oder Bonferroni post-Test durchgeführt. Geben Daten als Mittelwert ± SEM. Betrachten wir Unterschiede in der Mittelwerte als signifikant bei p &lt;0,05 14. </li></ol>

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	<li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginase:+the+emerging+therapeutic+target+for+vascular+oxidative+stress+and+inflammation.">Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation.</a> Front Immunol. 4, 149 (2013).</li><li>Forstermann, U., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthases:+regulation+and+function.">Nitric oxide synthases: regulation and function.</a> Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).</li><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+understanding+endothelial+dysfunction+in+atherosclerosis.">Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis.</a> Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).</li><li>Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+endothelial+dysfunction+by+modulating+NOS+uncoupling:+new+insights+into+its+pathogenesis+and+therapeutic+possibilities.">Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).</li><li>Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nitrate,+nitrite,+and+[15N]nitrate+in+biological+fluids.">Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids.</a> Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).</li><li>Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+nitric+oxide+from+L-arginine+in+the+central+nervous+system:+a+transduction+mechanism+for+stimulation+of+the+soluble+guanylate+cyclase.">Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).</li><li>Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+bioassay+method+for+detection+of+EDRF+with+RFL-6+rat+lung+fibroblasts.">A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).</li><li>Guo, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+C-type+natriuretic+peptide+on+spontaneous+contraction+in+gastric+antral+circular+smooth+muscle+of+rat.">Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat.</a> Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).</li><li>Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cells+synthesize+nitric+oxide+from+L-arginine.">Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine.</a> Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).</li><li>Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+L-arginine+and+its+significance+for+the+biosynthesis+of+endothelium-derived+relaxing+factor:+cultured+endothelial+cells+recycle+L-citrulline+to+L-arginine.">The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).</li><li>Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nitric+oxide+production+from+a+perfused+organ+by+a+luminol-H2O2+system.">Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system.</a> Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).</li><li>Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+nitric+oxide+generation+in+the+ischemic+heart+using+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).</li><li>Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+measurement+using+electrochemical+methods.">Nitric oxide measurement using electrochemical methods.</a> Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).</li><li>Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+mitogen-activated+protein+kinase+is+involved+in+arginase-II-mediated+eNOS-Uncoupling+in+Obesity.">p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity.</a> Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).</li><li>Nakatsubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+of+nitric+oxide+production+from+bovine+aortic+endothelial+cells+using+new+fluorescence+indicators:+diaminofluoresceins.">Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins.</a> FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).</li><li>Hink, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+endothelial+dysfunction+in+diabetes+mellitus.">Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus.</a> Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).</li><li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glutaredoxin+in+human+coronary+arteries:+its+potential+role+in+antioxidant+protection+against+atherosclerosis.">Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).</li><li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+red+blood+cells+at+work:+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease.">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li><li>Nunez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+nitroglycerin+and+NO-releasing+drugs+on+mitochondrial+oxygen+consumption,+vasoactivity,+and+the+release+of+NO.">Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO.</a> Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+increased+vascular+superoxide+production+in+human+diabetes+mellitus:+role+of+NAD(P)H+oxidase+and+endothelial+nitric+oxide+synthase.">Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase.</a> Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).</li><li>Yang, Z., Ming, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signalling:+the+molecular+interface+connecting+metabolic+stress,+aging+and+cardiovascular+diseases.">mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases.</a> Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).</li><li>Yepuri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+crosstalk+between+arginase-II+and+S6K1+in+vascular+endothelial+inflammation+and+aging.">Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging.</a> Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox1+is+involved+in+angiotensin+II-mediated+hypertension:+a+study+in+Nox1-deficient+mice.">Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice.</a> Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).</li></ol>

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Der Nachweis von NO oder O 2 .- mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde in vielen Studien in kultivierten Endothelzellen und auch in Gewebe Kryoabschnitte 23 häufig verwendet. Hier erweiterten wir diese Methode , um intakte lebende Blutgefäße, dh en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- Ebenen in der Endothelschicht mit DAF-2DA und DHE verbunden, die wirksam ist, relativ einfach und intuitiv. Im Vergleich mit dem Verfahren in vaskulären Kryoschnitte zeigt diese Methode niedrigeren Hintergrund und ist quantitativ, da elastischen Fasern in den Medien einer Arterie insbesondere der Aorta in den Kryoschnitten sehr starke Autofluoreszenzsignale ergeben , die mit dem spezifischen NO oder O 2 stören könnten. - Signale in Endothelzellen erzeugt. Darüber hinaus spezifische O 2 .- Generation von NADPH - Oxidase oder andere Enzyme in den medialen glatten Muskelzellen könnte auch störenmit den Signalen in Endothelzellen im Gefäßabschnitt, der den Nachteil des Verfahrens mit vaskulären Kryoschnitte darstellt. Im Gegensatz dazu erkennt die en face Färbemethode Signale gezielt von der endothelialen Schicht eines Blutgefäßsegment intakt und daher gibt genauere Analyse. Kryostat Maschine für Kryoschnittes Vorbereitung ist auch eine teure Investition. Im Vergleich zu anderen biochemischen Verfahren ist die Hauptbeschränkung dieses Verfahrens weniger quantitativ, aber es ist eine gute Wahl für einen relativen Vergleich zwischen den Proben. Darüber hinaus, die die Anforderung eines konfokalen Mikroskops teuer ist, kann auch eine Beschränkung dieses Verfahrens sein. Die Multi-Organ-Kammer-System ist praktisch und, wenn dies nicht im Labor ist, kann man leicht ein System mit Wasserbad und Rohre herzustellen, die an ein Kohlenstoffgastank mit Regulierungssystem verbunden sind, so dass die Blutgefäße in den Rohren sind bei 37 ° C und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO gehalten <sub&gt; 2. Es gibt einige wichtige Schritte, die man Aufmerksamkeit zu zahlen hat. Achten Sie darauf, dass das perivaskuläre Gewebe für eine einfache Montage gereinigt. Die Blutgerinnsel in das Gefäßlumen muss weggespült werden, da sie künstliche Signale verursachen kann und mit den Fluoreszenzsignale stören. Während der gesamten Prozedur der Blutgefäß Vorbereitung, Inkubation, Waschen, Schneiden und Montage muss man sehr vorsichtig sein, nicht die endotheliale Schicht der Blutgefäße zu beschädigen. Nicht das Blutgefäß trocken während des gesamten Verfahrens der Vorbereitung lassen. DHE und DAF-2DA sind beide Fluoreszenzsonden, so aus dem Färbeschritt beginnen die Aorten sollte immer von Lichtbestrahlung geschützt werden. Vor der Fixierung die Endothelzellen von Aorten Schritt am Leben sein müssen, so sollten die Aorten immer in der mit 95% O 2 und 5% CO 2 begast Krebs-Ringer - Puffer gehalten werden. Bilder der Proben sollten so bald wie möglich nach ihrer Herstellung zu entnehmen. Die fluoreszierennce Signal wird schwächer werden in wenigen Tagen auch mit dem Schutz der Befestigungsmittel, das die Genauigkeit der Ergebnisse auswirken können. Das Verfahren kann nicht für Blutgefäße mit zu dick Gefäßwand an. Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Phantasie von NO und O 2 .- Produktion in der endothelialen Schicht der intakten Blutgefäßen, wenn die zwei Farbstoffe an den Blutgefäßen zusammen addiert wurden. Man kann auch diese Methode verwenden , um die pharmakologischen Wirkungen von Drogen auf NO und O 2 .- Produktion in vitro in isolierten Blutgefäßen zu bewerten. Zu diesem Zweck wird das gereinigte Aorta in der Regel in zwei Teile geschnitten, einer ist für die Steuerung und die andere ist für die medikamentöse Behandlung und das Arzneimittel sollte dem Inkubationspuffer nach Äquilibrierung hinzugefügt werden, bevor DAF-2DA und DHE Schritt Anfärbung. Es ist besonders nützlich, wenn dieses Verfahren mit einem anderen Verfahren verwendet wird , zusammen, beispielsweise mit der Analyse von vasomotorischen Reaktionen von isolierten Blut vessels, eine physiologische Funktion von Endothelzellen bestätigt werden kann. Dieses Verfahren ist für die Analyse von jedem endothelial (dys) Funktion in intakten Blutgefäßen von Krankheitsmodellen und die zugrunde liegenden Mechanismen auch geeignet sein. Zusammenfassend stellten wir ein einfaches Protokoll , um gleichzeitig NO erkennen und O 2 .- Produktion in Endothelschicht intakten Blutgefäßen mit einem Fluoreszenz - konfokalen Mikroskop. Wir zeigen, wie diese Methode erfolgreich bei Adipositas Mausmodell gearbeitet. Dieses Verfahren ist eine nützliche Technik bei der Untersuchung der endothelialen NO und O 2 .- Produktion unter vielen vaskulären Krankheitszuständen.

Die vaskulären Endothelzellen halten Gefäß funktionelle und strukturelle Integrität von vasoaktiven Faktoren 1 freigibt . Unter diesen Faktoren Endothelium derived Stickstoffmonoxid (NO) , hergestellt aus L-Arginin durch endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist das wichtigste und am besten charakterisierte Faktor in kardiovaskulären Physiologie 2. NO verursacht Entspannung der glatten Muskulatur und hemmt die Zellproliferation hemmt die Thrombozytenaggregation und entzündliche Zelladhäsion und Infiltration in den subendothelialen Raum, also Gefäßerkrankung Entwicklung 3 zum Schutz vor. Unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich der alternden Gesellschaft, Hypertonie, Diabetes, Hyperlipidämie, usw., verringert dadurch die endotheliale Dysfunktion durch NO Bioverfügbarkeit und erhöhte O 2 .- Produktion vorhanden ist , und fördert die Pathogenese der Atherosklerose 2. Studien aus den letzten Jahren zeigen, dass Entkopplung von eNOS ist einwichtiger Mechanismus für die endotheliale Dysfunktion, in dem das eNOS - Enzym erzeugt O 2 .- anstelle von NO, unter den verschiedenen zuvor erwähnten Bedingungen 1,4. Daher Analyse der Endothelfunktion, insbesondere endotheliale NO - Produktion und 2 O .- Generation ist von zentraler Bedeutung für die experimentelle Forschung auf Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Es gibt zahlreiche methodische Ansätze, die NO-Produktion zu analysieren und zu messen in biologischen Proben entwickelt wurden. Aufgrund der extrem labile Art von NO zu NO , das leicht oxidiert wird 2 - und NO 3 - mit einer Halbwertszeit von 3 bis 6 sec, ist es schwierig , NO direkt zu messen. Daher Bestimmung der NO 2 - / NO 3 - in den Flüssigkeitsproben wurde als ein Index von NO aus Zellen oder Geweben freigesetzt 5 verwendet. Obwohl das Verfahren relativ einfach ist, ist das Verfahren jedoch easily durch hohe Hintergrund des stabilen NO betroffen 2 - / NO 3 - in der Lösung enthalten ist . Da NO löslichen Guanylatcyclase stimuliert zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) 6, die zellulären cGMP - Spiegels zu erzeugen , hat sich auch die NO - Freisetzung zu schätzen 7 bestimmt ist. Auch dies ist eine indirekte Schätzung und nicht spezifisch sein kann, da auch die Aktivierung cGMP - Spiegel durch von cyclase partikulären Guanylat verbessern könnten einige Endothel-abgeleitete Faktoren, wie C-Typ natriuretischen Peptid (CNP) 8. NO wird aus L-Arginin mit der Erzeugung von L-Citrullin als einem Nebenprodukt 9 Messung von L-Citrullin Produktion produziert daher auch als indirekte Verfahren verwendet wird , die NO - Produktion zu schätzen. Die Hauptnachteile dieses Verfahrens sind , dass es radioaktiv ist und es nicht bioaktiven NO Ebenen messen, da NO rasch freigesetzt durch O 2 .- inaktiviert werden könnten; Darüber hinaus kann L-Citrullin recycelt werden, um L-Arginin 10. Andere chemische Methoden wie Chemolumineszenznachweise 11, Elektronenspinresonanz - 12, oder elektro Porphyrin - NO - Sensor 13 werden von mehreren Forschern verwendet. Diese Methoden sind in der Regel nicht einfach in Betrieb, Erkennung Verfahren und erfordern spezielle Ausrüstung. Es ist auch zu erwähnen, dass viele Studien Organbad Experimente mit isolierten Blutgefäße mit oder ohne Endothelium anwenden Endothelfunktion zu bewerten und indirekt Endothelium derived NO vermittelten vaskulären Relaxationen messen. Dieses Verfahren ist jedoch, obwohl sie meist in der Nähe der physiologischen Situation ist, aber streng zu sagen, nicht messen keine Funktion, er bewertet, eher Endothel-vermittelte vasomotorischen Reaktionen im Allgemeinen, die Nettoeffekte der eNOS Funktion widerspiegeln, die Produktion von anderen Endothel-derived relaxing Faktoren und Endothel-abgeleiteten Auftraggeber Faktoren, die Produktion von O 2 .-, und auch die Reaktionen von glatten Muskelzellenzu diesen Faktoren. Eine spezifische Analyse der eNOS - Funktion oder die NO - Produktion ist in der Regel 3 erforderlich. Viele Forschungsgruppen einschließlich der unsrigen haben in den letzten Jahren die Fluoreszenzfarbstoff - Methode verwendet , um die intrazelluläre Produktion von NO 14-19 erkennen. Bei diesem Verfahren wurde die zellpermeabel Fluoreszenzindikator Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) verwendet , um freie NO und NOS - Funktion in lebenden Zellen und Geweben in vitro oder ex vivo zu messen. Das Prinzip ist, dass in den lebenden Zellen, DAF-2DA wird durch intrazelluläre Esterase zu nicht fluoreszierenden 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) deacetyliert die dann umgewandelt DAF-2 Triazol fluoreszierend (DAF-2T), indem Sie mit NO reagieren . Die Fluoreszenz von DAF-2T können unter einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz konfokalen Mikroskop 14 beobachtet werden. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität spiegelt daher die intrazelluläre NO-Produktion in den Zellen oder das Endothel eines in intakten Blut vessel. In Kombination mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wie Dihydroethidium (DHE), kann man gleichzeitig intrazellulären NO und O 2 .- Erzeugung in den Zellen oder in Blutgefäßen 14 beurteilen. In ähnlicher Weise ist auch eine DHE zellpermeablen Verbindung , die durch 2 O oxidiert wird .- innerhalb der Zellen, und das Oxidationsprodukt dann interkaliert mit Nukleinsäuren durch Fluoreszenz - Mikroskop oder Fluoreszenz konfokalen Mikroskop eine leuchtend rote Farbe nachweisbar quantitativ zu emittieren. DHE ist ein sehr spezifischer Farbstoff zum Nachweis von O 2 .- aus biologischen Proben, wie sie im wesentlichen Superoxidradikalen erkennt, zurückgehalten wird und durch die Zellen, und sogar leichte Fixierung 20 tolerieren kann. Einer der Vorteile dieses Fluoreszenzfarbstoffes Verfahrens ist , dass es erkennt und visualisiert NO und / oder O 2 .- en face direkt auf der intakten Endothelschicht eines lebenden Blutgefßes. In diesem Papier,Wir beschreiben diese Methode Fluoreszenzfarbstoff NO und O 2 zu erkennen .- , die wir für en Gesichtserkennung von NO und O 2 angepasst .- in intakten Aorten von einer Adipositas - Maus - Modell von hohem Fettgehalt-Diät (HFD) Fütterung induziert. Wir zeigen , dass diese Methode erfolgreich konnte und zuverlässig messen NO und O 2 .- Ebenen und eNOS (dys) -Funktion in der Endothelschicht frisch isolierten intakten Maus Aorten in Fettleibigkeit zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>dissolve with DMSO to 5&amp;nbsp;mmol/L as 1,000x stock, stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>dissolve with water to 300&amp;nbsp;&amp;micro;mol/L as 1,000x stock, stored at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Vector labor. (reactolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;&amp;#969;&lt;/sub&gt;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&amp;nbsp;</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>Model 610M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>DM6000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors&amp;nbsp;</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical scissors&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>S&amp;amp;T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip round diameter 15&amp;nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Tips 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tips 200 &amp;#956;l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

Endothelium-derived Stickstoffmonoxid (NO) aus endothelialen NO-Synthase (eNOS) ist einer der wichtigsten vasoprotektiven Moleküle in kardiovaskulären Physiologie. Dysfunktionalen eNOS wie Entkopplung von eNOS führt in NO Bioverfügbarkeit und Erhöhung Superoxidanion (O 2 .-) Produktion und fördert wiederum kardiovaskulären Erkrankungen zu verringern. Daher sind entsprechende Messung von NO und O 2 .- Ebenen in den Endothelzellen entscheidende für die Erforschung von Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Aufgrund der extrem labile Natur von NO und O 2 .-, ist es schwierig zu messen , NO und O 2 .- direkt in ein Blutgefäß. Es wurden zahlreiche Verfahren NO zu messen entwickelt und O 2 .- Produktion. Es ist jedoch entweder insensitive oder unspezifisch, oder technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung. Hier beschreiben wir eine Anpassungdes Fluoreszenzfarbstoffs Verfahren für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären NO und O 2 .- Die zellpermeabel Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) mit jeweils in intakten Aorten von einer Adipositas - Mausmodell induziert von hohem Fettgehalt-Diät Fütterung. Wir zeigen , könnten intrazellulären NO verringert und eine verbesserte O 2 .- Ebenen in den frisch isolierten intakten Aorten von Maus Fettleibigkeit zur Kontroll lean Maus verglichen. Wir zeigen , dass diese Methode ist eine einfache Technik für die direkte Erfassung und Visualisierung von NO und O 2 .- in den intakten Blutgefäßen und kann in weiten Bereichen für die Untersuchung der endothelialen (dys) Funktion unter (Physio) pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Adipositas ist ein wichtiger Risikofaktor für ischämische koronare Herzkrankheit und ist assoziiert mit einer verminderten NO - Bioverfügbarkeit Endothelzellen, ein Markenzeichen von atherosklerotischen Gefäßerkrankung 21. eNOS-Entkopplung wurde gezeigt , einen wichtigen Mechanismus der endothelialen Dysfunktion bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen zu sein , einschließlich der Alterungs 22, Atherosklerose und Adipositas 14. Daher hier vergleichen wir die schlanken und fettleibigen Mäusen die repräsentatives Ergebnis von NO zu zeigen und O 2 .- Ebenen in den Aorten. 10,6% Fett, 27,6% Protein und 57% Kohlenhydrate, Ballaststoffe 4,8%: Energiegehalt, ab dem Alter von 7 Wochen die männliche Mäuse (C57BL / 6J) hatten freien Zugang während 14 Wochen entweder mit einem normalen Futter (NC gegeben ) oder eine fettreiche Ernährung (HFD, Energiegehalt: 55% Fett, 21% Protein und 24% Kohlenhydrate). Nach 14 Wochen der HFD-Mäuse warengetötet und thorakalen Aorten seziert und von anhaftendem Gewebe gereinigt. Vor DAF-2DA und DHE Schritt Anfärben Inhibitor die eNOS LN G -Nitroarginine methylester (L-NAME) (1 mM) wurde 1 h zum Badkammer hinzugefügt eNOS - Aktivität 14 zu blockieren. Die repräsentativen konfokalen Fluoreszenz Ergebnisse wurden in Abbildung 1 dargestellt. Die blaue Farbe in der oberen Platte stellt den Kern von Endothelzellen gefärbt durch DAPI. Im mittleren Bereich werden die grüne Farbe der Fluoreszenz-Signal von DAF-2T von der nicht-fluoreszierenden DAF-2 durch NO, die, wenn die Intensität der grünen Signaleinrichtung umgewandelt wird, höher ist, gibt es mehr NO in den Zellen. In ähnlicher Weise ist die rote Farbe in der unteren Platte das Fluoreszenzsignal von DHE oxidiert durch O 2 .-, so dass die Probe mehr rote Farbe hat mehr O zeigt 2 .- in den Zellen. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigte, Abnahmed NO - Produktion (DAF-2DA Färbung) und eine erhöhte L-NAME empfindlichen O 2 .- Generation (DHE - Färbung) in der Aorta Endothelschicht der Mäuse gefüttert HFD im Vergleich zu derjenigen der Mäuse gefüttert NC (Abbildung 1) 14, was darauf hindeutet, eNOS-Entkopplung der Fettleibigkeit. Die Signale wurden in den Balkendiagrammen 14 quantifiziert und dargestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53718/53718fig1.jpg" /> Abbildung 1. eNOS-Entkopplung der Fettleibigkeit. Konfokalmikroskopische en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- von DAF-2DA und DHE - Färbung auf. n = 5; *** p &lt;0,005 vs NC; ††† p &lt;0,005 vs HFD - Gruppe. Maßstabsbalken = 0,1 mm. ( Die Daten wurden von Referenz 14) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53718/53718fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53718/53718fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt;

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En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

9.5K Aufrufe.  University of Fribourg.  In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert. 

Serie: En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Forschung

Medizin

Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The endothelium acts as a barrier, preventing leukocyte adhesion and aggregation, as well as controlling permeability to plasma components. Functionally, the endothelium affects vessel tone.
Endothelial dysfunction is an imbalance between the chemical species which regulate vessel tone, thombroresistance, cellular proliferation and mitosis. It is the first step in atherosclerosis and is associated with coronary artery disease, peripheral artery disease, heart failure, hypertension, and hyperlipidemia.
The first demonstration of endothelial dysfunction involved direct infusion of acetylcholine and quantitative coronary angiography. Acetylcholine binds to muscarinic receptors on the endothelial cell surface, leading to an increase of intracellular calcium and increased nitric oxide (NO) production. In subjects with an intact endothelium, vasodilation was observed while subjects with endothelial damage experienced paradoxical vasoconstriction.
There exists a non-invasive, in vivo method for measuring endothelial function in peripheral arteries using high-resolution B-mode ultrasound. The endothelial function of peripheral arteries is closely related to coronary artery function. This technique measures the percent diameter change in the brachial artery during a period of reactive hyperemia following limb ischemia.
This technique, known as endothelium-dependent, flow-mediated vasodilation (FMD) has value in clinical research settings. However, a number of physiological and technical issues can affect the accuracy of the results and appropriate guidelines for the technique have been published. Despite the guidelines, FMD remains heavily operator dependent and presents a steep learning curve. This article presents a standardized method for measuring FMD in the brachial artery on the upper arm and offers suggestions to reduce intra-operator variability.

Endothelial dysfunction is associated with numerous disease states and is predictive of adverse cardiovascular events in humans. Flow-mediated vasodilation (FMD) is a non-invasive ultrasound method of evaluating endothelial function. Methodological choices and operator experience may affect results. A systematic approach to FMD in human studies is discussed here.

Ultraschall Beurteilung der Endothelial Abhängige Fluss Vasodilatation der Arteria brachialis in der klinischen Forschung

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Biologie

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nachweis von Superoxid-Anionen in Blutplättchen mittels Fluoreszenzbildgebung und EPR

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ability to react with important biological molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Superoxide anions are important ROS generated by the reduction of molecular oxygen reduction (i.e., acquisition of one electron). Despite their initial implication exclusively in aging, degenerative, and pathogenic processes, their participation in important physiological responses has recently become apparent. In the vascular system, superoxide anions have been shown to modulate the differentiation and function of vascular smooth muscle cells, the proliferation and migration of vascular endothelial cells in angiogenesis, the immune response, and the activation of platelets in hemostasis. The role of superoxide anions is particularly important in the dysregulation of platelets and the cardiovascular complications associated with a plethora of conditions, including cancer, infection, inflammation, diabetes, and obesity. It has, therefore, become extremely relevant in cardiovascular research to be able to effectively measure the generation of superoxide anions by&#160;human platelets,&#160;understand the redox-dependent mechanisms regulating the balance between hemostasis and thrombosis and, eventually,&#160;identify novel pharmacological tools for the modulation of platelet responses leading to thrombosis and cardiovascular complications. This study presents three experimental protocols successfully adopted for the detection of superoxide anions in platelets and the study of the redox-dependent mechanisms regulating hemostasis and thrombosis: 1) dihydroethidium (DHE)-based superoxide anion detection by flow cytometry; 2) DHE-based superoxide anion visualization and analysis by single platelet imaging; and 3) spin probe-based quantification of superoxide anion output in platelets by electron paramagnetic resonance (EPR).

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Innovative Techniken zur ROS-Detektion und Implikationen für die Thrombozytenforschung

The generation of superoxide anion is essential for the stimulation of platelets and, if dysregulated, critical for thrombotic diseases. Here, we present three protocols for the selective detection of superoxide anions and the study of redox-dependent platelet regulation.

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen 

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ...

Immunologie und Infektion

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Zusammenfassung

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Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Ultraschall Beurteilung der Endothelial Abhängige Fluss Vasodilatation der Arteria brachialis in der klinischen Forschung

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Entwicklung und Charakterisierung von