Name: the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish
Uploaded: 2016-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish at JoVE.com

관리 및이 프로토콜에 설명 된 대표적인 결과에 대해 생성 된 물고기의 사용은 보스턴 어린이 병원, 프로토콜 # 1 14-05-2673R에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 전체에 따라 수행되었다.

1. 로티퍼 문화 <ol><li> 100 L 배양 용기를 사용하여 문화 시스템의 기본 구성 요소 <ol><li> 로티퍼 배양 설정을위한 모든 구성 요소를 수집합니다. 로티퍼 배양 설치는 로티퍼 성장하는 배양 용기 (CV)로 구성; 유사한 용기의 피드 아웃 피퍼 (피드 아웃 배양 용기, FCV)을 유지하는 단계; 둥근 바닥 부화 항아리 조류의 공급 혼합물 (AFM)의 저장 (저수지, FR 피드); 공기 공급 (AS)는 CV, FCV와 FR을 공기에 쐬다; CV 및 FCV로 조류 사료의 전달을 제어하기 위해 측정 타이머 (PMT)와 연동 펌프; 및 CV 안에 앉아 치실 입자 필터 (FPF). 주 : 공급과 구성 요소의 완전한 목록은 자재 목록에 제공된다. </li></ol></li><li> 구성 <ol><li> 문화를 쉽게 수집 계속으로 피팅의 드레인을 통해 수확 할 수 있도록 스탠드 또는 테이블에 이력서와 FCV 상승ainer (그림 1). 각 배양 용기에 강성 튜브의 길이로 AS를 연결하는가요 성 공기 공급 튜브를 사용한다. 튜브는 CV 또는 FCV의 바닥에 공기를 제공하기에 충분히 긴 있는지 확인합니다. </li><li> AFM을 포함하는 FR의 바닥까지 연장 강성 튜브 길이로 연결 AS 소용량 공기 라인을 사용한다. 공기를 조절하기 위해 각각의 공기 라인에 밸브를 설치한다. 공급 배달 튜브와 PMT에 프랑스를 연결하고 상단, CV / FCV의 측면에 드릴 구멍에 PMT에서 튜브를 실행합니다. 그림 1. </li></ol></li><li> 시작 <ol><li> 역삼 투 물 (RO)와 함께 사용할 수있는 볼륨의 90 %를 배양 용기를 채우십시오. RO를 사용할 수없는 경우, 청소, 탈 염소 처리시 물을 사용; 그러나, 생물 보안 위험 평가에는 병원성 유기체 원수에 존재하지 않도록 수행되어야한다. 참고 사항 : 분석이 수행 될 수있다어떤 자격을 갖춘 물 시험 기관에 의해. </li><li> 15g / L의 염도 도달 수족관 소금 배양 용기 물 선량. 그것이 &quot;롤링 종기를&quot;유지하도록 용기 내로 공기 흐름을 설정하고 완전히 통기하여 용해 될 때까지 천천히 배양 용기에 측정 된 염의 양을 추가한다. 완전히 산소 될 수 있도록&gt; 1 시간 동안 물을 폭기를 계속합니다. </li><li> 조류 공급 혼합물을 확인합니다. 깨끗한 3 L에, 신선한 (0 PPM)는 NaHCO3을 물 100 g 및 암모니아 중화제 (나트륨 hydroxymethylsulfonate) 100 g을 넣고 탈 염소. 이 지난 시약은 문화 장비의 살균에서 수돗물 또는 표백제 잔류 물에서 잔류 염소를 중화의 추가 혜택을 제공한다. 이것은 이들 화합물이 완전히 용해되는 것을 보장하는 것이 중요하다. 그리고 조류 농축액 (바이오 매스 건조 중량 ~ 15 %)의 1 패를 추가합니다. 4 ° C에서 프랑스와 저장소에 공급 혼합물을 추가합니다. </li><li> 5-10000000의 스타터 문화 추가 <eM&gt; 포 15g / L의 염분 물을 포함하는 이력서에 Brachionus plicatilis 로티퍼. 피퍼가 운송 또는 저장 동안 차게 된 경우, 그들은되어야 서서히 배양 용기 내의 물의 온도와 같아 (30 분 이상 동안) (25-27 °의 C). </li><li> PMT를 켜고 로티퍼 배양 용기에 조류 피드를 펌핑 시작합니다. PMT의 타이머 기능을 이용하여, 그 ~ 조류 사료 혼합물을 1.6 ml의 하루 배양 백만 당 피퍼 전달되도록 조류 사료 혼합물의 전송 속도를 설정한다. 24 시간 기간에 걸쳐 일정한 간격으로 조금씩 수유를 분배; 수유 더 자주, 더 나은. </li><li> 수동으로 일정 기간 (예를 들면, 1 분)에 대한 PMT에 돌려 펌프의 전달 속도를 보정하고 눈금 실린더 또는 비이커에이 간격 동안 펌프 조류를 수집합니다. 예를 들어, PMT 투약 조류 5 ㎖를 1 분에 있다면, 선량률 것5 ml의 조류 / 분. </li><li> 1.6 ml로, 백만, 본 피퍼의 개수를 곱하여 필요한 일일 급식 속도를 계산한다. 예를 들어, 1 억 로티퍼의 인구 규모와 로티퍼 문화는 ~ 날 (100 × 1.6 ㎖) 당 공급 160 ml의 필요합니다. </li><li> 24 시간 기간에 걸쳐 일정한 간격으로 총 일일 사료 요구 선량 PMT를 설정한다. 예를 들면, 160 ml로 하루 총 공급량의 전달이 부분에서 제공 될 수 회 8 회 일일 4 분 동안 5 ㎖ / 분의 정량 펌프 속도 PMT 세트를 사용하여 24 시간의 기간 동안 매 3 시간 (5 ㎖ / 분 × 4 분 = 20 ㎖ × 8 수유 = 160 mL)을 첨가 하였다. </li><li> 수확하기 전에, 72 시간 -이 필요한 인구를 생성 할 때까지 문화 (48)에 대해 일반적으로 성장하도록 허용합니다. 24 시간에서 최대 후 시작 배양 용기에 치실 입자 필터를 추가하고 일반 유지 보수를 시작합니다. </li></ol></li><li> 유지 참고 : 문화는 지속적으로 운영하고 routin 필요이상적으로 다음과 같은 순서로, 매일 같은 시간에 수행되어야 E 유지. <ol><li> 깨끗하고 가능한 볼륨의 90 %를 FCV를 작성, 10g / L의 수족관 염을 투여 신선한 물, 탈 염소. 물이 잘 혼합되어 있는지 소금의 모든 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. 그것은 &quot;롤링 종기&quot;를 유지하도록 용기에 공기 흐름을 설정합니다. 굴절계와 염도를 측정하고 염도가 10g / L 있는지 확인합니다. 그것은을 초과 할이 목표를 달성하지하는 것이 중요하다. </li><li> 문화의 다른 부분에서, 3 ㎖ 전송 피펫 또는 autopipettor를 사용하여 각 - 다음 2 3 샘플을 수집, 문화가 잘 혼합되어 있는지 확인 : 이력서에있는 로티퍼 샘플. 튜브에 이러한 샘플을 결합 또는 편리한 크기 (예를 들어, 10 ㎖)의 유리 병. </li><li> 전사 1 - 배양 접시 상 결합 시료 2 ml를 이는 해부 현미경 하에서 가시화 될 수 있도록. 문화의 품질을 확인 (의 동작을 수영로티퍼, 분리 된 계란의 존재, 오염 원생 동물). </li><li> 샘플 50 % Lugols 요오드 용액 100 ㎕를 첨가함으로써 결합 된 나머지 샘플 피퍼 고정시킨다. 초 이내에 Lugols 첨가 한 후, 수영을 중지 로티퍼를 관찰합니다. 이제 쉽게 로티퍼를 계산합니다. 주 : 에탄올, 묽은 표백제, 식초 또는 Lugols 대신에 사용될 수있다. 식초 (2 방울 / 10 ㎖)이라는 장점이 무해, 및 피퍼 계약을 할 수 표백제 및 요오드 용액과 같은 저장 영역에 강도를 잃고, 그래서 섬모의 코로나 및 &quot;발&quot;확장 남아 있지 동물은 자연 보인다. </li><li> 신속 플라스틱 피펫에서 ~ 2 ML의 표본을, (고정 로티퍼가 빠르게 정착 할 것이다) 시료가 잘 혼합되어 있는지 확인하고 세지-서까래 계산 슬라이드에 1 ml의 분배 (20 × 50 1 mm의 사각형) (그림 2 ). 해부 또는 복합 현미경을 사용하여, 그대로 로티퍼와 T를 계산이 로티퍼에 부착 된 계란의 otal 수 (그림 2). ~ 100 로티퍼를 계산하기 위해 필요에 따라 슬라이드 영역의 정도를 계산합니다. 피퍼 mL의 수를 계산하고, 스프레드 시트 또는이 로그 북에 기록한다. </li><li> 수확 ~ CV의 로티퍼의 볼륨의 30 % : 천천히 이력서의 하단에있는 밸브를 열고, 공기 공급 및 치실 필터를 제거하고 물이 53 μm의 메쉬 스크린 플랑크톤 컬렉터로 유입 할 수 있습니다. 버킷 또는 드레인으로 여과 후 집 전체의 저부 유출 물을 수집한다. 피퍼 손상을 방지하기 위해 중간 흐름에 부드러운을 사용합니다. 피퍼가 화면에 건조 허용하지 않습니다. </li><li> 일관성 이유로, 피퍼의 표준 번호 매일와 FCV를 확립하는 것이 바람직하다. 따라서, 공지의 CV 로티퍼 밀도 및 수확 부피를 기준으로, 일관된 최종 농도를 달성하기 위해 FCV의 전체 볼륨을 조절 (예., 1500 피퍼 / ㎖). 수확 로티 추가FCV에 FERS는 (- 15 그램 / 리터 10) 조심스럽게 깨끗한 바닷물로 채워진 세척 병을 사용하여 수집 화면에서 로티퍼를 전송합니다. FCV를 통해 화면 전환과 소금물의 부드러운 스트림 FCV에 로티퍼를 씻는다. FCV에 (~ 하루 만 로티퍼 당 1.57 ㎖) 피드를 제공하는 PMT를 시작합니다. </li><li> 깨끗하고 부드러운 나일론 브러시 나 스크럽 패드와 CV의 전체 내부를 스크럽. </li><li> 물의 양이 수확 손실 대체 5갤런 양동이 깨끗한 RO 물의 측정 된 양의 소금을 적당량 첨가하여 15g / L 물의 새로운 혼합물을 만든다. 양동이에 물에 소금을 추가하고이 완전히 용해 될 때까지 격렬하게 교반 한 후 이력서에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 싱크대에 고압 스프레이를 사용하여, 그것은 파편 될 때까지 치실 필터를 씻어하고 이력서에 반환. </li><li> 피퍼 / ㎖의 일일 횟수에 따라, 각각의 투여 이벤트의 기간을 변경하여 CV로 전달되는 조류의 공급 속도를 조정한다.전달되는 사료의 적절한 양을 결정하기 위해 위의 단계 1.3.8에서 제공 계산을 사용한다. </li><li> 약 24 시간 후, 프로세스를 반복합니다. 전술 한 (- 1.4.10 1.4.2 단계)와 동일한 방식으로 (전날에 필요하지 않은)에 잔류 FCV 피퍼를 수확하여 시작. 신선하고 깨끗한 물 탈 염소 (5g / L의 염)의 2 L에서 그들을 집중. 이러한 백업 전원으로 4 ℃에서 저장되거나이 프로토콜에서 설명하는 것 이상의, 물고기의 후기 단계를 공급하는데 사용될 수있다. 참고 :이 프로토콜은 2 개까지 허용 - 이력서에있는 로티퍼가 심각한 결과없이 수확의 생략을 허용 할 수 있기 때문에, (일반 자동 급지) 감소 문화의 유지 보수의 3 일. </li></ol></li></ol> 2. 다종 양식 <ol><li> 설정 <ol><li> 부드럽게 멸균 FIS와 린스 후 차 여과기를 통해 만들어지는 배아를 주입에 의해 산란 이벤트에서 제브라 피쉬 배아를 수집시간 물 (또는 적절하게 조절 솔루션의 다른 비 오염 소스, 예를 들어, 배아 매체, E3 등) 배양 접시에 세척 병. </li><li> 5 일간 접시 당 50 배아 - (40)의 밀도로 배양 접시에 28 ° C를 - 25 배아를 품어. </li><li> 5 일 후 수정, 또는 부화 유충의 90 % 이상이 적극적으로 물 칼럼에서 수영의 다종 양식 단계를 시작합니다. </li></ol></li><li> 접종 <ol><li> 직접 3.5 L 보육 탱크로 FCV에서 로티퍼 문화의 500 ML을 추가; 로티퍼 배양 물을 포함은 다종 양식 동안 로티퍼의 영양 성분을 유지 조류 피드를 제공합니다. </li><li> 조심스럽게 보육 탱크에 하나의 배양 접시에서 애벌레를 붓는다. 더 애벌레 접시에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 1 L의 최종 부피 및 마지막 S 도달하는 탱크로 재순환 시스템 또는 전용의 급수 원으로부터 깨끗한 조건 물고기 물 500㎖를 추가5g / L의 alinity. 참고 :이 염분은 제브라 피쉬 애벌레의 생존에 부정적인 염분에 부정적인 영향을받을 것입니다&gt; 7g / L 및 로티퍼 생존 경우 영향을받을 수 있기 때문에 중요하다 염분 &lt;2g / L 경우. </li></ol></li><li> 다종 양식 단계 참고 : 다종 양식의 단계 (5-9 일 후 수정에 해당하는 5 일 총)까지 4 일 후 접종 지속해야한다. <ol><li> 로티퍼와 물고기가 있고 성장하고 있는지 확인하기 위해이 기간 동안 적어도 하루에 한 번 다종 양식 탱크를 관찰합니다. 피퍼가 물 열을 통해 볼 수 있습니다 있는지 확인합니다. fishs가 로티퍼 중 수영, 물 열 내에 볼 수 있는지 확인합니다. </li><li> 탱크를 통해 정상적인 물 흐름을 시작합니다. 화면을 놓거나 탱크에서 플러시되지 않은 유충을 보장하기 위해 드레인 포트를 통해 배플. 주 :이 단계의 끝에서, 물고기는 아테 같은 큰 먹이 아이템을 소비 할 수 있도록 충분히 커야 할 것이다125 μm의 - (75)의 크기 범위 유생 또는 가공 공급 아이템. 주 : 대표 다종 탱크 내의 로티퍼 인구 역학이 단계 1.4.2에서 설명 된 바와 같이 동일한 방식으로 탱크로부터 피퍼 카운팅 / 샘플링하여 측정 하였다 - 1.4.5. 그것이 완료 될 때까지 다종 단계의 처음부터 하루에 한번 수행 하였다. </li></ol></li></ol>

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EC 헨리 리드 해양 생물 양식, 주식, 양식 물고기 취미 시장에 로티퍼, 조류 농축, 및 기타 소모품을 제공하는 회사에 의해 사용된다.

같은 탱크에 로티퍼와 함께 zebrafish의 애벌레를 처음 공급 물고기를 공급하는 연속 로티퍼 배양 시스템의 구축과 유지 보수 및 배양 : 초기 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기위한 로티퍼의 다종 양식 방법의 성공적인 구현은 효과적인 두 가지 작업을위한 프로토콜을 필요로한다. 처음 로렌스와 공동 저자 (14)에 의해 설명 된 제브라 피쉬의 실험실 연속 바닷물 로티퍼 ?...

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)는), 과학 분야의 증가에 이용 탁월한 실험 동물을 포함하지만 발달 유전학, 독성학, 행동 양식, 재생 생물학, 많은 사람의 장애 1의 모델링에 국한되지 - 5. 종 실험실에서 유지하기가 비교적 용이하지만, 그 배양 6와 연관된 관리 문제가 있습니다. 이 중 가장 눈에 띄는 물고기는 제 1 가스 방광 인플레이션 7 이후에 공급하기 시작 특히, 유생 양육이다. 성장 5 일, 특히 중요한 7 인 - 정상, 통제 된 조건에서이 발달 이벤트는 다음과 같은 3가 5 ~에서 일 이후 수정 (DPF)를 발생합니다. 공급 아이템, diges 적절한 크기이어야 -이 단계 동안 중앙 기술적 어려움 적절히 제 1 급전 유충의 영양 요구를 충족하는 것이다배양 탱크에 과도한 폐기물을 만들지 않고 거의 지속적으로 매력적인, 가능한 tible,,. 역사적으로이 일상 물 교환 8,9과 함께 탱크에 물고기 사료의 수많은 작은 양을 제공하여 일반적으로 달성되었다. 이들 방법은 어느 정도 성공하지만, 그들은, 비효율적 높은 노동 입력을 요구하고, 전용 변수 및 성장과 생존 (10)의 제한 속도를 반환한다. 자연에서, 제브라 피쉬 애벌레는 아마도 물 열 (11)이 풍부 작은 동물성 플랑크톤의 존재에 공급. 이러한 이유로, 그러한 짚신, 피퍼 및 아테 라이브 피드를 포함 larviculture 프로토콜은 전형적으로 7 가장 효율적이다. 2010 년, 최고 및 공동 저자는 외생 공급 (12)의 처음 5 일 동안 바닷물 로티퍼와 함께 정적, 소금기있는 물 속에서 애벌레 제브라 피쉬를 성장 가능하다는 것을 보여 주었다. 활용이 접근,ES 로티퍼 배양의 자연 높은 생산성이 낮은 노동 투입 (12, 13)와 유생의 성장과 생존의 수익률이 매우 높은 요금, 물을 오염하지 않고 충분한, 매우 영양가있는 먹이를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 전 세계 실험실의 증가는이 프로토콜의 변형을 채택하고, 많은 사람들이 지금 보육 시스템 (14)을 지원하기 위해 연속적인 방식으로 로티퍼를 배양한다. 지난 몇 년 동안, 로티퍼 / 제브라 피쉬 다종 양식 및 로티퍼 생산 모두를위한 방법은 정제보다 표준화와 쉽게 확장되고 개선되었습니다. 이 기사는 1에 대한 단계별 지침) 지속적이고 강력한 로티퍼 생산과 2) 외생 공급의 처음 5 일 동안 물고기의 강력한 성장을 지원하는 데 사용되는 로티퍼 / 제브라 피쉬 다종 양식 시스템의 구축을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Infrastructure&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L Culture Vessel</td><td>Aquaneering</td><td>Custom</td><td>Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve</td></tr><tr><td>5 Gallon Culture Bucket Kit</td><td>Reed Mariculture</td><td>CCS Starter Kit</td><td>Small volume culture vessel for small facilities</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing 1/2&quot; O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery</td></tr><tr><td>Mesh tube</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>Mesh tube support for floss filter</td></tr><tr><td>Rotifer Floss</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotifer floss 12&amp;rdquo; x 42&amp;rdquo;</td><td>Particulate waste trap</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&amp;nbsp;</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture)</td><td>Coral Vue</td><td>SKU: IC-LQD-DSR</td><td>Metering pump with timer for dosing feed to rotifers</td></tr><tr><td>Silicone Tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>Tubing for algae delivery to rotifer vessel</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing &quot; O.D.,36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for air delivery to algae paste</td></tr><tr><td>Rigid Clear Tubing O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Rigid clear tubing for algae delivery</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifers&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L</td><td>Reed Mariculture</td><td>Type L 5 million</td><td>Rotifer stock culture for system startup</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Feed&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxymethylsulfonate</td><td>Reed Mariculture</td><td>ClorAm-X&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1lb tub</td><td>Ammonia reducer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B</td><td>pH buffer for algae feed mix</td></tr><tr><td>Microalgae concentrate</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotigrow Plus&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1 liter bag</td><td>Nutritionally optimized rotifer feed</td></tr><tr><td>RG Complete</td><td>Reed Mariculture</td><td>RG Complete 6 oz bottle</td><td>All in one microalgae based feed for small scale cultures</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Water Preparation&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Reef Crystals Reef Salt</td><td>That Fish Place</td><td>198210</td><td>Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>measuring salinity</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Rotifer Culture Equipment&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton Collectors 12&quot; Dia, 53 microns</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>Mesh screen for collecting rotifers</td></tr><tr><td>Scrub Pads</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SCR-58</td><td>Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels</td></tr><tr><td>Scrub Brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bucket</td><td>Grainger Supply&amp;nbsp;</td><td>43Y530</td><td>Graduated bucket for mixing culture water</td></tr><tr><td>Hatching Jar</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>Storage of algae feed mix</td></tr><tr><td>Lugol&amp;rsquo;s Solution, Dilute</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>Agent used to immobilize live rotifers for counting</td></tr><tr><td>Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid&amp;nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>Counting rotifers</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Miscelleneous&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tea Strainer</td><td>Kitchenworks</td><td>971972</td><td>Used for collecting zebrafish embryos after spawning</td></tr></tbody></table>

the complete and updated "rotifer polyculture method" for rearing first feeding zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

여기에 기술 된 연속 로티퍼 배양 시스템은 동적이며, 매일 공급 및 수확 속도의 변동이있는 경우 로티퍼 번호는 시간이 지남에 작은 정도 변동하는 것은 통상이다. 보스턴 어린이 병원 양식장의 활성 배양 중 하나 피퍼의 인구는, 상기와 같이 유지 30 일 (도 3)에 대해 모니터링 하였다. 이 기간 동안 배양 평균 밀도는 1,330 피퍼 / ml의 최대 및 피퍼 510 / ml의 최?...

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The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

양육 먼저 먹이 제브라 피쉬의 전체 및 업데이트 &quot;로티퍼 다종 양식 방법&quot;

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.3K 조회수.  Boston Children's Hospital. Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

연구

유전학

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

발생학

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

GF 제브라피시 모델 최적화: 생성, 유지 관리 및 미생물 연구

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

저자 스포트라이트: 미생물군-숙주 관계 연구를 위한 무균 제브라피시 확립

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Zebrafish의 일반 관리 및 유지 관리 (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) 실험실 : 소개

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

생물학

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it virtually impossible to build and maintain typical rodent facilities for research. Zebrafish research has been demonstrated to be a valuable alternative for in vivo research in pharmacology, physiology, development and genetic studies. This article demonstrates that a functional zebrafish facility can be built in an easy and affordable manner. We demonstrate that such a facility could be built in about one working day with minimal tools and expertise. The cost of the 27 1.8 L fish tank zebrafish facility constructed in this study was approximately $1,500. We estimate that the maintenance of an initial working 150 fish colony for 3 months is $1,000. This project involved students, who were introduced to aquaculturing of zebrafish for research proposes.

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

양육 먼저 먹이 제브라 피쉬의 전체 및 업데이트 "로티퍼 다종 양식 방법"

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Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

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유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

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Zebrafish의 일반 관리 및 유지 관리 (

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비

저렴하고 간편한 구축 Zebrafish의 시설의 건설

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정