이 작품은 2014 KAIST 투자 K-밸리 레드 &amp; B 프로젝트 및 기초 과학 연구 프로그램 한국 연구 재단을 통해 (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023)에 의해 지원됩니다.

주의 : 발암 아세톤, 클로로포름을 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 플랫 공기 - 물 인터페이스에서 인지질 단층 1. 준비 <ol><li> 인지질 단층의 형성 <ol><li> 인지질 용액의 제조 <ol><li> 아세톤, 에탄올, 탈 이온수 3 회 이상을 사용하여 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 코팅 캡 유리 병, 물을 제거하기 위해 유리 병에 충분히 질소 가스를 불어 ㎖로 4를 청소합니다. </li><li> 인지질을 1 ㎎을 용해 (예 dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) 바이알에 클로로포름 1 ㎖에 1 밀리그램 / ㎖의 농도를 얻었다. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. 인지질 솔루션의 낮거나 높은 농도 (필요한 경우)를 사용합니다. </li><li> 추가 염료는 인지질 태그 (예를 들면, 로다 민 dipalmitoylphosphatidylethanolamine, 로다 민 DPPE) 인지질 SOLU의 1 몰 %와기, 형광 현미경으로 인지질 단층을 시각화하기 위해서. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. </li><li> 용매의 증발을 방지하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 테이프로 감싸 바이알, 및 -20 ℃에서 냉동고에 샘플을 저장한다. </li></ol></li><li> 공기 - 물 인터페이스 상에 인지질의 증착 <ol><li> 배양 접시 (직경 55mm, 높이 12mm) 에탄올, 및 탈 이온수 3 회 이상 세척. </li><li> 공기 - 물 계면을 만드는 탈 이온수 10 ml의 배양 접시를 채운다. </li><li> 원하는 표면 압력을 달성하고 종래 실험 일에, 용매를 완전히 증발 적어도 30 분간을 기다려야 깨끗한 인터페이스 상에 마이크로 주사기 인지질 용액 몇 ㎕를 확산. 주 : 랭 뮤어 통은 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우 대신 페트리 접시로 사용될 수있다. </li></ol></li></ol></li><li> 스와rface 압력 측정 <ol><li> 윌 헬미 플레이트 장력과 인지질 단분자막의 표면 압력을 측정한다. 여과지 빌헬 판으로서 사용되는 경우 여과지 충분히 습윤 얻을 적어도 30 분 동안 기다려. 자세한 프로토콜은 쿤 등에서 사용할 수 있습니다. (20). </li><li> 정확히 표면 압력을 제어하는​​ 인지질의 퇴적 량을 조정한다. ~ 5 mN의 / m 면압의 경우 계면의 30.25 cm 2 - 지역 상 DOPC 용액 (1 ㎎ / ㎖) 4 μl를 추가하는 것이 요구된다. 주 : 여과지가 완전히 습윤되지 않는 경우, 표면 압력 때문에 여과지의 중량 변화를 실험의 처음 30 분 동안 극적으로 변화시킨다. </li></ol></li><li> 단층의 대류 유동을 최소화 <ol><li> 페트리 접시의 큰 부분에 연결된 두 개의 얇은 채널을 3mm 저수지를 포함하는 원뿔 모양의 장치를 사용하여,의 대류 흐름을 억제모폴로지 촬상 표면 압력 측정을 방해 할 수 단층. </li><li> 인지질은 공기 - 물 계면에 인지질을 증착하기 전에 전체 영역에 걸쳐 자유롭게 이동되도록 원추형 장치의 내부와 외부 사이의 수위 일치하십시오. </li></ol></li></ol> 방울의 곡면에 인지질 단분자막 2. 제조 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관의 프로세스 테이퍼 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러의 모세관 홀더에 유리 모세관 (외경 1mm, ID 0.78 mm, 길이 100mm)을 놓습니다. </li><li> (: 차, 램프 : 60, VEL : 70, 지연 : 열 (70) 및 압력 200) 적절한 매개 변수 값으로 모세 혈관을 당겨위한 프로그램을 설계 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 설계 프로그램과 모세 혈관을 잡아 당깁니다. 주 : 모세관이 수 마이크로 미터 직경으로 끝나는 것은 APPL 의해 100 μm의 방울을 형성 할 필요가있다~ 10 kPa의 압력을 가진 잉. 모세관의 선단이, 훨씬 높은 압력,&gt; 600 kPa의 너무 작은 경우는 너무 큰 모세관 선단으로 소적의 크기를 제어하기 어려운 반면, 적을 얻기 위해 요구된다. </li></ol></li><li> 액적 표면에 흡수 인지질 주 : 방울의 만곡 계면 인지질 단층을 형성하기 위해, 염료없이 인지질 용액을 첨가 절차 (1)에 의해 제조, 플랫 단층에 대하여, 강도 콘트라스트를 얻기 위해 사용 두 절차 2.2.1 및 2.2 인지질 태그 .2 여기에 허용됩니다. 액적 표면에서의 표면 압력의 정밀 제어가 필요한 경우, 절차 2.2.2 추천된다. 그러나 그렇지 않은 경우, 절차 2.2.2보다 훨씬 쉬운 방법입니다 절차 2.2.1, 유용합니다. <ol><li> 팁 끝 부분에 인지질의 과정을 코팅 <ol><li> 아세톤, 에탄올, 및 탈 이온수를 적어도 세 번 사용하여 슬라이드 유리를 청소. </li><li> 경기 수세정 슬라이드 글래스에 테이퍼 모세관 에이스, 및 선단부와 슬라이드 글라스를 만지고 촉진하는 모세관 기울. </li><li> 유리 주사기를 사용하여 유리 슬라이드에 부착 모세관의 선단에 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)을 몇 방울 떨어 뜨리 및 용매를 완전히 증발 적어도 30 분을 기다린다. 주 : 매우 선단 둘레 만 모세관 력에 의해 선단 인지질 방울을 잡고 너무 작아서 절차 2.2.1.3 중에 유리 슬라이드에 모세관의 선단을 부착 권장한다. </li></ol></li><li> 소포 용액의 제조 <ol><li> 유리 병을 청소하고, 절차 1.1.1.1에 소개 된 바와 같이, 유리 병에서 물을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 질소 가스를인가함으로써 인지질 용액 (1 ㎎ / ㎖)의 2 mL의 부피를 건조하고 잔류 용매를 제거하기 위해 1 시간 동안 실온에서 유리 병을 건조하는. 안전을 위해 흄 후드에서이 절차를 수행합니다. </li><li> 2 추가바이알 내로 ml의 탈 이온수는 지질을 건조시키고, 1 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 바이알을 배양 함유. </li><li> 유리 병 여러 번 흔들어하고, 초음파 처리 (HF 주파수 : 40 kHz에서, 전원까지 : 370 원) 소포를 얻기 위해 30 분. </li><li> 단 분산 단일 층 소포를 얻기 위해 압출 및 동결 해동 과정을 수행합니다. 제조 소체 대한 상세한 프로토콜은 메이어 외. (21)에 대하여 설명한다. 주 : 액적 계면의 면압 단 분산 단층 소포를 포함하는 액체 방울을 형성 한 후에 대기 시간을 조절함으로써 정확하게 제어된다. 펜던트 드롭 방식 (22)을 이용하여, 사전에 실험을하고, 시간에 따른 면압의 변화를 측정하는 것이 필요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 곡면에 인지질 단층을 포함 액적 형성 <ol><li> procedur에서 탈 이온수 10 μL와 테이퍼 모세관를 입력전자 2.2.1. 대안 적 절차에서 2.2.2 소포 용액 10 μL를 사용한다. </li><li> 방울을 형성하는 압력을 제공하기 위해 자동화 된 마이크로 인젝터 모세관 연결한다. </li><li> 정확하게 모세관의 위치를​​ 제어하도록 미세 조작기에 마이크로 인젝터에 접속되어 모세관 마운트. </li><li> CCD 카메라와 모세관의 측면도을 이미징 (10X 현미경 NA 0.3 1 대물​​ 렌즈)를 명 시야 현미경을 준비한다. 따라서 1 현미경 Z 축을 따라 적의 정확한 위치를 관찰하고 액 적의 크기를 추정 할 수있다. </li><li> ~ 100 (적절한 크기까지 모세관의 선단과 변압 (~ 100 고전력 증폭기)을 선단의 측면도 잘 미세 조작기를 사용하는 현미경 (1)에 의해 가시화되는 위치에 선단부를 이동 적용 액적 지름 μm의)이 형성된다. 참고 : 자동화 된 마이크로 인젝터 및 미세 조작기를 사용하는 것이 좋습니다D는 방울의 크기와 위치의 정밀한 제어가 필요하고, 경우. 그것은 수동 것을 사용하는 것도 가능하다. </li></ol></li></ol> 물방울 병합 후 3 이미징 형광 복구 주 :이 프로토콜의 기본 원리는 액적 유착 과정을 제외 FRAP 기술의 그것과 동일하다. FRAP의 상세한 프로토콜 및 관련 이론 A. 로페즈 등. (15)와 D 악셀로드 등. (16)에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 모니터링 및 액체 방울의 위치를​​ 제어 <ol><li> 로다 민 - DPPEs (560 nm에서 여기, 583 nm에서 방출)에 대한 적절한 필터 세트와 형광 현미경을 모두 할 수 있습니다 (: 10 배 NA 0.3, 튜브 렌즈 초점 거리 17cm 현미경 2, 대물 렌즈)를 설정 거꾸로 현미경을 준비 및 명 시야 현미경. 형광 현미경으로 액적 m의 평면도를 시각화 여기 CCD 카메라를 사용하여송시와 밝은 필드 현미경 모드. </li><li> Z 축을 따라 평면 공기 - 물 계면에 인지질로 피복 한 방울을 이동하지만, 미세 조작기를 이용하여, 아직 액체 방울을 병합하지 않는다. 방울의 측면보기를 시각화하는 현미경 1을 사용합니다. </li><li> 미세 조작기를 사용하여 평면 단일 층의 평면도의 중심에 방울을 찾습니다. 평면 단일 층의 평면도를 시각화하는 현미경 2의 밝은 필드 현미경 모드를 사용합니다. </li></ol></li><li> 평면 공기 - 물 인터페이스에 방울을 병합 <ol><li> 방울이 미세 조작기를 사용하여 인터페이스 상에 병합 될 때까지 평탄 계면을 향해 상기 액 적을 이동. 병합 프로세스가 성공적으로 수행 된 경우, 흰색 배경에 의해 둘러싸인 원형과 어두운 영역은 현미경 (2)의 형광 모드를 이용하여 관찰된다. </li><li> 극소의 형광 모드를 사용하여, 액체 방울을 병합 한 후 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈를 녹화2. 여기서 단층의 확산 시간 스케일보다 더 빠른 프레임 레이트를 사용하여 극복. DOPC 단층에서 완전히 200 μm의 어두운 영역으로 확산하는 데 몇 분 정도 걸립니다. </li></ol></li></ol> 4. 영상 분석에 의한 확산 계수 결정 주의 : 아래에 설명한 바와 같이 일련의 이미지에서의 확산 계수를 결정하기 위해 이미지 분석 용 맞춤 프로그램이 내장되어있다. 이 프로그램의 자세한 소스 코드 조브 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 관심의 원형 영역의 검출 <ol><li> 관심 영역의 중심 검출 <ol><li> 원형 어두운 영역 및 백색 배경을 포함하는 복구 처리 중에 기록 된 형광 일련의 이미지를 획득하고, 참조 화상과 같은 시리즈의 첫 번째 이미지를 설정한다. 여기서, D는 R 기준 화상에서 어두운 영역의 반경이다. </li><li> 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상 사람SE 강도가 전체 영역에 걸쳐 균일하다. 여기 맞춤형 프로그램 라인 (124)의 소스 코드와 같이 컨벌루션위한 &#39;CONV2&#39;라는 기능을 사용하여 매립, 흰색 원의 반경 R에 D보다 약간 작다. </li><li> 컨볼 루션 연산에 최소치를 나타내는 위치를 찾아 내고, 기준 영상에서 관심 영역의 중심이 위치를 설정한다. </li></ol></li><li> 관심 영역의 반경을 결정 <ol><li> 전체 영역에 걸쳐 균일 한 절차 4.1 강도에 의해 결정된 중심 위치를 포함 흰색 원과 참조 화상을 나선상. 여기서, S는 R 흰색 원의 반경이다. 이러한 반복 사용 &#39;대&#39;또는 사용자 정의 프로그램 라인 102-109의 소스 코드에 도시​​ 된 바와 같이 흰색 원을 만드는 원의 방정식 &#39;하면서&#39;등. </li><li> 약간이 다른 흰색 원으로 참조 이미지를 나선상R의 S보다 큰 반경 (5 % -10 %), R의 L,. 맞춤형 프로그램 라인 113-120의 소스 코드에 나타낸 바와 같이 동그라미를 만드는 절차 4.1.2.1과 동일한 방법을 사용한다. </li><li> 4.1.2.1 및 4.1.2.2의 두 회선 계산 사이의 값의 차이를 가져옵니다. </li><li> 화소 레벨로의 S와 R R L의 양을 증가시킴으로써, R S = 2R D에 R R S = D / 2에서 상술 한 과정을 반복한다. 반복 4.1.2.3에 절차 4.1.2.1에서 전체 소스 코드를 포함하는 반복합니다. </li><li> 두 회선 계산 사이의 값의 최대 차이를 나타내는 R (S)의 반경을 찾을 수 있습니다. 이 R 따라서 참조 화상에서 어두운 영역의 반경을 나타내는 S (149)로 정의 프로그램 라인 (148)의 소스 코드와 같이 반경을 찾기 위해 맥스 &#39;라는 용도 임베디드 함수의 값은 최대 차를 나타낸다. </li></ol></리&gt; </ol></li><li> 분수 강도의 계산 <ol><li> 관심 영역으로서 4.1 절차에 의해 결정된 중심 위치 및 반경을 포함하는 원을 설정한다. </li><li> 시간에 따른 형광 이미지의 시리즈에서 관심 영역의 평균 강도를 계산한다. 관심의 영역과 각 프레임을 나선상 평균 강도를 계산하는 데 관심 영역의 면적을 나눕니다. 세부 사항은 주피터 웹 사이트에서 사용할 수있는 사용자 정의 프로그램의 소스 코드에서 사용할 수 있습니다. </li><li> F (t)는 시간에 따라 관심 영역 인 원의 평균 강도는 다음 식으로 정의 부분의 강도를 계산, F i는 원의 초기 강도 및 F o를의 강도 흰색 배경. F (t) = (F (t) - F에서 I) / (O F - F에서 I) (식 1). </li></ol></li><li> F 피팅FRAP 이론 ractional 강도 <ol><li> I 1 피팅 프로그램을 사용하여, 베셀 함수를 수정, τ는 시간 확산 특성 및 I 0이고 다음 식으로 분별 강도를 맞춘 τ를 얻기 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (수학 식 2). </li><li> D는 확산 계수이고, 어두운 영역의 반경의 관계, τ에 기초하여 확산 계수 = 2 / 4 D를 얻었다. 주 : 피팅 과정은 복구 과정이 이미 화상을 기록하기 전에, 시작되면 시간축 분수 강도 프로파일을 이동시킬 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids:+where+they+are+and+how+they+behave.">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li><li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., L&#233;ger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+fluidity+and+lipid&#8212;protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency.">Modification of fluidity and lipid&#8212;protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li><li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function.">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li><li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis.">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li><li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs:+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity.">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics.">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li><li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion.">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).</li><li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a., Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers.">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li><li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films.">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li><li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface.">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li><li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers.">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).</li><li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements.">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li><li>Filippov, A., Or&#228;dd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers.">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li><li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li><li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions,+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory.">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li><li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis.">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li><li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Methods of Chemistry. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li><li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces.">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li><li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAM은 특히 특정 지역 표백 후 형광 회복을 측정하기위한 FRAP와 기본 원리를 많이 공유하지만 FRAM은 표백 된 영역을 형성하도록 평면 인터페이스에 액적 병합 대신 집중 조명을 적용하는 방법을 사용한다. 병합 프로세스는 따라서 FRAM에서 가장 중요한 단계이며, 특히, 액적 병합 후 평면 단층에서 어두운 얼룩 형상 확산율 측정의 정확도를 결정한다. 구체적으로는, 현재의 방식에 기초하여, 우리는 단지 절차 4에 도시 된 어두운 얼룩의 평균 강도를 계산하기 위해 관심 영역으로 반경 R과 원을 설정하고, 원형에서 너무 많은 편차가 존재하는 경우, 이는 확산 계수의 정확한 측정을 방해 할 것이다. 따라서, 원형의 어두운 영역을 구할 필요가 있지만, 비 원형 형상은 여러 가지 이유로 인해 때때로 형성되어있다. 먼저, 동물의 대류 흐름이 존재한다면RI 요리는, 어두운 영역의 형상은 유동 방향을 따라 연장된다. 절차 1.3에서 언급 한 바와 같이, 원뿔 형상 장치는 대류 흐름을 억제하는 데 도움이 연신은 최소화 될 것이다. 모세관의 선단은 병합 과정 평면 인터페이스에 접촉하면 캐 필러 리 끝 병합 프로세스를 중단 이후 둘째, 어두운 영역은 다양한 형상으로 형성된다. 오직 모세관의 끝에서 걸려 방울을 구함으로써, 간섭이 방지 될 수있다. 특히, 모세관의 소수화 처리는 모세관의 끝에서 앉아 방울을 돕는다. 따라서, 위의 문제 총격 및 수정이보다 정확하게 확산 특성을 측정 할 수있게. 이 잘 troubleshot 과정은 따라서 FRAM은 FRAP를 통해 몇 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다. 첫째, FRAM은 FRAP에 비해 간단한 장비를 필요로한다. FRAM, 그것은 단순한 마이크로 형광을 사용하는 것으로 충분하다대신 파장 염료의 흡수 스펙트럼과 일치해야 고출력 레이저 비싼 공 초점 현미경, 대처. 또한, FRAM은 액체 방울의 크기 또는 액적 표면에서의 표면 압력을 조정함으로써 용이하게 된 영역의 크기를 제어하면서, FRAP의 표백 된 영역의 크기를 조정하기위한 추가 장치를 사용할 필요가있다. 둘째, FRAM에 다양한 종류의 염료를 사용할 수있다. FRAP는 누구의 표백 공정 확산 공정보다 훨씬 빠른 염료 분자를 사용합니다. 염료의 확산 표백 과정에서 발생하는 경우, 정확하게 확산 특성을 추정하기 어렵다. FRAM은, 그러나, 염료 표백 공정을 필요로하지 않으며, 따라서 이는 형광 이미징 염료의 다양한 유형의 사용을 가능하게한다. 또한, FRAP 추가 고출력 레이저를 필요로하며, 필터는 FRAM에 필터 세트를 대체하는 것만이 필요하다 반면, 염료 종을 변경 설정한다. 최종적으로FRAP만을 측정하는 동안, 액적 표면과 평평한 계면 단층 때문에, 따라서 상호 확산의 연구를 가능하게하거나 형에게 B 형 단층에 단층을 병합하여 두 개의 서로 다른 지질 단층 사이 혼합 독립적으로 형성 될 수있다 단층의 자기 확산. 이러한 장점에도 불구하고, 평탄 공기 - 물 계면에 액 적을 병합 프로세스는 잠재적으로 인해 이러한 두 단층 사이의 면압 불일치, 병합 프로세스의 시간 스케일로서 관심사가 될 수있는 몇 가지 문제에이 기술을 제한 할 수있다 액적들을 병합 후 평면 단층의 표면 압력 및 증가. 이러한 문제는, 그러나, 다음과 같은 이유로 크게 확산 측정에 영향을 미치지 않는다. 첫째, 두 개의 서로 다른 단층에서의 표면 압력이 상당히 다른 경우에도, 평형 처리가 복구 프로세스 동안 매우 이른 단계에서 완성된다. 예를 들어, t면압 평형화까지 그 액적 표면에 단층의 압력 평면 공기 - 물 계면에 단층의 표면보다 높은, 어두운 영역은 확장된다. 이 프로세스가 10 밀리 초 이내에 완료이기 때문에 크게 확산 공정에 영향을 미치기 전에, 면압 평형화한다. 병합 처리의 시간 스케일이 충분히 빠른 경우 둘째, 전혀 확산 측정치를 제한하지 않는다. 다행히도, 전형적인 병합 프로세스는 10 밀리 초 이내에 완료된다. 마지막으로, 통의 표면적 보낸 면압을 증가시키지 않는 평면 인터페이스 상 액 적의 병합 심지어 여러 방울의 면적보다 훨씬 크다. 프로토콜에 기재된 저점 방울의 크기에 따라 분자 당 면적은 방울을 병합하여 0.015 % 이하로 증가한다. 따라서 의한 분자 당 면적의 변화에​​ 표면 압력의 증가는 negligibl 인 0.1 % 미만이며윌 헬미 플레이트 장력에 의해 측정 된 전자는 또한, 면압 전형적인 에러보다 훨씬 작기 때문에. 요약하면, 우리는 평면 인터페이스에 액적 단층을 병합하여 인지질 단분자막의 측면 확산 특성을 측정하는 새로운 방법을 도입했다. 이 기술은 비교적 간단한 장비를 필요로하며, 또한 염료 종의 다양한 종류를 사용할 수있다. FRAM 따라서 유체 - 유체 계면에서 인지질, 블록 공중 합체, 심지어 단백질 나노 입자를 포함한 모든 계면 활성제, 확산의 측정을위한 잠재적으로 적용 가능하다. 또한, 우리는 FRAM은 두 개의 서로 다른 계면 활성제 사이에 혼합 간 확산 또는 공부를 할 수있는 새로운 방법을 제공합니다 기대합니다.

<html> 인지질 주요 세포막의 구성 요소와 세포 소기관의 막이며, 이들 층의 막 유동성 종종 막 단백질 (1)의 활성을 변경하여 세포 기능에 영향을 미친다는 3 -. 예, 막 들어 &#160; 지질 항상성은 막 단백질에 의해 검출되고, 막 유동성을 조절함으로써 달성되어, 유동성의 비정상적인 레벨은 간 지방증 및 담즙 4와 같은 심각한 질환을 야기한다. 또한, 공기 폐포 액 계면에서 인지질 단분자막의 유동성이 그 기능에 중요한 의미를 갖는다. 낮은 유동성이 호기 5,6 동안 폐포 내에서 머물 수있는 층을 가능하게하는 반면 폐 계면 활성제 인지질 단일 층의 높은 유동성, 흡입시 층의 확산을 용이하게한다. 그것은 자신의 역할을 이해하는 인지질 층의 유동성을 평가하는 것이 중요하다. _content &quot;&gt; 유동성의 직접적인 측정은 점도이고, 인지질 층의 점도는 미크론 크기의 콜로이드 7 자성 바늘 8,9, 자성 마이크로 6,10,11 버튼을 이용하여 측정하고있다. 그러나, 이들 기술 비교적 경질 막에 한정되고, 덜 점착성 필름을 측정 할 수있다. 이러한 경우에서, 확산율이 인지질 층의 유동성을 계량하는 대안이 될 것이다. 수십 년 동안, 인지질 층의 확산 특성을 측정하기위한 다양한 기술이 개발되어왔다 이러한 형광 소광 법 (12), 펄스 전계 구배 NMR (13), 및 형광 상관 분광법 (FCS) 가장 대표적인 방법 (14). 하나로 (FRAP) 15,16 photobleaching에 후 형광 복구이다. 측정 절차 및 관련의 단순성으로 인해 인지질 층의 확산 특성에 대한 이론, 여러 연구 FRAP를 사용하여 수행되어왔다 <suP&gt; 17-19을. 그러나 FRAP 보통 고출력 레이저 공 초점 현미경 비싼 설정을 요구한다. 여기서, 우리는 (FRAM)를 병합 한 후 형광 복구 되나 인지질 단분자층의 측면 확산을 측정하는 새로운 방법을 제시한다. FRAP FRAM과의 주요 차이점은 광표백 단계가 드롭 합체로 대체된다는 것이다. 형광 표지 된 평면 단층에 비 형광 단층에 의해 덮여 방울을 병합하여 광표백 단계와 같은 초기 상태를 설정, 밝은 평면 단일 층에 원형 어두운 얼룩을 남긴다. 우리는 그 측면 확산을 측정하는 시간에 어두운 얼룩에 형광 관찰을 회복. 액적 유착하여이 새로운 &quot;표백&quot;단계 FRAP에 비해 상당한 이점을 제공한다 : FRAM은 형광 현미경보다는 FRAP에 필요한 고출력 레이저 비싼 촛점 현미경을 필요로한다. 나는그것은 광표백 공정을 포함하지 않기 때문에, N의 첨가는, FRAM은 형광 염료의 다양한 종류가있다. 마지막으로, 두 개의 서로 다른 단층, 액적 단층과 평면 단층, 따라서 FRAP만을 단층의 자기 확산을 측정하면서 상호 확산이 측정 될 수 있도록, 독립적으로 제조 될 수있다. FRAM은 거의 점성 재료 고점도 물질로부터 확산 측정 폭넓게 제공한다. 확산 액적 유착 과정 (~ 10 밀리 초)의 시간 동안 지역 100 ㎛ 100 ㎛의 걸쳐 발생하는 경우 원칙적으로, FRAM은 기존 기술에 필적 106 μm의 2 / 초, 최대 확산 계수를 측정 할 수있다. 단분자층은 고체 아니라면 또한 느린 확산 처리를 쉽게 측정 할 수있다. FRAM은 한 적절한 형광 태그 분자로서 사용할 수있는 계면 활성제 중 어느 한 종류의 재료에 대해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

도 1에 나와있는 바와 같이, 형광 화상의 시리즈는 평면 DOPC 단층 상 DOPC 단층 도포 액적 병합 후 회복 과정에서 시간에 따라 수득 하였다. 평평한 공기 - 물 계면에서 DOPC 단층는 소량으로 도핑 된 로다 민 - DPPE하고,이 때문에 가능 밝은 색상과 새로 평면 인터페이스에 추가 어두운 영역과 배경을 시각화했다. 거기에서, 복구 프로세스는 고정 면압 23 mN의 / m에서 관찰되었다. 시간에 따른 부분의 강도 변화에 대한 방정식 (1)의 착용감이 맞는 R 2 값은 0.999이다.도 2에 도시되고, 착용감이 여전히 더 낮은 또는 높은 표면 압력에서 잘 작동한다. 이 피트로부터 얻어지는 DOPC 단층의 확산 계수는 면압 23 mN의 / m에서 27.54 ㎛의 2 / 초였다. FRAM의 추가 검증, DO의 확산 계수에 대한PC 및 디 팔미 토일 포스파티딜콜린 (DPPC) 단층은 표면 압에 따라 측정 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이, FRAM 9 ~ mN의 / m 면압, LC (액체 응축) 여기에서 DPPC 단층의 확산 계수의 급격한 저하를 캡처 - LE (액체가 팽창) 위상 천이 (10)를 발생하여, 값 확산 계수는 피터스 등. (19)에 의해 이전에 측정과 잘 일치한다. 또한 면압과 확산 계수의 지수 형 감쇠는 DOPC 단층에서 관찰되었고, 이러한 경향은 카루소 외. (12)에 의해 측정 된 하나와 거의 동일하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> 그림 1. (A) FRAM의 도식 그림 (병합 후 형광 복구) 기술. 입술로ID 단층 코팅 방울 평면 공기 - 물 인터페이스에 통합되어, 형광없이 지질 단층 지질 평면 형광 지질 단층에 삽입 태그. 면압 23 mN의 / m (스케일 바 = 100 ㎛)에서 DOPC 단층의 회복 과정에서 시간 (B) 형광 현미경 이미지. DOPC 단일 층의 어두운 영역이 완전히 몇 분 이내에 확산 프로세스에 의해 회수한다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> 대 시간 2. 소수 강도를 그림. 검은 원과 회색 점선은, 시간으로 분별 강도에 화상 해석 (절차 4.1 4.2) 및 식 (1)의 끼워 맞춤 부분으로부터 얻어진 강도의 값을 나타내고절차 4.3에 표시된 각각. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC (삼각형)과 DPPC (빈 사각형) 표면 압력의 함수로 단일 층의 그림 3. 확산 계수. 밝은 회색 컬러와 어두운 회색 컬러 라인은 이전 피터스 등에 의해보고 된 확산 계수의 값을 나타낸다. 그리고 카루소 등., 각각. 이 수치는 정 등. (23)에서 수정되었습니다. 정 등. 랭 뮤어. (30) (48), 14369-14374에서 허가 재판. 저작권 2014 미국 화학 학회. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K 조회수.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

비디오: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

생화학

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

생물학

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

면역학 및 감염병학

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...