Name: molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
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우리는 자이스 Confocor 3 장비의 유지 보수 및 셀 측정에 관한 유용한 팁 박사 Vladana Vukojeviç, 분자 의학 센터, 카롤린스카 연구소 감사합니다. 이 연구는, 매그너스 Bergvalls stiftelse 및 Stiftelsen Claes가 Groschinskys의 minnesfond에서 Vetenskapsrådet에서 보조금 (1629 허가 번호 2012-)에 의해 투자되었다.

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The authors have nothing to disclose.

FCS이 프로토콜은 면역 세포 (뮤린, 인간 또는 다른 종) 모든 유형의 표면 분자의 분자 동력학 평가를 위해 사용될 수있다. 아래 살아있는 세포의 단일 분자 해상도 FCS 조치 시공간 분자 역학. 분자 밀도뿐만 아니라, 관심있는 단백질의 확산 속도 및 클러스터링 역학은 자기 상관 곡선으로부터 추출 될 수있다. 형광 라벨에 성공 FCS 실험에 대한 중요한 중요하다. 세포막에 관심이 단백질은 전통적으로 항체를 사용하여 라벨이되었고, 항체는 종종 순진 면역 세포의 표면 단백질에 사용하기에 가장 편리합니다. 레이블이없는 항체는 직접 고분자 밝기로 사진을 안정 형광 염료를 결합해야합니다. 항체 결합에 대한 형광의 선택은 측정들의 품질에 중요하다. 유동 세포 계측법에 대한 표준 라벨,이러한 형광 및 피코 에리 트린 기반의 염료로 인해 빠른 표백에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 항체에 직접 접합을위한 사진 안정 염료는 현재 여러 회사에 의해 제공됩니다. 제조자는 일반적으로 결합하고, 생성 된 공액 된 항체의 정제를위한 만족스러운 프로토콜을 제공하며, 이는 몇 시간 동안 수행 될 수있다. 이 형광 단백질을 이용하여 FCS를 수행하는 것도 가능하지만, 형광 단백질은 가장 광 안정 화학 형광보다 표백 일반 경향에 있기 때문에 특별한주의가 레이저 파워를 최소화하기 위해주의해야한다. 이전의 경험에 의하면, 과발현 단백질 종종 형광 단백질의 사용이 부적합하게 밀집에 의한 확산 속도에 상당한 감소를 이끈다. 측정에 앞서, 핀홀 보정은 중요한 단계이다. 초점 볼륨의 크기를 결정하기 위해 사용 된 형광체는 확산 계수를 알고 있어야S (수학 식 2 참조). 초점 볼륨의 크기를 결정하기 위해 항체 라벨의 발광 스펙트럼 밀접 상응하는 유리 형광체를 사용한다. 이는 최적의 신호 효율성과 색상 채널 사이의 잠재적 인 간 상관 관계의 적절한 검출을 보장하기 위해 수행해야합니다. 시스템 능력의 범위에서 예상되는 출력 신호를 제공하도록 자유롭게 확산 형광체의 FCS 레이저 파워 시리즈를 수행한다. 실험 사이의 일관성을 보장하기 위해 실험과 같은 레이저 파워의 CPM을 비교합니다. 분석 단계에서, 상기 모델을 피팅 때 변수의 적절한 범위와 시작의 값을 넣어 필수적이다. 좋은 시작 지점을 찾기 위해 유사한 세포 시스템에서 이전에 발행 된 지식을 사용합니다. 이론적으로, FCS는 정량적 기법이지만, 최적의 조건이 거의 발생하지 않기 때문에,주의 어느 정도의 결과를 해석 할 때 수행되어야한다. 변동의 모든 유형이 기록됩니다,에 관계없이 이러한 변동의 기원. 따라서, 가능한 오류 원인을 제거하기 위해 실험 시스템에 대해 가능한 한 많은 정보가 유용하다. 용액 중의 유리 형광체의 추정 오염 물질이 적어도 10 배 짧다 TauD으로 확산하는 반면 예를 들어, 전체 세포막의 이동은, 긴 TauD (도 3A)이 변동을 야기 할 것이다. 이 기본 프로토콜은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 두 단백질은 다른 형광 물질로 표지하는 경우, 공동 - 확산 (상호 작용의 간접 측정) 상호 상관을 검출하는 방법을 확장하여 평가할 수있다. 이 단백질은 세포막에서 서로 결합되는 정도는 각 컬러 채널의 자기 상관 곡선의 높이 상호 상관 곡선의 상대 높이에 의해 표현된다. 상호 - 상관은 측정 소프트웨어에 채널 1-CH2-로 표시된다. 사전상호 상관의 CISE 분석은 크로스 토크에 대한 제어가 필요하고, 따라서 좀 더 복잡한 여기에 제시된 프로토콜보다 길다. 이 기본 프로토콜의 확장으로, 진행 방법에 대한 자세한 설명은 Strömqvist 등의 알에서 찾을 수 있습니다. 13. z 방향의 위치를 최적화하기 위해 Z-스캔 FCS (22)를 사용할 수있다. 이전의 경험에 의하면, 수동으로 수행 할 만족하고있다. FCS 자기 상관 곡선 (23)에 다수의 확산 계수에 적합 할 수있다. 이것은 서로 다른 확산 률 및 개체군의 적어도 하나의 대략 확산 비율의 개체군의 개수의 사전 지식을 필요로한다. 그렇지 않으면, 피팅 신뢰할 수없는 렌더링 너무 많은 무료 변수가있을 것입니다. 전형적인 예는, 그 확산 속도 상당히 리간드의 결합에 의해 감속 된 표면 단백질 것이다. 마지막으로, cleani완전히 제거 반복하지 않고 아웃 라이어의 추적을 ng를하는 것은 24 수있다. 형광 신호의 부족 문제를 해결하기위한 공통적 인 문제이다. 자유롭게 형광 확산을 위해, 드롭이 형광 있는지 확인하는 할로겐 램프를 사용합니다. 드롭 형광없는 경우합니다 (nM의 범위 내에서) 약간 증가 농도 형광의 새로운 배치를 혼합하고 다시 시도하십시오. 포커스 형광 드롭 내의 레이저는 소프트웨어에 설정되어 있는지 확인, 레이저 파워가 충분하다 (단계 참조 정확한 발광 필터 및 검출기가 선택되고, 「FCS 측정 &quot;윈도우의 오른쪽 채널 활성화 3.6). 레이저를 시작하고 시각적으로 레이저 빛이 시료에 도달 함을 확인하는 측면에서 보면. 바로 레이저 소스에보고하지 마십시오. 상기 선택된 발광 필터는 레이저의 파장을 포함하는 경우, 셔터는 자동 검출기의 손상을 방지하기 위해 광 경로를 차단할 것이다. 나는F 모든 설정은 미세하지만 빛이 도달하지 않는 레이저의 FCS 시스템, 컴퓨터를 다시 시작합니다. 형광 신호의 부족이 지속되면 전문가에게 문의하십시오. 표지 된 세포가 형광을 표시하지 않는 경우 단순화 된 절차를 적용한다. 할로겐 램프와 형광의 유무를 확인; , 레이저를 켜 레이저 채널을 선택하고 레이저 출력을 조절합니다. 중 하나 &quot;십자선&quot;또는 &quot;위치 추가&quot;옵션을 (단계 6.4 참조)를 사용, 세포막에 위치를 선택합니다. 신호가 아직도 너무 낮 으면 다음 샘플로 전환. 기술의 변동에 기초하여 하나의 중요한 측면은 분자 검출 합리적으로 이동 될 필요가 있다는 것이다. 매우 느리게 분자 또는 전체 측정 시간 동안 초점보다 작은 영역 내에 포획 분자의 분획을 이동하는 따라서 측정 될 수 없다. 이 표면 밀도 가능한 과소 및 확산 속도의 과대로 이끈다. 표백분자들이 레이저 조사 초점 체적 보내는 시간이 더 표백 될 높은 확률을 가질 것이기 때문에 또한 밀도 TauD 양자의 과소 추정에 기여할 수있다. 백그라운드 (초점면 외부에서 형광)의 영향이, 다른 한편으로는, 인위적으로 감지 분자의 수를 증가시키고, 상기 측정 된 CPM을 감소시킨다. 이전의 절대 밀도 결정의 전체 최대 에러는 약 40 내지 20 %로 추정되었다. 에러 소스는, 대부분의 경우에, 실험 전반에 걸쳐 동일하기 때문에, 서로 다른 생물학적 샘플과 비교하는 것이 가능하다. 또 다른 잠재적 인 에러 소스는 항체가 항체 각 잠재적 개의 표적 분자에 결합 할 수 있음을 의미 가의된다는 것이다. 저자들은 이러한 현상이 관찰되지 않았지만, 다른 항체에 대한 글로벌 기능이 보장 될 수 없다. bivalence의 잠재적 인 영향해야따라서 각 항체에 대해 개별적으로 테스트 될 수있다. 특정 기본 및 표지 이차 항체의 결합으로 인해 두 개의 연속 가의 레이블에서 인공 클러스터를 유도하는 높은 위험에 사용해서는 안됩니다. 세포 대신 관심있는 단백질의 형광 단백질 표지 버전 형질 되었다면 모든 단백질은 오직 하나의 라벨을 가질 것이다. 그러나, 이것은 항상 바람직한 것은 아니며, 심지어 불가능할 수있는 형질 전환을 요구 (예를 들면, 직접 사람의 혈액에서 분리 된 면역 세포를 사용하는 경우). 마지막으로, 단일 포인트 FCS는 이미지를 기록하지 않습니다. 이미지 출판물 또는 다른 목적을 위해 필요한 경우, 이러한 소프트웨어의 촬상 부를 이용하여 개별적으로 포착되어야한다. 항상 세포 표면의 불필요한 표백하지 않도록 FCS 측정 후의 이미지를 캡처. FCS 등 FRAP 전통적인 공 초점 현미경 계, 화상 상관 방법론과 달리 형광 변화를 정량화 할 수없는단일 분자 레벨 6에서. 이미지 상관 방법 간접적 낮은 해상도 분자의 수를 측정하지만, 전체 화상 화 영역 (25)을 통해 분자 확산 및 클러스터링의 변동을 평가할 수있다. 공 초점 현미경으로 측정 표준 SPT는 FCS 7보다 작은 크기의 주문을 라벨의 이상적인 수준을 보유하고 있습니다. 따라서, 표지 된 단백질의 농도를 표준 SPT에 의해 측정 될 수 없다. 다른 현미경 기법 SPT의 조합 (예를 들어, 확률 적 광학 현미경 또는 재구성 photoactivation 지역화 현미경) 밀도와 이동이 평가 될 수 있지만, 매우 특수한 염료 또는 11 단백질을 필요로한다. 예컨대, 조명 현미경 구조화 방출 현미경 고갈 자극했다 종종 요구 고정 샘플 차의 조합 labelin 2 차 항체의 초 해상 기술,g 26. 시스템 역학 자주 평가 될 수없는 반면 지역화 따라서 매우 정확하다. SPT과 초 해상 기술과 비교하여, FCS는 분석 결과를 추출 훨씬 적은 전력 및 컴퓨터 시간을 필요로한다. 유동 세포 계측법 면역학의 주력이고 바람직 FCS와 결합 될 수있다. 광 안정 염료의 분류 이전에 사용 되었다면 셀 정렬은, 예를 들면, 선택된 세포 집단에 대한 후속 측정 하였다 될 수있다. FCS 따라서 다른 정해진 방법으로 단독으로 또는 조합하여 사용할 수있는 방법이다. 이 프로토콜은 단일 분자 수준에서 세포막에서 면역 세포 역학과의 상호 작용은 현재 알려지지 않은 기능을 식별하기 위해 사용될 수있다. 또한, 선택된 서브 세트 대 전체 인구의 특징과 비교 될 수있다. 또한, 면역 세포 치료를위한 선택 단계로서 잠재적 역할을한다. 측정은 할 수 있기 때문에되지 면역 세포의 기능을 조사하는 대부분의 다른 방법들과 달리, 각각의 세포는 잠재적으로 회수하여 배양 할 수 있고, 셀을 소비한다. 따라서, FCS 곡선의 분석 후, 유망 세포를 추출 할 수 있고, 추정 임상 응용을 포함한 추가 애플리케이션에 대해 확대되었다.

많은 면역 세포의 기능을 분자 확산과 세포막 내에서의 상호 작용에 의존한다. 생체막들은 복잡하고, 세포막 단백질의 하나에서 병진 확산 속도에 영향을 미칠 수있는 면역 세포의 기능에 중요 할 수있는 많은 요소. 최근 선천성 면역계에 속하는 자연 살해 (NK) 세포, 림프구, NK 세포 활성화 (2)의 상태에 따라 세포막 단백질 두 연구의 차동 확산을 나타내는 것으로 나타났다. 형광 상관 분광법 (FCS)는 생체막 내의 분자 확산 속도를 정량화 할 수있는 기술이다. 그것은의 찬란 고정 볼륨 분자 표지의 평균 확산 속도, 공 초점 현미경의 일반적으로 초점을보고합니다. 그것은 분자 운동에 따라 발생하는 형광의 변동의 측정에 기초정상 상태에서의 시스템. FCS 널리 용액과 지질막 내에 두 형광 염료 및 단백질의 확산을 연구에 사용되었다. 확산 속도에 영향을 미치는 다른 출력 매개 변수는 또한 간접적 방식으로 조사 할 수있다 (예를 들어, 단백질이나 세포막의 분자의 상호 작용의 구조적 변화) (3, 4). FCS는 단일 분자 검출에 대한 가능성을 허용하는 높은 민감도로 인해, 다른 방법에 비하여 우수하다. 그것은 대부분의 단백질 5의 내생 발현 수준에 대한 전형적인 밀리몰 범위로 나노 몰, 분자의 농도에 적합합니다. 다른 대부분의 기술들은 단지 단백질 발현 수준에 대한 상대적 정보를 제공하면서 또한, FCS는 연구 볼륨 내의 단백질의 절대 값의 근사치를 제공 할 수있다. 막은 FLUO 포함 내의 다른 방법은 분자의 확산 속도를 측정(FRAP)을 photobleaching에 후 rescence 복구, 단일 입자 추적 (SPT), 다수의 핀홀 FCS 및 이미지의 상관 관계 방법. FRAP 및 이미지의 상관 관계 방법은 일반적으로 분자 (10)의 절대 수에 대한 정보를 제공하지 않는 앙상블 기법이다. SPT에 비해, FCS의 처리량은 모집단 평균의 특성에 관해서 높다. 레이저 초점 내에 존재하는 분자의 평균 확산 속도가 아니라 단일 분자의 속도보다, 측정 이후 분석은 덜 요구된다. 전문 현미경 (11)을 사용할 수 있습니다하지 않는 한 표준 SPT 라벨은 단일 분자의 식별을 허용하는 것은 매우 낮아야 때문에, SPT는 농도에 대한 정보를 제공 할 수 없습니다. 한편, FCS는 연구중인 분자가 이동되어야합니다. 그것은 단순히 매우 느리게 이동하는 추정 움직이지 분수 또는 분자를 감지하지 않습니다. 분자의 확산 속도 즉긴 획득 시간의 약 1/10 FCS 정확하게 측정 (3) (12)에 표시되지 않을 것보다 초점 내에 상주. 따라서, FCS에 의해 기록 된 확산 계수는에-움직이지-가까운 매우 느린 분수는뿐만 아니라 고려 FRAP와 SPT, 같은 기술에서보고 된 확산 속도보다 빠른 경향이있다. SPT는 것보다 FCS 분자 집단 내에서의 확산 률의 변동에 대한 상세한 설명을 제공 할 것이다. FCS는 흥분 볼륨 내의 시간에 따른 형광 강도의 변동을 정량화한다. 멤브레인의 측정의 경우, 이는 멤브레인의 조명 영역으로 변환한다. 이 논문은 이러한 변동 브라운 확산을 나타내는 분자에 의해 유도되고, 따라서, 및 여진 부피 밖으로 이동된다는 사실을 이용한다. fluctua에 대한 몇 가지 다른 가능한 소스가있다이러한 바인딩 바인딩 해제 전체 세포막의 리간드, 또는 이동의 점멸 또는 형광, 환경 영향의 삼중 상태의 존재와 형광 신호 TIONS. 이러한 추정 에러 소스는 정확한 결과 (12, 13)을 해석하기 위하여 FCS 내의 실험을 설계 할 때 고려 될 필요가있다. 일반적으로 생물 세포막의 측면 확산 속도는 막 단백질 사이 단백질과 세포 골격 사이에 모두 밀집과의 상호 작용에 의한 낮다. 역사적으로, 멤브레인의 FCS의 사용, 따라서 여기 포커스 (14)를 통해 연장 된 전이 시간 동안 탈색을 방지하기 위해 필요한 광 안정 형광체의 부족에 의해 방해되어왔다. 그러나 오늘, 적합한 사진 안정 염료에 대한 많은 옵션이 있습니다. 감지기 및 기타 하드웨어 크게 향상 또한 형광 보호 자전거의 검출을 허용기능과 낮은 밝기의 염료. 여기서, 항체 태그 관심 단백질은 형광 물질로 표지되어 뮤린 차 림프구를 사용하여 FCS의 응용 프로그램을위한 기본 프로토콜이 설명된다. 확산 계수는 분자 밀도를 추출하기 위해 자기 상관 곡선 맞도록 접근법은 또한 도시되어있다. 프로토콜은 쉽게 분자의 확산을 연구하는 기술 된 이전의 경험 면역학 다음되는 것을 목적으로한다. 그러나, 공 초점 현미경의 기본 이해가 예상된다 (참조 (15) 참조 기본적인 이해를 위해). 이 프로토콜은 비교적 용이 다른 현탁 세포 세포주 및 일차 전지 모두 적용될 수있다. 숙련 된 FCS 사용자를 위해 더 정제 된 분석 방법 중 일부는 논의에 기술되어 존재한다.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td><td>Miltenyi Biotec Norden&lt;sup&gt;AB&lt;/sup&gt;</td><td>130-096-892</td><td>Negative selection of NK cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>-</td><td>-</td><td>Made in house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&amp;nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Transparent medium</td></tr><tr><td>Antibody clone 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>For blocking Fc-receptors.</td></tr><tr><td>Anti-Ly49A antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Conjugated in house to MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Fluorescent dye for antibody conjugation.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Diluted in distilled water (1.10)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rhodamine 110 chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Known diffusion coefficient: 3.3 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A20006</td><td>Known diffusion coefficient: 4.4 &amp;times; 10&lt;sup&gt;&amp;minus;10&lt;/sup&gt; m&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/sec &lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab with curve fitting toolbox</td><td>Matlab</td><td>Version R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&amp;nbsp;</td><td>155411</td><td>8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td></tr></tbody></table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

형광 상관 분광법 (FCS)은 높은 시공간 해상도 생체막 내 분자의 확산을 연구하는 강력한 기술이다. FCS는 세포막에서 형광 표지 된 분자의 분자 확산 계수 및 농도를 정량화 할 수있다. 이 기술은 (실제 측정 시간 동안의 결과에 영향을 미치는 일없이, IE) 정상 상태가 면역 세포의 세포막 분자의 분자 확산 특성을 조사하는 기능을 갖는다. FCS는 대부분의 내인성 단백질의 전형적인 수준으로 발현되는 단백질의 확산을 연구하는데 적합하다. 여기서, 차 림프구의 세포막 단백질의 확산 속도를 결정하기위한 간단하고 강력한 방법이 설명된다. 항체 염색 생균 및 수집 한 후 통상적으로 발생 관측에 대한 측정을 수행하는 효과적인 방법을 설명한다. 최근 발전광 안정 형광 염료의 개발에 광범위 측정 동안 표백하지 염료 적절한 관심 항체 컨쥬 게이트가 이용 될 수있다. 또한이 세포막에 발현 된 단백질의 공통 특징이다 천천히 확산 엔티티의 검출을 허용한다. 생성 된 자기 상관 곡선에서 분자 농도와 확산 매개 변수를 추출하는 분석 절차가 강조 표시됩니다. 요약하면, FCS 측정을위한 기본 프로토콜이 제공된다; 그것은 공 초점 현미경의 이해되지만, 분자 확산 속도와 같은 동적 매개 변수를 측정하기위한 기술의 다른 이전의 경험과 면역 학자 다음에 할 수 있습니다.

전형적인 결과는 막 단백질 400 밀리 초 내지 10 밀리 초 범위의 통과 시간과 자기 상관 곡선을 생성한다. 분자의 수는 내생 적으로 발현 된 단백질에 대한 약 200 μm의 2 당 0.5 사이에 다를 수 있습니다. 노출 당 비용이 예상보다 낮지 것을주의 깊게 확인합니다. 이것은 백그라운드 신호의 영향이 있다는 것을 의미 할 수있다. 엄지 손가락의 규칙으로 분석을 받아 들여 세포의 CPM 신호 자유롭게 동일한 레이저 파워에 항체를 확산하기위한 CPM의보다 낮은 33 % 이하이어야한다. CPM은 레이저 파워에 따라 선형으로 확장한다. 주요 면역 세포 표면 수용체에 대한 자기 상관 곡선은 0.001 내지 1 초 사이의 가파른 부분 매끄러운 것으로 예상된다. 대표적인 자기 상관 곡선과의 시간 추적 그림 2를 참조하십시오. 도입부에서 간략히 언급 한 바와 같이,재 FCS 인해 신호를 교란 기여 형광 변동 다른 소스의 영향을 측정 분자 확산에 적합하지 않은 여러 가지 경우이다. 그림 3은 특정 셀 또는 측정 반복 폐기해야하는 경우 예를 보여줍니다. 이미 매우 낮은 신호 (매우 낮음 CPM)이 셀을 폐기의 원인이되는 것을 언급하고있다. 개별 셀을 폐기하는 또 다른 이유는 셀 (도 3a)를 이동하는 점이다. 효과는 전체에 걸쳐 상당한 측정 또는 존재하는 경우 백화의 경우 (도 3b) 또는 대형의 클러스터가있는 경우 (도 3c)에서, 상기 측정치는 폐기되어야한다. 이 기능은 하나 또는 두 개의 반복 만 존재하는 경우, 이들 각각의 반복은 폐기 될 수 있지만, 나머지 반복 여전히 사용될 수있다. 모두가 올바른 사용에 그것은 중요하다모델 데이터에 맞게 또한 착용감 밀접한 자기 상관 곡선과 겹치는 것을 잘 확인하기. 그림 4에서, 좋고 나쁜 곡선 적합의 예를 나타낸다. 곡선을 나타내는 확산 (가장 가파르게 경 사진 부분) 부분에주의를 기울이십시오. 시작과 곡선의 경사 부분의 단부 모두 모델에 잘 부착되어 있음을 확인하는 것이 중요하다. 끼워 맞춤은 상기 셀을 삭제하기위한 최종 결정을하기 전에 시작 값 및 / 또는 (합리적인 범위 내에서)이 상한 및 하한을 수정 이동 표백 또는 클러스터로서 명백한 문제없이 나쁜 경우. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> 그림 1 : FCS 소프트웨어 인터페이스. 프로토콜에 기술 된 바와 같이 여기 도시는 FCS 수집 및 이미징 소프트웨어 툴을 제공하기 위해 필요한 메인 윈도우이다. 창 A, &quot;구성 공동ntrol &quot;창이 이미징을위한 빔 경로, 레이저 채널, 필터 제어 창입니다. 창 B가있다&quot;스캔 제어 &quot;스캔 설정 이미징을위한 창을 보여줍니다. 창 C가있다&quot;측정 &quot;창에서의 창 FCS의 측정 설정의 설정. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> 그림 2 : H-2D D 주요 조직 적합성 클래스를 확산 대표 추적 및 자기 상관 곡선은 내가 갓 격리 된 쥐의 NK 세포에서 분자를 표면. 도면에서 상기 상부 패널 7X 10 초 측정 전 시간에 걸쳐 추적 시간의 함수로서 형광 변동을 나타낸다. 하단 패널은 대표이 일곱 반복의 평균 자기 상관 곡선이야. 자기 상관 곡선의 높이 초점 체적 내에 H-D 차원 엔티티 표지 모바일 형광의 농도에 반비례한다. 곡선의 기울기의 가파른 부분의 x 축 값은, 진폭의 절반의 형광 초점 체적 내에 H-D 차원을 분자 표지의 평균 체류 시간을 나타낸다. 제시된 측정 문헌 2에 게시 된 데이터 세트의 일부이다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> 그림 3 : 문제가 세포 추적의 예. (A) 이동 셀 추적이 르 기초 안정된을 가지고 있지 예시로VEL. 상단 패널이 시점 후에 매우 낮은 신호에 의해 나타낸 바와 같이 전체 셀이 약 35 초 후, 초점이 이동하는 예를 나타낸다. 하부 패널의 효과는 몇 초 간격으로 겉보기 기복이고,보다 미묘하다. (B) 셀이 표백 시간 감소 트레이스의 높이를 표시. 측정의 끝에 해당하는 측정 개시에서 미량의 높이를 비교한다. (C) 추적 스파이크로 표시 대형 클러스터의 존재. 상단 패널에서 20 ~ 25 초에 하나의 큰 클러스터가 존재한다. 하단 패널에서 여러 클러스터는 측정에 걸쳐 존재한다. 제시된 측정 문헌 2에 게시 된 데이터 세트의 일부이다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 4 : 커브 피팅 및 잔류와 대표 자기 상관 곡선. 적색 및 청색 수직선 피팅에 사용되는 시간 윈도우의 한계를 나타낸다. 샘플 자기 상관 곡선에 대한 2 차원 확산 모델의 대표 맞는 (A) 예. 상단 패널에서 녹색 곡선 (모델)이 잘 맞는을 나타내는 파란색 곡선 (취득한 자기 상관을) 오버레이. 하판 피팅 곡선으로부터 잔류 나타낸다. 잘 장착되지 않은 1 초 주변의 변동은, 셀 측정에 대한 전형적인 및 허용합니다. 동일한 자기 상관 곡선의 2 차원 확산 나쁜 맞는 (B) 실시 예. 피팅 모델은 자기 상관 곡선을 중첩하지 않고, 그 하부에 1 패널 (A 및 B) 피팅 곡선으로부터 잔류 표시 수렴하지 않는다. 잔차특히 곡선의 확산의 경우, 나쁜 착용감 상당히 크다. 제시된 측정 문헌 2에 게시 된 데이터 세트의 일부이다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

생화학

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

생체공학

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

생물학

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...