Name: layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization at JoVE.com

This work was supported by grants from the National Institutes of Health, including a microphysiological systems consortium grant from the National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), a Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 for WJM) and pathway to independence award (DK095984 for AB) from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

원주민 수용성 콜라겐 솔루션 1. 준비 <ol><li> 준비 또는 내가 1-3 밀리그램 / 등 Piez 등에 의해보고 된 표준 격리 프로토콜을 사용하여 ML. (15)에 쥐의 꼬리에서 콜라겐 산성화, 가용성, 유형의 200 mg의 구입 </li><li> 변성 콜라겐 용액의 목적하는 최종 부피를 기준으로 출발 물질의 양을 규모. 약 수용성 천연 콜라겐의 200 mg의에서, 3 ㎎ / ㎖에서 25 ~ 30 메틸화 ㎖의 석신 콜라겐 솔루션 25 ~ 30 ml의 각합니다. </li></ol> 2. 콜라겐 메틸화 <ol><li> 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액을 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관. </li><li> 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 흐린 될 해결책의 원인이 콜라겐 석출물을 관찰한다. </lI&gt; <li> 25 분 동안 3,000 × g에서 침전 된 콜라겐 솔루션을 스핀 다운. 분명, 젤 같은 침전물은 튜브의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 대기음이 제대로 뜨는 유체 폐기하십시오. </li><li> 0.1 N HCl을 메탄올 200ml에 침전 된 콜라겐을 재현 탁하고, 메틸화 반응은 4 일 동안 실온에서 교반하면서 발생할 수 있도록. 콜라겐은 용해되지 않지만 솔루션은 흐린 것 아주 작은 볼 수 조각으로 깨지한다. </li><li> 메틸화 후, 원심 분리기 25 분간 3,000 × g에서 용액은 콜라겐 메틸화 펠렛. 대기음이와 산성화 메탄올 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 반복적 피펫으로 약 3 ㎎ / ㎖의 농도를 제공 멸균 PBS 25 ㎖에 메틸화 콜라겐을 녹이고 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다. </li><li> the concentratio 평가상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 N. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석. </li><li> 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전송하여 메틸화 된 콜라겐 용액을 소독 병은 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 분리하고 저장하도록 허용 메틸화 콜라겐 상부층. </li><li> 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 3. 콜라겐 Succinylation <ol><li> 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액의 다른 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관. </li><li> 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 콜라겐은 흐린되기 위해 용액을 일으키는 석출한다. </li><li> SUC 40 mg의 해산(콜라겐 용액 부피의 1/20 번째)을 아세톤 10ml에 cinic 무수물 (콜라겐 밀리그램 당 0.4 mg)을 얻었다. 천천히 (약 0.5 ml의 단위) 지속적으로 pH를 모니터링하면서 교반 콜라겐 솔루션이 혼합물을 추가합니다. pH가 9.0에 근접함에 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 첨가하여 pH를 9.0 위를 유지한다. </li><li> 아세톤 숙신산 무수물 모두를 추가 한 후 120 분 동안 실온에서 계속 교반 하였다. 석신 콜라겐이 용해으로 명확하게하는 솔루션을 관찰한다. 정기적으로는 9.0 이상으로 유지하기 위해 pH를 확인합니다. </li><li> 1 N HCl을 20 μL 씩 증분하여 상기 용액의 pH를 4.0으로 조정한다. 석신 콜라겐 침전으로, 다시 흐린 솔루션을 관찰한다. </li><li> succinylation 후, 원심 분리기 25 분 3,000 × g에서 솔루션은 석신 콜라겐 펠렛합니다. 기음은 미 반응 숙신산 무수물로 산성화 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 숙시 콜라겐을 녹여멸균 PBS 25 ㎖, 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 피펫 팅을 반복하여, ㎖ / 약 3의 Mg 농도를 제공하고, 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다. </li><li> 상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 농도를 평가한다. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석. </li><li> 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전사함으로써 석신 콜라겐 용액을 소독 병을 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 제거하고 저장하도록 허용 the 석신 콜라겐입니다 상단 층. </li><li> 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 콜라겐 수정 4. 검증 <ol><li> 1, 기본 메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션의 각 1 ㎖의 샘플을 준비하고 진한 희석수소 이온 적정 멸균 순수 ml의 0.1 밀리그램 /의 entration. 또한 적어도 4 시간마다 10 kDa의 컷오프 membraneusing 3 솔루션의 변화를 통해 물에 대한 투석에 의해 버퍼 적어도 1000 배 희석. </li><li> 수산화 나트륨과 염산 소량의 7.3 용액의 pH를 조절합니다. 네이티브 메틸화 및 숙시 콜라겐 솔루션 적정 곡선을 만들 Tanford (16)에 의해 설명 된 바와 같이 임의의 기준으로 pH가 7.3을 사용하여, 각각의 샘플에 수소 이온 적정을 수행한다. </li><li> 산의 볼륨이 결합 된 H + 분자 당 이온의 수 대 추가 당 pH의 변화를 그린다. 높은 산도 &quot;아미노&quot;범위 중성점 향해 석신 콜라겐 시프트 (아민 기의 손실)를 표시해야하고, 낮은 pH &quot;카르복시&quot;범위는 메틸화 콜라겐 좌측 시프트 (카르복실기의 손실을 표시해야 ) 및 석신 콜라겐 우측 시프트 (카르복실기의 이득S), 천연 콜라겐에 비해. </li><li> 표준 프로토콜 17,18 다음, 2,4,6- 트리니트로 산 (TNBA)를 사용하여 비색법에 의해 대체 succinylation 네이티브 콜라겐 아미노기의 %를 결정함으로써 succinylation 반응의 효능을 평가한다. </li></ol> 미세 유체 장치 및 셀 시드 5. 제작 <ol><li> 표준 방법 (9)를 사용하여 미세 유체 장치를 제조. 100 ㎛, 높이 0.4 ~ 1.5 mm 폭, 세포 성장을위한 긴 채널 1~10mm로 미세 세포 배양 챔버를 만들 포토 리소그래피를 사용하여 정의 실리콘에 SU-8 마스터에서 PDMS의 복제 성형을 사용합니다. </li><li> 장치와 슬라이드 유리의 표면을 산화시키기 위해 플라즈마 세정기를 사용하고 본드 함께 누른다. 적어도 30 분 동안 UV 광에 노출하여 장치를 멸균 한 후, 멸균 PBS 중 50 μg의 / ml의 피브로넥틴을 가진 챔버를 채우고 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li&gt; <li> 표현형 또는 분화 상태의 안정화를위한 콜라겐 젤을 필요로 같은 차 쥐 또는 인간의 간세포와 같은 세포와 장치를 시드. 우리는 장치 당 14 × 10 6 세포 / ml에 접종 갓 격리 기본 쥐의 간세포 7,19 또는 시판 냉동 보관 차 인간 간세포의 20 μl를 사용합니다. </li><li> 세포가 4-6 시간 동안 부착하고 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 성장 매체와 도금 매체를 대체 할 수 있습니다. 확산 전체 셀을 보장하고 세포의 합류 단층을 만들 O / N을 품어. </li></ol> 6. 레이어로 레이어 콜라겐 증착 <ol><li> 층류 조직 배양 후드에서, 각각의 디바이스 당 용액 10 애플리케이션 메틸화 및 석신 콜라겐 용액의 충분한 양뿐만 아니라 미디어의 몇 MLS 준비. 얼음에 솔루션을 유지합니다. 우리는 장치 레이어 당 콜라겐의 20 μL (10 ~ 15 배의 전체 장치 볼륨)를 사용합니다. </li><li> 있다메틸화 (폴리 양이온) 솔루션 ginning 후 20 메틸화의 μL와 함께 장치를 세척 대체 각 응용 프로그램 사이에 1 분을 기다리고, 콜라겐 솔루션을 숙시. 장치를 약 20 분 소요됩니다 솔루션 당 10 회, 총 플래시합니다. 세포가없는 미디어 아르 시간의 양을 최소화하기 위해 신속하게 작동한다. </li><li> 천천히 그 크기에 따라 입구 / 출구에 축적 콜라겐을 준수하십시오. 유체 흐름에 대한 저항성 증가가 미디어 한두번 장치를 세척 한 경우 축성을 계속한다. </li><li> 모든 층을 적용한 후, 새로운 미디어로 두 번 장치를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 세포 유형에 따라, 그러한 간세포의 향상된 편광 같은 세포 외 기질 - 유도 된 형태 적 변화는, 몇 시간 내에 볼 수 있어야한다. </li><li> 콜라겐 매트릭스의 존재를 확인하기 위해 표준 방법을 사용하여 (9) 투과형 전자 현미경 장치를 준비 대표배양 된 세포의 상단에 조립. </li></ol> 세포 표현형 및 기능 7. 안정화 <ol><li> 화상 세포 유형에 대한 표준 방법을 사용하여 세포 형태, 생존 및 극성. 간세포를 들어, 콜라겐 침착의 효과를 입증하기위한 정점 편광 위상 현미경에 대한 생존 LIVE / DEAD 염색 및 CMFDA 염료를 사용 14일 위에 이미지를 수집한다. </li><li> 세포 형태에 대해, 린스 PBS 20 μL의, 화상, 위상차 현미경을 사용하여 장치를 주입하기 위해 PBS 20 μL 피펫으로하여 입구를 통해 장치를 세척. </li><li> 라이브 / 죽은 얼룩 들어, 린스 제조업체의 지침에 따라 제조 DAPI와 라이브 / 죽은 염색 용액 20 μl를 주입하는 PBS의 20 μL에 피펫으로 입구를 통해 장치를 세척, 37 ℃에서 30 분 동안 품어, 린스 다시 디바이스 (20)의 PBS μL, 화상 형광 현미경을 사용하여 장치. </li><li> 담즙 날리 들어culi 염색은 제조자의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안 배양하여 제조 DAPI와 2 μM C​​MFDA 염색 용액 20 μL를, 린스 주입하는 PBS 20 μL로 피펫으로 유입구를 통해 장치를 세척하여 장치를 다시 린스 20 μL의 PBS 및 이미지 형광 현미경을 사용하여 장치. </li><li> 소비 된 매체를 수집하고 세포의 기능을 결정하기 위해 배양 기간 동안 적절한 시점에서 세포 대사의 제품을 측정한다. 간세포를 들어, 소비 된 배지에서 알부민 및 우레아의 양을 측정한다. </li><li> 이러한 평가 효소 활동 수준, 항체 염색, 또는 RNA 분석과 같은 세포 자체에 엔드 포인트 기능 분석을 수행합니다. 간세포를 들어, 유도 및 시토크롬 P450 효소 활동이나 위상 공액 II 효소 글루타티온 S 트랜스퍼를 측정한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

얇은 순수 콜라겐 어셈블리 변성 콜라겐의 층별 증착을 이용하여 충전 재료 또는 세포 표면 상에 증착 될 수있다. 이 연구의 결과는 메틸화 네이티브 콜라겐 succinylation 세포 (도 2) 상에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 증착하기 위해 레이어 - 바이 - 레이어 기술로 사용될 수있다 (도 1) 또는 다른 충전 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 생성 함을 입증 재료 표면. 이러한 초박막 매트릭스 층은 간세포 (도 3), 그 기능뿐만 아니라, 미세 유체 소자에 파종 후 (도 4)으로 세포의 형태, 생존율, 및 편광을 안정화시킬 수있다. 얇은 콜라겐 층의 성공적인 증, 메틸화 및 석신 콜라겐을 생성 개질 반응은 중요하다. 카르복실기 메틸화 반응은 바람직하지 않기 때문에콜라겐 메틸화 반응 르 샤 틀리에의 원리에 기초하여 순방향 반응을 이용시 산성화 메탄올에서 수행되어야한다. 따라서, 반응 효율을 높이기 위해 산성화 메탄올에 침전 된 콜라겐을 용해하기 전에 pH를 침전 후 콜라겐으로부터 모든 과량의 물을 제거하는 것이 중요하다. succinylation 반응 들어 아세톤에 숙신산 무수물을 첨가하면서 9 위에 용액의 pH를 유지하는 것은 중요하다. 산도 및 숙신산 무수물 아세톤 용액을 천천히 첨가의 연속 모니터링은 반응 효율을 보장하는데 도움이된다. 계층 별 층 증착 동안, 세포 매체없이 이동 시간을 최소화하는 것이 중요하다. 10 이중층 절차는 한 대부분의 세포 배양기 외부 미디어없이해야 약 약 20 분 걸립니다. 10 개 이상의 이중층 증착해야하는 경우 COLLA 사이에 3 ~ 4 시간 동안 인큐베이터에서 미디어 세포를 휴식겐 증착은 셀의 상태를 보장한다. 다른 극단에서, 너무 적은 층은 세포 형태 유지에 적용되지 않습니다. 10 층이 한 동안 우리의 테스트에서, 3 층은 세포 형태를 유지하지 않았다. 몇 가지 수정이 문제를 해결하는 절차를 만들 수 있습니다. 문제가 발생하면 시간과 메틸화 반응의 온도는 변화 될 수있다. 예를 들어, 4 ℃로 반응 온도를 감소시키고 효율을 증가 월 7 일의 시간을 증가시킨다. 또한, pH를 추출 동안 중합의 정도에 따라, 콜라겐 때때로 완전히 메틸화 반응 동안 산성화 된 메탄올에 용해된다. 이 경우, 반응이 다음 단계 동안 펠렛 화 될 수 있도록 콜라겐을 침전시키기 위해 완료된 후 pH를 9-10로 손가락을 가지고 10 M NaOH를 추가. 미세 유체 장치의 층별 증착을인가하면서, 작은 채널 또는 포트 (CL)이 될 수있다장치의 유체 저항의 증가에 의해 표시된, 콜라겐 ogged. 신선한 미디어 장치를 비우기 증착을 계속 할 수 있도록, 어떤 방해를 제거해야합니다. 여기에 설명 된대로 층별 콜라겐 침착은 수동 미세 유체 소자의 스케일링 및 자동화 측면에서 제한된다. 그러나,이 기술은 자동화 기술과 동시에 디바이스의 어레이를 제조하는데 사용될 수있는 밸브 및 펌프를 비롯한 표준 미세 하드웨어와 호환된다. 평판 배양에 사용하기위한이 기술의 또 다른 한계는 네이티브 콜라겐 비교적 많은 양을 필요로한다는 것이다. 미세 유체 응용 들어 메틸화 숙시 및 콜라겐의 양이 많은 장치에서 얇은 콜라겐 층을 만드는 데 사용될 수있다. 표준 조직 배양 플레이트에, 다른 한편으로는, 코팅 웰에 필요한 볼륨은 물론 크기를 더 엄청나게 증가하게된다. 이 층 -얇은 콜라겐 기질 층의 증착에 의한 층 기술은 또 다른 대안적인 또는 기능적인 변형을 이용함으로써뿐만 아니라 얇은 매트릭스 조립체로 구분 세포의 여러 층을 생성하여 개발 될 수있다. 메틸화 및 succinylation의 비교적 간단한 아미노산 측쇄 개질 반응은 여기에 사용되었지만, 대체 또는 부가 반응 관능 대신 콜라겐을 생성하기 위해 사용될 수있다. 기능화 측쇄 여전히 순 전반 플러스, 마이너스 전하에 단백질을 수득한다,하지만 그러한 기능화는 다양한 응용에 유용 할 수있다.

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult. 
One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.1 Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.2 Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells3,45, microvascular endothelial cells6, and hepatocytes7, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.
To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique8 with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.9
Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes10 to cover hepatocytes in plate culture11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

<table><tbody><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>collagen type I, rat tail</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>option for concentrated rat tail collagen</td></tr><tr><td>succinic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>succinylation reagent</td></tr><tr><td>anhydrous methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>methylation reagent</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH precipitation reagent</td></tr><tr><td>rat collagen type I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>option for detecting collagen content</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>option for detecting collagen content</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collagen deposition in microfluidic devices for microtissue stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

네이티브 콜라겐 층별 증착에 사용하기위한 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 만들 메틸화 및 succinylation를 사용하여 수정 될 수있다. Succinylation가 숙시 닐기로 네이티브 콜라겐의 ε 아미노 그룹을 수정하고 메틸화는 메틸기 (도 1a)와 네이티브 콜라겐 카르복실기를 수정한다. 콜라겐 단백질 아미노산 측쇄에 이러한 변형은 용액의 pH에​​ 대한 적정 곡선을 변경. 메틸화는 아미노기에 영향을주지 않으며 카르복실기의 수를 감소하면서 Succinylation은 네이티브 콜라겐 (도 1b)에 비해, 아미노기의 수를 감소시키고, 카르복실기의 수를 증가시킨다. 이러한 변형은 콜라겐 분자의 전하 특성을 변화. Succinylation는 양으로 대전 된 그룹을 제거하고 음전하 단체로 대체하고, 메틸화는 음으로 대전 된 그룹을 제거합니다 (그림 1C &lt;/ STRONG&gt;). 메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션 (COL LBL)의 계층 별 층 증착은 세포 (그림 2A)로 대전 된 표면 위에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 생성합니다. 미세 유체 장치 (그림 2B) 내에서 피브로넥틴 코팅 유리에 시드 차 간세포는 이러한 순수 콜라겐 매트릭스 어셈블리 (그림 2C)로 코팅 할 수있다. 세포에 10 이중층의 증착은 약 140 nm의 (그림 2D)의 콜라겐 층 두께를 만듭니다. COL 요소 LBL 기술을 사용하여 증착 된 얇은 콜라겐 집합 층은 미세 유체 소자에서 14 일 이상 차 간세포를 안정화시킨다. 최고 매트릭스 커버없이 간세포는 차별화 된 표현형, 계약을 잃고, 시간 (그림. 3A-C)을 통해 미세 유체 장치의 표면을 들어 올립니다. 대조적으로, 간세포 초박 콜라겐 어셈블리 maintai 덮여십사일 (그림 3D-F)를 통해 N 그들의 차별화 된 형태와 편광. 세포의 생존율은 90 % 이상 (도 3G-I)로 유지 하였다. 또한, COL LBL 처리 간세포의 편광 혀끝 담도 누소관 네트워크 (도 3J-L)의 발전을 보여주는 시간에 걸쳐 증가시켰다. 세포 생존, 형태, 및 편광 이외에 COL LBL 기술은 복구 및 플레이트에서 세포 용 표준 기술과 유사한 수준에서 일차 간세포의 기능을 안정화시킨다. 간세포에 의한 알부민의 분비 즉시 도금 후 낮고, 세포 매트릭스 커버링 통해 편광 유도하지 않는 한 낮게 유지된다. COL LBL 처리, (그림 4A)를 안정화하기 전에 8~10일을 통해 간세포의 증가에 의한 알부민 분비 후. 우레아 생산 세포 파종 후 즉시 높은 n은 세포에서 시간이지나면서 감소매트릭스 덮여 OT, 우레아 생산 COL LBL (도 4b)로 안정화 간세포 80-10 일 후에 안정화시킨다. 사이토 크롬 P450 (CYP) 자극에 반응하여 효소의 발현은 간세포의 한 전문화 된 기능입니다. 3 methylcholanthrene에 응답하여 간세포에서 CYP1A1의 유도를 복구하고 COL LBL 처리 (그림 4C)에서 14 일까지 안정화되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig1.jpg" /> 그림 1. 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션은 화학적으로 positively 그물을 만들기 위해 수정 된 또는 그물에 부정적인 폴리머 솔루션을 충전. (A) 각각 카르복실기 및 ε 아미노 그룹을 수정 succinylation과 메틸화 반응의 개략도. COL 후 용액의 pH를 변경하는데 필요한 H + 이온의 상대적인 수의 변화를 나타내는 (B) 수소 적정 곡선 유도체변형 lagen. (C) 순 전하 네이티브 콜라겐 정규화에 H + 쉬프트로부터 계산 변성 콜라겐 용액 (B)의 (평균 ± SD). MC는 : 콜라겐을 메틸화. SC : 숙시 콜라겐. AA : 아미노산 잔기. 다시 인쇄 (9)의 허가. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig2.jpg" /> 변성 콜라겐 솔루션도 2 층별 증착은 간세포의 위에 얇은 콜라겐 매트릭스 조립체를 만들었다. (A) 마이크로 디바이스에 피브로넥틴에 시드 및 메틸화 및 석신 콜라겐 용액을 교대로 배양 간세포의 도식 표현. 대표의 TEM 단면 (그룹 당 검사 20 세포) 콘트롤 (B) 및 COL 배양 2 일 후에 (C)는 간세포를 LBL 처리. 화살표 : LBL 콜라겐 층. 스케일 바 :. TEM 이미지 (N = 4 장치에서 20 세포)에서 측정 한 셀 당 2 μm의 (D) COL LBL 층 두께 (평균 ± SD). (9)에서 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig3.jpg" /> 그림 3. COL LBL 기술은 간세포없이 최고 마이크로 디바이스의 층 (음성 대조군) 계약. 문화 14 일 동안 마이크로 디바이스에서 간세포의 형태, 생존 능력, 편광을 유지하고 표면 시간에 (A-C)를 들어 올립니다. 콜라겐의 변성 LBL 증착 간세포 형태 (D-F)을 유지하고 viability 십사일 동안 마이크로 디바이스에서 (G-1). CMFDA 비 편광 간세포 (J)의 세포질에 남아 일반적인 세포 마커이다. 시간이 지남에 따라, 담즙 누소관의 개발 시간 (L)을 통해 셀 간 개발 누소관 공간 (K)로 형광의 배설에 의해 알 수있다. 이미지 스케일 바 : 100 μm의. 삽입 된 스케일 바 : 50 μm의. (9)에서 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53078/53078fig4.jpg" /> 그림 4. COL LBL은 미세 유체 장치를 14 일 동안 간세포 알부민 및 요소 섹션과 CYP 활동을 안정화시킨다. COL LBL의 간세포에 의해 (A) 알부민 분비가 낮은 시작 시간이 증가 U, COL LBL 간세포에 의해 하루 10 (B) 우레아 분비에 고원에 도달 ntil 2 일에서 낮았다 (10) (C) 날에 CYP1A 활동의 유도를 고원에 도달 할 때까지 시간이 감소하지만, 크게 7 일째 증가 하루 14 평균 ± SEM을 통해 유지 수준; COL LBL : 간세포 LBL 콜라겐 증착 후 배양; NoTop : 없음 최고 매트릭스 층 배양 간세포; 여기서 n은 = 6-8 장치. (9)에서 수정. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53078/53078fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K 조회수.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

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Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

콜라겐의 모듈을 사용하여 미세 조직의 제조가 포함 세포를 젤

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

연구

생체공학

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

미세 패턴 혈관 근육 박막의 확장 문화 미세 유체 Genipin 증착 기술

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...