Name: isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

쥐의 연구는 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 모든 동물 보호는 IACUC 지침에 따라이었다. 신생아 및 성인 Thymi 1. 준비 <ol><li> 이전 기증자 쥐를 안락사에 대한 모든 시약 및 장비를 준비합니다. </li><li> 고압 증기 멸균 또는 기타 적절한 방법으로 수술 도구를 소독. 모든 수술은 멸균 조건을 유지하고, 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다. 기증자 마우스에서 thymi의 추출을 위해 필요한 도구를 조립합니다. </li><li> 멸균 1X PBS (PH 7.4)와 60mm 요리를 입력하고 후드 내부의 얼음에 배치합니다. 이 전에 이식 기증자 마우스에서 절제 간단히 저장 thymi하는 데 사용됩니다. </li><li> 윤리 지침에 따라, 공동으로 자궁 경부 전위 다음 2 질식을 참수 성인 기증자 마우스로 신생아 기증자 쥐를 안락사. </li><li> R의 경우흉선의 emoval은 : 멸균 흡수 종이 타월에 지느러미 누운 위치에 마우스를 놓고 절개를하기 전에 70 % 에탄올로 스프레이. </li><li> 피부를 통해 중간 선 절개를하여 복부와 흉강을 노출. 흉강을 나타 내기 위해 가슴과 앞발을 통해 피부를 접​​습니다. </li><li> 우수한 종격동 노출과 흉강을 전방에 격막과 흉곽을 통해 두 가지 측면 절개를합니다. 흉선은 바로 위의 두 개의 흰색 로브로 볼 수 있고 마음에 인접한다. </li><li> 캡슐을 방해하지 않도록 특정하고, 미세 집게로 흉선 주위의 결합 조직을 떨어져 애타게. 집게와 흉곽을 다시 누른 상태에서 장기 아래 곡선 집게의 위치를​​ 수직으로 잡아 당겨 흉선의 두 로브를 추출 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다. 이는 신생아 마우스로부터 추출 thymi 해부 범위를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 60mm 디에 흉선 배치SH 결합 지협을 통해 절단에 의해 얼음과 별도의 흉선 로브에 멸균 1X PBS (PH 7.4)를 포함. 캡슐이 손상되지 않도록 특정 만드는 흉선 로브에서 모든 파편을 제거하고 이식 섹션의 해당 번호로 흉선를 잘라. </li><li> 신생아 쥐에서 얻은 thymi를 조작하지 마십시오. 참고 :이받는 사람 마우스 (받는 사람 당 1 엽)의 최대 사용합니다. </li><li> 4-6받는 마우스의 최대로 성인 마우스로부터 수득 thymi 이식. 그림 1과 같이 신중하게, 성인 흉선 엽을 파악, 포셉 한 쌍을 사용하여, 수술 가위를 사용하여 세 개의 동일한 부분으로 흉선을 잘라. </li><li> 반복 각 기증자 마우스 1.3-1.4 단계를 반복합니다. thymi 노출 시간을 제한하기 위해, 한 번에 한 도너 흉선을 준비한다. </li></ol> 신장 캡슐에서 2 흉선 이식 <ol><li> 표 1에 예비 살균 장치를 조립한다. 적절한 무균기술은 오염 된 도구 나 시약에 이식받는 사람에게 노출되지 않도록하는 절차의 과정에서 활용되어야한다. </li><li> 이전 이식에, 무게 및 각받는 사람 마우스를 태그. </li><li> 층류 후드의 해부 현미경 및 마취 회로를 설정합니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여 수신자 마우스의 좌측 면도와 털이 절개하는데 사용 지역 주위에 남아 있도록. </li><li> 이소 플루오 란 기화기의 전원을 켜고 1 ~ 2 % 사이의 복용량을 사용하여 마우스를 마취. 이전 발가락 핀치 다음 반사의 부재를 확인하여 수술 절차를 시작하기에 적절한 마취를 확인. </li><li> 마우스가 제대로 마취 후, 건조를 방지하고, 다음과 같이 이식 마우스를 준비하고, 마우스 눈 연고 수의학 적용 </li><li> 면도면이 위를 향하도록 오른쪽 측면 누운 위치에 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다. StartiNG 외과 영역의 중심에서, 포비돈 요오드 (betadine) 뒤에 전송 일회용 피펫 70 % 에탄올을 사용하여 원을 그리 분배. 절개를 만들기 위해 3 시간 전에 에탄올 / betadine 처리를 반복합니다. </li><li> 사용 해부 가위 직접 신장보다 1-2cm의 측면 절개를합니다. </li><li> 신장에 인접하여 결합 조직을 파악하고 근육 위에 놓 이도록 부드럽게 신장을 들어 올려 매체 집게를 사용. 근육을 통해 노출 된 신장과 장소에 유지하려면, 신장 장골을 방해하지 않도록 특별한주의를 기울이고, 신장 아래 매체 집게의 한 팔을 삽입합니다. </li><li> 조직의 탈수를 방지하기 위해, 신장과 신장 캡슐의 조작이 완료 될 때까지 각 단계 동안 멸균 1X PBS (PH 7.4)으로 신장 관개. </li><li> 미세 집게가 끼지과 신장에서 분리하는 부신에 가장 말단 신장의 가장자리 근처에 캡슐을 들어 올려 사용. </li><li> 18 게이지를 사용하여바늘은 기증자의 흉선 (그림 2A)의 준비 조각을 삽입하기에 충분히 큰 절개를합니다. 시간이 지남에 따라 그래프트의 전위를 방지하기 위해 가능한 한 작은 낭 절개를 유지 특정 확인. </li><li> 캡슐을 유지하는 것은 신장에서 멀리 당겨 동안, 캡슐 아래 이식을 삽입 가능 (그림 2B)로 피막 절개에서까지 앞으로 흉선을 밀어 미세 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다. </li><li> 신장 아래에서 집게를 제거하고 부드럽게 절개를 통해 장소에 다시 신장을 반환합니다. </li><li> 복막 벽을 봉합 한 번 폐쇄 betadine을 적용하여 근육을 닫습니다. 봉합이 완료되면, 진피를 닫고 주변부 betadine을 적용 창상 클립을 적용한다. </li><li> 열 램프를 사용하여 예열 된 케이지에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> 이 전체 의식과 이동성을 회복 할 때까지 각각의 수술 후 마우스를 모니터와 마우스 그쪽을 배치하지 마십시오(T)는 다른 동물과 케이지에 마취를 다음 회복하지 않았습니다. </li><li> 필요에 따라 수술 후 통증 관리의 약물과 쥐를 치료​​. 예컨대 1.6 mg / ml의 농도로 식수 아세트 아미노펜 등의 수술후 진통제와 마우스를 제공한다. </li><li> 반복 각받는 사람 마우스 2.3-2.9 단계를 반복합니다. </li><li> 1 시간 수술 후 내에서 정상적인 활동에 그 마우스 수익을 확인합니다. 이식 절차의 결과로서 발생하는 합병증을 결정 수술후 중량, 운동 능력뿐만 아니라, 각 마우스의 음주와 급전 활동을 모니터. 주 : 수술 전 중량뿐만 아니라, 이동도 변경 또는 먹는 음료 또는 합병증을 나타낼 수 실패에 비해 수술 후 체중 감소. </li><li> 꼬리 닉 제조업체의 사양에 따라 Lympholyte 세포 분리 미디어를 사용하여 림프구를 분리 한 다음을 통해 마우스를 출혈에 의해 말초 혈액에서 T 세포 재구성을 모니터링합니다. T 세포 characteriza 달성이러한 형광 활성화 숙신 이미 딜 에스테르 (8)과 같은 T 세포 마커 CD3, CD4, CD8 및뿐만 아니라 라이브 죽은 판별에 대한 특정 형광 복합 항체와 림프구를 염색하여 기. 도 3에 도시 된 바와 같이 분석 단봉, 생균 및 CD3 양성 세포상의 게이팅을 통해 달성 될 수있다. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests to disclose.

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge syndrome, characterized by thymic hypoplasia or thymic aplasia9-10. Thymus transplantation, like most organ transplantation, is not free of complications, which are mostly due to transplant tolerance-related complications12 and development of autoimmune pathologies11. These issues, coupled with the need to better understand and characterize mechanisms involved in thymocyte tolerance induction led to the development of this method. The protocol described herein experimentally models thymic transplantation and demonstrates that efficient T cell reconstitution is obtained in recipients.
There are several key points to note in the protocol. It is necessary to be adept at surgery and aseptic technique prior to performing the transplantation surgery. Adherence to this will help minimize trauma, the time the mouse is anesthetized, and recovery time so that 100% post-surgery survival rate can be readily obtained. When preparing the donor thymus, it is imperative that the organ is kept on wet ice to minimize cell death. In addition the thymic lobes need to be cut to appropriate sized fragments to permit implantation without tearing the kidney capsule. Similarly, care is required to prevent any injury to the kidney upon making the incision of the renal capsule. Placement of the thymic graft underneath the kidney capsule is another important step in the process. Injury to the kidney or tearing of the renal capsule can be avoided with gentle handling, using appropriate fine-tipped surgical tools, and sufficient practice. One possibility to note is that successful T cell engraftment may also be achieved by implanting thymic lobes at sites other than under the kidney capsule, for instance at a subcutaneous site. The kidney however provides an ideal environment to receive thymic grafts due to a high level of vascularization, which promotes both graft survival as well as efficient T cell trafficking following thymic selection.
A distinct advantage of the above thymus transplant protocol is the technical ease in determining T cell engraftment. Using flow cytometry, success of the procedure is qualitatively and quantitatively assessed by measuring the frequency of T cells in peripheral blood. In addition to observing mature T cells in the blood, T cell engraftment is detected in various lymphoid organs. The latter permits further study of the expansion, activation, and differentiation of peripheral T cells in various host genetic environments under physiological conditions. One caveat that investigators may consider when interpreting results is that following thymic engraftment into an immunodeficient recipient, newly selected T cells will undergo lymphopenic expansion in the periphery. Although this rapid expansion will not alter thymic selection events, it may lead to preferential expansion of distinct T cell subsets in peripheral tissues. 
This protocol is widely applicable for studying mechanisms regulating T cell development and homeostasis in a variety of pathologies. For example, this approach can be used to study FoxP3 regulatory T cell generation and development7,13-14, as well as T cell renewal and export from the thymus in in vivo models of persistent viral, fungal, or bacterial infection15. In summary, this article describes a method of thymus transplantation that entails minimal manipulation of donor tissue, and a high success rate once the technique has been mastered.

T는 흉선 세포 발달에 중요한 이벤트가 1을 발생하는 기관이다. 상주 흉선 세포는 T 세포 수용체 (TCR) α 및 β 유전자의 재 배열시, 흉선 (2)의 피질 및 수질 지역 lymphostromal와 항원 제시 세포 (APC)와 일련의 상호 작용을 겪는다. 흉선 양성 선별은 호스트 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 분자 2-3의 컨텍스트에서 항원 성 펩타이드를 인식 흉선 세포를 생산하기 위해 피질 흉선 상피 세포 (TEC)에 의해 매개된다. 이후 흉선 음의 선택은 수질 TEC 또는 수지상 세포 (DC) MHC 클래스 I 및 II 분자 (3)에 의해 결합 된 자기 단백질로부터 유래 된 것을 본 펩타이드와의 상호 작용에 의해 구동 자기 반응성 흉선 세포의 정화를 수반한다. 이 프로세스의 최종 결과는 광범위한 스펙트럼 응답 할 수 성숙한 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 풀의 설립이다외국 항원의 자기 단백질 4 최소한의 반응성을 전시한다. 흉선 선택 이벤트 효율 성숙 흉선, 골수 및 피질 TEC, 흉선 DC의 서브셋 조성물의 주파수 및 흉선 전구체 (3)의 소스를 포함 요인의 호스트에 의해 영향을 받는다. 특히, 비정상적인 흉선 선택은 각각 장애인 부정적 또는 긍정적 인 선택에서 발생하는자가 면역 5 또는 면역 결핍 병리,이 발생할 수 있습니다. 흉선 선택을 조절하는 분자 이벤트는, 그러나, 제대로 이해된다. 체외은 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC) 6으로 접근, 흉선 선택과 관련된 기본 이벤트를 분석하는 데 유용 할 수 있지만 완전히 진행의 역학을 요점을 되풀이하지 입증했다 생체 이벤트에서. 따라서이 흉선 이식 기반 접근법은 생체 (7)에 더 연구 흉선 세포 선택 이벤트에 설립되었다 </s&gt;까지. 이 프로토콜은 면역 결핍 SCID받는 마우스로 신생아와 성인 기증자 마우스에서 thymi 이식에 대해 설명합니다. 이 기술은 양극과 음극 흉선 선택뿐만 아니라, 개체 발생 동안 다양한 T 세포 서브 세트의 흉선 출력을 조절 메커니즘의 연구를 허용한다. 최근에,이 접근법은 흉선 선택의 효율성은 초기 자기 반응성 T 세포의 증가 된 발달 선도 마우스에서 생후 제한된다는 것을 입증하기 위해 사용하고, 외부 항원 7 감소 T 세포 레퍼토리 특정되었다.

<table><tbody><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Betadine Solution</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sutures (1.0 metric)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18&quot; (45cm)</td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td><td>Clay Adams&amp;reg; Brand</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterile, disposable</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Clone: 1452C11</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Clone: RM4-5</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Clone: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-well round botton polypropylene plates</td><td>Corning</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1.2 ml polypropylene cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylon Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Puralube Optical Ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, Sterile</td></tr></tbody></table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

흉선 선택의 효과를 조절하는 메커니즘은 잘못 정의 된 남아 있습니다. 생체가 자신과 외부 항원에 특이적인 T 세포의 발달 및 선택 분석 여기에 제시된 방법이 있습니다. 방법은 면역 결핍 SCID받는 사람에 다양한 세 생쥐에서 파생 된 흉선 이식의 이식을 수반한다. 비교적 짧은 시간 동안받는 완전히 주입 흉선 이식편 유래의 T 세포로 재구성된다. 흉선 세포 만 분리시 흉선 시드가 선택을 거쳐 성숙한 T 세포로 발달. 이와 같이, 연령 의존적 흉선 이벤트 함수로서 접목 T 세포의 특성 및 특이성의 변화가 평가 될 수있다. 전문 기술이 성공적 흉선 이식 필요하지만,이 방법은 생체 내 비정상적 흉선 기능 및 / 또는 homeostas의 결과로 인한 또는 병리 광범위한 연구하는 독특한 전략을 제공한다이다.

이 절차의 성공은 최소의 외상 수술뿐만 아니라, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 정확한 위치에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이 흉선 그래프트 적절히 확보 후속 이식 흉선 섹션 크기로 절단되어야한다.도 1의 개략도에 따라, 신생아 나 성체 생쥐 thymi 일관되고 재현 T 세포의 생착 결과 성공적인 피막 하 이식에 사용될 수있다. 언급 한 바와 같이, 신장 캡슐 밑에 그래프트의 적절한 위치 설정은 이식 장기 생존, 기능 및 혈관 형성을 유지하는데 중요하다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 흉선 이식은 신장, 캡슐 절개의 반대쪽에, 부신 (신장의 앞쪽)에 가장 가까운 (신장의 후방) 꼭대기에 배치해야합니다. 성공적인 흉선 이식 적절한 조혈 환경과 결합 할 때, 수, R30주 7 초과 생산이 메인. 이식 후, 생착 말초 혈액으로부터 얻어진 T 세포 분석 유동 세포 측정에 의해 평가된다.도 3 및 표 2를 이식받는 6주 이식 후에서의 기관 및 말초 혈액에서 관찰되는 T 세포의 생착의 전형적인 수준을 보여준다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 이전에 신생아 및 성인 thymi의 이식에 시간이 지남에 말초 혈액에서 CD4 +와 CD8 + T 세포 재구성의 반응 속도를 보여 주었다. 간략하게, 순환 T 세포는 일주일 후 수술 내 둘레에서 관찰 될 수 있고 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 숫자는 말초 T 세포 구획 완전히 5~6주 이식 후 7에서 재구성 될 때까지 계속 증가. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52709/52709fig1.jpg" /> <strong&gt; 그림 1 :. 기증자 신생아와 성인 마우스의 흉선 로브와 섹션의 준비 기증자는 thymi 1 (NB) 일 된 4 주령 (성인)로부터 절단된다. 점선 후속 이식 한 장기 기증자로부터 섹션들의 최대 수를 제조하기위한 가이드로서 제공된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52709/52709fig2.jpg" /> 그림 2. 낭 절개 및 흉선 그래프트의 배치 위치 도너 흉선으로부터 제조 된 적절한 크기의 절 신장 (A)의 후방 단부에 신장 캡슐에 작은 절개에 의해 생성 된 피막 하 공간 내로 삽입된다. 앞쪽은 신장, 부신에 가장 가까운 (안 사진)과 캡슐 절개로부터 대향 단부에, (B)에 도시 한 바와 같이 캡슐 아래에 삽입 이식을위한 최적의 위치이다. <img alT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52709 / 52709fig3.jpg&quot;/&gt; 말초 혈액과 림프 기관에서 T 세포 재구성을 통해 성공적인 생착을 결정 그림 3. 유세포 데이터는 T 세포 재구성의 대표 NB 흉선 이식 SCID받는 6 주에게 이식 후 관찰한다. T 세포의 생착 비슷한 수준의 말초 혈액, 비장, 췌장 림프절 (PLN)에서 관찰되며, 장간막 림프절 (MLN)은 흉선 그래프트의 성공적인 이식 다음. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 미세 해부 집게 </td></tr><tr><td> 중간 해부 집게 (2) </td></tr><tr><td> 미세 해부 집게 (곡선 팁) </td></tr><tr><td> Betadine 솔루션 </td></tr><tr><td> 70 % 에탄올 </td></tr><tr><td> 18 게이지 바늘 </td></tr><tr><td> / 광원 승 해부 현미경 </td></tr><tr><td> 디sposable 전송 피펫 (2) </td></tr><tr><td> 통증 관리를위한 약물 : 아세트 아미노펜 </td></tr><tr><td> 멸균 와이프 </td></tr><tr><td> 가열 램프 </td></tr><tr><td> 전기 면도기 </td></tr><tr><td> 이소 플루 란과 이소 플루 란 기화기 </td></tr><tr><td> 봉합 (빠른 흡수, 일반 장) </td></tr><tr><td> 가위를 해부 </td></tr><tr><td> 9mm 스테인레스 스틸 상처 클립 </td></tr><tr><td> 상처 클립 제거 도구 </td></tr><tr><td> 무균 1X PBS </td></tr><tr><td> 60mm 요리 </td></tr></tbody></table> 표 1.받는 사람 마우스의 신장 캡슐 아래 흉선을 이식하는 데 필요한 자료의 수술 흉선 이식시 필요한 재료 목록. 지정된 물질의 양이 괄호 안에 표시됩니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 자는 totaCD4 T 세포의 L 번호 </td><td> CD8 T 세포의 총 개수 </td></tr><tr><td> 혈액 </td><td> 1652 세포 / υl </td><td> 351 세포 / υl </td></tr><tr><td> 비장 </td><td> 11546617 </td><td> 4203299 </td></tr><tr><td> PLN </td><td> 1241789 </td><td> 364918 </td></tr><tr><td> MLN </td><td> 2182266 </td><td> 532059 </td></tr></tbody></table> 흉선 이식받는 사람의 말초 혈액과 림프 기관에 존재하는 T 세포의 표 2. 총 수. CD4 +와 CD8 + T 기관에서 회수 된 세포의 총 숫자뿐만 아니라 신생아 흉선 이식받는 사람의 말초 혈액 육주 포스트 이식. 이 번호는 일반적으로 성공적인 신생아 및 성인 흉선 이식 수혜자에서 관찰되는 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 세포 수의 대표이다.

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Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo. 

비디오: Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

쥐의 전체 두께 피부 이식

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

마우스의 소설 미세 수술 이소성 모델, 욕실 공산권 가슴 벽, 흉선, 및 심장 이식

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

의학

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation is an important method for investigating thymic epithelial cell function and T cells maturation in vivo. Here we will describe the experimental methods used within our laboratory to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine (to deplete donor&#8217;s lymphocytes) treated embryonic thymus into the renal capsule of an athymic nude mouse. This method is both simple and efficient and does not require special skills or devices. The results obtained via this simple method showed that transplanted thymus can effectively support the recipient&#8217;s T cells production. Additionally, several key points with regards to the protocol will be further elucidated.

We provide a simple and efficient method to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine treated E18.5 thymus into the renal capsule of a nude mouse. This method should aide in the study of both thymic epithelial cells function and T cells maturation.

누드 마우스에서 2'-Deoxyguanosine 처리 된 뮤린 배아 흉골의 신장 탈모 이식

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...

흉선과 골수에서 기질 세포 분리 최적화

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

저자 스포트라이트: 단일 세포 염기서열 분석을 위한 기질 세포 분리를 사용한 조혈 연구 발전

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

요약

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흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

쥐의 전체 두께 피부 이식

마우스의 소설 미세 수술 이소성 모델, 욕실 공산권 가슴 벽, 흉선, 및 심장 이식

누드 마우스에서 2'-Deoxyguanosine 처리 된 뮤린 배아 흉골의 신장 탈모 이식

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)