Name: characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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파스퇴르 연구소, INSERM, 직원은 국립 드 공들인 ANR (그랜트 &#39;Lymphopoiesis&#39;), REVIVE 미래를위한 투자 프로그램 및 &quot;contre 르 암 라 리그&quot;에 의해 지원됩니다.

윤리 문 : 모든 실험은 프랑스 농업 장관의 승인을 파스퇴르 연구소 윤리 헌장에 따라 수행하고, 유럽 연합 (EU) 지침에 있었다. 농업의 프랑스 교육부의 인증을 작은 설치류 수술에 대한 교육과 조작은 모든 수술 개입을 수행한다. 주 : 5 단계 계획 순서를 나타내는 부록 표 1 참조. 태아의 1. 선택 <ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2의 여성, 12 여성의 CD45.1 12 C57BL / 6 CD45.1 남성 12 C57BL / 6 CD45.2 남성을 사용합니다. 남성 유전자형 중 하나와 여성을 횡단하는 것은 배아 CD45.1 / 2 및 CD45.1받는 사람 흉선 로브의 소스로 사용 TSP 또는 CD45.2의 소스로 사용 생성합니다. 하우스 개별적으로 모든 남성. </li><li> , E18 TSP 격리를위한 배아를 얻기 이십일일 이식 실험 전에 오후 6시에서 한 남성 CD45.1와 케이지 2 여성을 배치합니다. 정오 전에, 다음날 질 플러그의 존재를 확인합니다. SEPA연결 여성을 평가. </li><li> E14 배아를 얻기 위해하는 것은 TSP 식민지 될 17 일 이식 실험 전에 남성의 CD45.2를 사용하여, (1.2) 위의 절차를 반복합니다. </li><li> E13 TSP를 분리 배아를 얻기 위해 16 일 래프팅 실험 전에, 수컷 C57BL / 6 CD45.1를 사용하여, (1.2) 상기 절차를 반복한다. </li></ol> 수평 층류 후드에서 태아의 해부 (2) 참고 : 이식 실험 전에 두 일. <ol><li> 포화 밀폐 된 챔버 내에서 적어도 5 분 동안 자궁 전위에 의해 또는 CO 2 가스의 진보적 인 투여에 의해 임신 한 여성을 희생. 심장 - 호흡 운동의 결정적인 체포에 의해 죽음을 확인합니다. 70 % 에탄올로 복부 젖은. </li><li> 중간 선 복부의 피부에 세로 절개를 따로 따로 피부를 잡아 당겨 엽니 다. 소화 기관을 건드리지 않고 집게와 가위로 복막을 엽니 다. 이열 터의를 꺼냅니다우리는 가위로 질에서 분리합니다. </li><li> 40 ~ 50 ml의 DPBS를 포함하는 90 X 15mm 페트리 접시에 자궁를 놓고 각 배아의 탈락 사이에 횡 방향으로 절단. </li><li> 좋은 팁이 위의 쌍 미세 집게로, 자궁의 근육 막을 제거 태반과 난황 사이를 절단하여 배아를 꺼내와 배아를 유지하는 amnios을 제거합니다. </li><li> 페트리 접시에 배아를 배치 HBSS + 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 90 X 15mm (FCS). E15보다 배아 나이가 들어 더 해부 전에 가위로 머리를 제거합니다. </li></ol> 흉선 3. 분리 <ol><li> 양안 확대 렌즈에서 젖은 거즈 침대에 누운 위치 (복부보기)에 누워, 배아를 놓습니다. </li><li> , 길이 방향으로 흉골의 연골을 따라 집게를 삽입 끼와 흉부 그리드를 엽니 다. 곡선 집게로, T를 시각화하기 위해 옆으로 흉부 벽을 당겨기관의 각 측면에 hymic 로브. </li><li> 조심스럽게 미세 집게로 아래 곤란하여 각 로브를 개최하고 1 ml의 HBSS + 1 % FCS를 포함하는 페트리 접시에 배치합니다. 로브를 분리하고 캡슐에 손상을주지 않고, 두 1ml를 주사기 + 26 G ⅜ &quot;바늘 주위의 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 혈액 세포를 제거하기 위해 HBSS + 1 % FCS 3 ㎖에 로브를 씻는다. 참고 : E15 전에, 흉선 로브는 양방향 엽성 기관을 구성하는 중간에 기관 나중에 퓨즈의 각 측면에 있습니다. </li></ol> 4. 세포 현탁액 <ol><li> HBSS + 1 % FCS 1 ml를 주사기에 장착 된 두 개의 26 G 바늘로, 양안 확대 렌즈 아래 로브 떨어져 애타게. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터. </li></ol> 형광 항체와 세포 정렬 5. 염색 참고 : 모든 항체는 이전에 인구의 최적의 정의 (titrat를 얻기 위해 적정있다이온) 항체의 배치에 따라 달라질 수 있습니다. <ol><li> 혈통 양성 세포를 염색하는 비오틴 항체의 칵테일의 100 μL와 4 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 흉선 세포 (E13 또는 E18)을 품어 (항 CD19, 안티 GR1, 안티 Ter119, 안티 NK1.1 , 안티의 CD11c, 항 CD3, 안티 CD4, CD8 방지, 항 CD25). </li><li> 항체가 7 분 동안 280 XG에 4 ml의 HBSS + 1 % FCS와 튜브를 스핀 다운의 거리를 초과 씻어, 상층 액을 제거하고 다시 중단 신선한 HBSS + 1 % FCS의 펠렛을. 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 E18 비오틴 표지 세포를 품어 두 번 HBSS 1 % FCS에서 세포를 씻는다. 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS에 세포를 다시 일시. 대부분의 E13의 흉선 세포는 혈통 음 때문에 셀 정렬하기 전에 맥 농축이 필요하지 않습니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, LS 컬럼상에서 세포를 전달. 모든 세포 현탁액 입력하면 열은 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS를 추가한다. 복구칼럼 4 ml를 280 x g에서 7 분 동안 세포를 원심 분리를 통해 흐르게. </li><li> 다시 중단 고갈 E18 또는 TSP 항체 믹스의 50 μL (항 CD117 APC, 안티 CD135 PE, 안티 CD127 PECy7, 항 CD24 FITC, 항 CD44 APCCy7과 스트렙 타비 딘 퍼시픽 블루 총 E13의 흉선 세포 중 하나의 펠렛을 )과 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ㎖의 HBSS + 1 % FCS와 함께 세포를 씻어 1 ㎖의 HBSS에 요오드화 프로피 듐과 + 1 % FCS를 세포를 다시 일시. </li><li> 정렬의 TSP 린 - 200 μL 완전 배지 + 20 % FCS를 포함하는 1.5 ml의 튜브 상 (4 레이저와) 외과에서 CD44 + CD117 + CD24 낮은 CD127 + CD135 + 세포. 금융위원회와 SSC 채널 크기와 입도에 따라 게이트 먼저 세포. (요오드화 프로피 듐 염색) 죽은 세포, 게이트 밖으로 이중선을 제거 지수 저울에 형광 점수. 약 100 또는 600의 TSP는 하나 또는 하나 E13 E18 흉선, respectiv로부터 얻을 수있다엘리. </li></ol> 조상 6. 식민 E14의 흉선 로브 : 매달려 드롭 기술 <ol><li> (30 회색 = 30 Gy를) CD45.2 배아에서 E14 흉선 로브, 문화 전 3 시간을 조사. 참고 : E14 또는 E15 흉선 로브가 성공적으로 T 세포 전구 세포의 수신자로 사용되어왔다. 이전 임신 일에서 흉선 로브가 제대로 개발하는 동안 아마도 상피 세포의 불완전한 발달로 인해 기관의 더 큰 크기로 조기 괴사에 나중에 임신 일 결과를받는 사람 흉선 로브를 사용. </li><li> 원심 분리기의 TSP 재 일시 세포 배양 배지 (10 % FCS와 OPTI-MEM 완전 배지, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 2β 머 캅토 에탄올 (50 μM))를 정렬되도록 35 μL 500 TSP가 포함되어 있습니다. </li><li> 60 잘 테라 사키 판의 다른 모든 잘 세포 현탁액의 35 μL 드롭 놓습니다. 주 :이 연속 우물에 배치하는 경우 35 μL 방울을 융합 할 수 있습니다. </li><li> 각 방울의 표면에 하나 조사 로브를 놓습니다. 테라 사키 판을 닫고 세포가 중력에 의해 드롭의 혀끝 극에 도달 할 수 있도록 거꾸로 판을 켭니다. </li><li> 히트 부드럽게 반전 플레이트의 상부는 드롭의 혀끝의 가장자리로 밀어 로브를 강제로. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 반전 테라 사키 판을 품어. 받는 사람 성인 마우스 (8)의 신장 캡슐에서 식민지, 중 문화 E14의 FTOC 7 thymi, 또는 이식 후. </li></ol> 7. 태아 흉선 장기 문화 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 전체 매체의 3 ㎖를 놓습니다. 매체에 떠있는 isopore 멤브레인 필터를 놓습니다. 포셉 (한 막에 이하 8 로브)와 멤브레인의 가장자리에 재구성 로브를 놓습니다. </li><li> 식 수용 2 ㎖를 포함, 커버없이, 35mm 요리와 함께, 90mm 페트리 접시 안에 흉선 로브를 포함하는 배양 접시를 놓습니다R, 최적의 습도를 보장합니다. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 십이일 품어. </li></ol> 무균 조건에서 신장 캡슐에서 8 이식 참고 : 신장 실질이 캡슐을 형성하는 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다. 서브 캡슐 지역은 피함으로써 이식의 개발을위한 적합한 환경 (예 흉선 로브, 췌장 또는 신생아의 마음)을 제공하는 림프 혈관에 특히 풍부하다. 이 오른쪽 신장보다 더 접근하기 때문에 이식은 일반적으로 왼쪽 신장에서 수행된다. CD3 - / - 생쥐 수컷 E15 전에 성 결정이 용이하지 않기 때문에 수신자가 이에 의한 Y 염색체에 링크 부 조직 적합성 항원 이식편 대 숙주 반응을 피하기로 하였다. <ol><li> 기구를 소독하고 수술에 따른 멸균 장갑을 착용하십시오. 케타민 10 ㎎ / ㎖ + 크 실라 1의 Mg 용액의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 /ml의 PBS 중에 희석 (10 g의 체중 당 50 내지 100 μL), 1 mL를 주사기를 사용. 인터 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수력 Optimune 젤 한 방울을 놓습니다. 참고 :이 솔루션은 즉흥적 준비하고 주입하기 전에 실온에서 예열한다. 마취는 적어도 20 분 동안 지속됩니다. 마취의 정도는 모든 수술 따라 조절되어야한다. 마취는 매 20 분 투여 량의 절반 복강 내 주사에 의해 연장 될 수있다. </li><li> 수평 얇은 흐름 후드 아래, 우측에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올 및 10 % 요오드 용액으로 피부에 관한 수술 부위를 소독. 집게 부분으로 바로 뒷다리의 관절 위 2cm의 길이를 따라 마우스 머리. 수술 영역을 면도. </li><li> 메스와 가위가 근육 조직을 절단 한 다음에, 첫 번째, 피부 조직의 절개 1.5 cm 길이를 확인합니다. 절개의 양쪽에 약간의 압력을가, 복강에서 신장을 강제 것이다. </li><li> 촉촉한 신장을 유지하는면 버드와 식염수를 적용합니다. 당신이 장기 노출에 어려움이있는 경우, 신장이 부착 된 주변의 지방 세포 조직을 꺼내 평평한 집게를 사용합니다. 기관 아래에 배치 면봉에 의해 복막 캐비티 중 신장을 유지한다. </li><li> 이 미세 집게로, (출혈을 방지하기 위해 실질에 손이 닿지 않도록) 캡슐에서 2~3mm의 구멍을. 전체 수술 중 지속적으로 적신 노출 신장 캡슐을 유지합니다. </li><li> 연 캡슐의 벽을 유지함으로써, 신장 캡슐에서 조심스럽게 로브를 삽입하고 가장자리 극으로 캡슐에서 이식을 밀어 넣습니다. 신장 당 6 로브까지 놓습니다. </li><li> 역 복강의 신장을 교체합니다. 근육 aponeuroses, 개별 외과 매듭 후 피부를 봉합. 10 % 포비돈 요오드 용액으로 상처 젖은. 가열 된 PA에 마우스를 놓습니다37 ° C에서 D. </li><li> 심장, 호흡과 수염 운동, 자기가 볼 총 복구 움직임을 포함 할 때까지 점막 색상의 제어에 의해 마취에서 완전히 회복 될 때까지 이식 한 마우스를 조사. 참고 : 우리는 단지 수술 후 진통제 솔루션 (Buprenorphin, 0.1 ㎎ / ㎏) 내 근육 주사를 추천 2 일 수술 후 통증을 방지하기 위해 수술을 다음과 같습니다. </li><li> 완전히 회복 될 때까지 격리에서 운영하는 동물을 유지합니다. 확인하고 감염을 방지하기 위해 매일에게 상처의 바늘을 검사합니다. 이 절차에 따라 창상 감염을 관찰하지 마십시오. 참고 : CD3에서 말초 혈액 세포의 주간 분석 - / - 이식 생쥐 우리가 파생 인구가 CD45 allotypic 마커 및 T 세포 계보 특이 항체 (그림 3)를 사용하여 E13 또는 E18 전구 세포 하나에서 유래 흉선을 감지 할 수 있습니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 TSP의 자손 9. 분석 <ol><l난&gt; 단일 세포 현탁액을 (프로토콜 (4) 참조) 얻기 위해 개별적으로 FTOCs을 애무 해줘. </li><li> 항체 혼합물 CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 퍼시픽 블루, Vγ5 FITC, Vδ1 체육을 인식하는 항체를 포함하고 제 5 절에 설명 된대로 품어 개별 로브에서 얼룩 세포 현탁액. </li><li> HBSS에 + 1 % FCS + 프로피 디움 요오드화물을 세포를 다시 중단하고 (그림 2의 결과를 참조) 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

두 가지 주요 분석은 T 세포의 생체 외 분화를 분석하는데 사용될 수있다. 가장 최근에보고 된 1 또는 4 내지 12 등 Noth1의 리간드, 델타 표현 BM 간질 세포 OP9 조혈 전구 세포의 공 배양된다.이 2-D 분석은에서 분석을 가능하게 고효율 민감한 수행하기 쉬운 단일 세포 수준. 그러나, 어느 쪽도 흉선 상피 세포와 직접 상호 작용을 필요로 둘 (DP)의 무대도 γδ DETC (13)의 생성, 이후 T...

T 림프구는 αβ 또는 γδ T 세포 수용체 (TCR)를 담지, 전문 기관에서 흉선 차별화. 완전히 개발 흉선은 두 가지 영역으로 구성되어 생산적 TCR의 β와 α 체인 유전자를 재 배열 흉선 세포가 프로그램의 죽음 (긍정적 인 선택으로 알려져있는 과정)에서 구출되는 흉선 조상 개발 피질, 그리고; 자기 리간드에 너무 강한 반응성과 흉선 세포를 선택한 수질은 (음 선택) 1, 2 삭제됩니다. 흉선 나중에 간엽 세포 (3)에 의해 둘러싸여 제 인두 파우치 내배엽 층에서 유래. 그것은 그 후, 연속 채용 정상 T 세포의 발달을 위해 요구되는 4 배아 일 E12과, 기점 조혈 전구 세포 식민지된다. 흉선 이민자들은 긴밀하게 규제 프로그램, 시작과 마이에 의해 조율 된, 연속적인 발달 단계를 통해 진화4처럼 그 리간드와의 상호 작용에 따라 흉선 세포의 노치 신호 전달 경로의 활성화, 델타에 의해 ntained, 흉선 상피 세포 (TEC는)에 표현 된 5. 흉선 세포 개발은 소위 CD4 시작 - CD8 - 더블 네거티브 (DN) 단계. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) 및 DN4 (CD25 - CD44 -) - DN의 흉선 세포는 더 DN1 (CD44 + CD25)에 CD25 및 CD44의 발현에 따라 세분화 될 수있다. CD24 (HSA)와 CD117 (C-kit)은 더 DN1a와 b는 초기 흉선 전구 세포 (ETP)에 해당하는 5 부분 집합에 DN1 함을 세분화. 흉선 세포는 DN 단계에서 TCR δ, β와 α 사슬을 재 배열 및 사전 TCR 선택 (DN3-DN4 단계)를 거쳐. TCR (α) 체인은 긍정과 부정 실리 이전에 재 배열 CD4 + CD8 + 더블 긍정적 인 (DP) 구획에 그들은 더 통과ction의. 이 단계에서 가장 흉선이 제거되고, 단지 작은 백분율 (3~5%)는 ​​CD4 + 또는 CD8 + 도달가 T 세포를 격실 성숙. 림프 분화 경로는 다 능성 전구 세포 (MPP) 및 적혈구와 거핵 세포 6 잠재력을 잃어 림프-준비하는 다 능성 전구 세포 (LMPP)를 생성 조혈 모세포의 단계를 통해 진행한다. , 형 c-Kit (CD117)의 발현, 무서-1 및 FLT3 / Flk2 (CD135) 및 인터루킨의 검출 가능한 수준의 부재 (- LMPP는 표현형 (리니지 부정적인 린) 분화 혈액 세포 마커의 부재에 의해 정의 된 IL) -7 체인 α 수용체 (IL-7rα 또는 CD127). LMPPs 더욱 그 단계에서 골수 세포를 생성하는 능력을 상실했다고 공통 림프구 전구 세포 (CLP) 7로 분화. CLP는 림프구 (B와 T 세포), NK 세포, DC 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 잠재력을 유지하고, CD1의 발현에 의해 LMPP 다를27 무서-1의 높은 수준의 부재. 흉선 정착 선조 (TSP)의 특성은 광범위 8 논의되었지만, 최근에 개발 된 것은 분명 9 TSP 걸쳐 변화 표현형 분화 잠재력과 기능은. 우리는 E13 (제 1 파) 또는 E18 (초 파) 중 하나에서 정렬 외과 세포에 의해 격리 TSP를 특성화하기 위해 생체 외 및 생체 내 분석을 수행. 동일 E13 및 E18 전구 세포의 수, 다른 allotypic 마커가 부착 된 식민지 유사한 개발 환경에서 그들의 자손 다음 허용 조상의 두 가지 유형의 사이에 다른 세포 고유 특성을 밝혀 조사 흉선 로브와 태아 흉선 기관 배양 (FTOC). E13 또는 E18 TSP 중 하나의 식민지 흉선 로브 인해 두 전구 세포 사이의 경쟁으로 선택하지 않고 개발을 허용했다. 식민지 흉선 로브의 생체 내 이식 더 보여 주었다 또한 T그는 E13의 성숙 자손과 E18 TSP는 생체 내에서 서로 다른 생물학적 특성을 갖는다. 제 웨이브에서 TSP를 빠르게 T 세포를 생성하고 있지만, αβ γδ T 세포의 낮은 숫자 일으킨다. 후자 중 우리는 불변 TCR, 그들은 상처 치유의 기능을 발휘하고 만 배아 발달 10시에 발생하는 표피로 마이그레이션이 Vγ5Vδ1 수지상 상피 T 세포 (DETC)를 발견했습니다. 대조적으로, TSP는 제 웨이브에서 TCR + T 세포의 높은 번호를 생성하는 시간이 오래 걸릴 DETC를 생성 할 수 없습니다.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>26 G &amp;frac38;&quot; 0.45 x 10 mm syringes with needles</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspension</td></tr><tr><td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration of cells</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Iodide Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Ketamine 100 mg/ml (stock solution)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthesic and muscle relaxant</td></tr><tr><td>Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morphinic analgesic</td></tr><tr><td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Eye protection</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>to isolate embryos</td></tr><tr><td>HBSS Hanks&#039; Balanced Salt Solution (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>to wash out the blood and dissect the embryos</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium for cultures</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>Penicilin and streptomycin</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotics for cultures</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Cold lamp source</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Two goose neck fibers adapted</td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissecting Pad</td></tr><tr><td>Spoon, round and perforated</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Fine iris scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>2 pairs of fine straight watchmakers&amp;rsquo; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Needle-holder</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td></tr><tr><td>Membrane Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>For FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 wells plates</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>For hanging drop technique</td></tr><tr><td>Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>To apply disinfecting solution</td></tr><tr><td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td><td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&amp;nbsp;</td><td>Clone Number see table below</td><td>Staining cells</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Cell depletion</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&amp;nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>Source of cells and thymic lobes</td></tr><tr><td>Mice</td><td>CDTA Orl&amp;eacute;ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Grafting experiment</td></tr></tbody></table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

흉선 정착 전구 세포를 특성화하는 lymphopenic 환자에서 T 세포의 교체를위한 전략을 고안하는 것이 필수적, T 세포의 발달 단계 전 흉선을 이해하는 것이 중요하다. 우리는 체외에서 보완이에 의해 쥐의 배아 일 13, 18 thymi에서 전구 세포를 정착 흉선을 공부하고 생체 기술에 모두 &quot;매달려 드롭&quot;방법에 따라. 이 방법은 E13 및 / 또는 E18 그들의 자손 다음 따라서 CD45 allotypic 마커에 의해 구별 흉선 조상을 조사 태아 흉선 로브를 식민지화 허용했다. 인구 중 하나와 식민지가 가능한 경쟁력있는 선택적 압력을 제거하는 동안 혼합 인구 식민는 전구 세포의 생물학적 특성 세포 자치 차이를 분석하는 허용한다. 식민 흉선 로브는 또한 t의 인구 역학 생체 내 성숙 된 T 세포의 자손의 수 분석 면역 결핍받는 수컷 마우스에 이식 할 수있다그는 면역 체계와 다른 조직과 장기의 식민지를 주변. 태아 흉선 기관 배양 E13 전구 세포 모두에 빠른 속도로 개발 CD3 + 세포를 성숙 것으로 나타났다 및 수지상 상피 T 세포로 알려진 표준 γδ T 세포 하위 집합에 상승했다. 이에 비해, E18 전구 세포는 분화가 지연 및 수지상 상피 성 T 세포를 생성 할 수 없었다. - / - 흉선 이식 CD3의 말초 혈액의 모니터링 마우스는 더 E18의 흉선 정착 전구 세포는, 시간에 따라, 단기적 태아 흉선에서 감상 할 수없는 기능을 자신의 E13에 비해 성숙한 T 세포의 큰 번호를 생성하는 것으로 나타났다 기관 배양.

식민지화 선조의 가장 개발을 허용 내인성 흉선 세포의 흉선 로브를 고갈시키는 방법을 선택하기 위해, 우리는 방사선 조사 후 식민 흉선 로브에서 T 세포 재구성의 수준 또는 5 일 데 옥시 구아노 신 (D-GUA) 치료를 비교 하​​였다. 결과 배양 9 일째에 아무런 차이가 없을 때, 방사 로브 따라서 일 12시, 조사 후 T 세포의 발달을 얻었다 D-구아 처리보다 더 바람직하고, 또한 D-구아 처리보다 더 T 세포...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K 조회수.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

연구

발생학

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

생물학

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

면역학 및 감염병학

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

암 연구학

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC 유래 오가노이드를 이용한 흉선 미세환경 재현

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 인간 흉선 오가노이드를 활용한 흉선 상피세포 및 T세포 연구의 발전

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

요약

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수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

T 세포의 유도

분리 및 다른 세 쥐 흉선 이식의 이식.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성