Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

The authors have no competing financial interests.

설명 된 프로토콜은 뮤린 골수 유래 대 식세포를 분리 T. 순방향 유전학의 활성화를 사용하여 비 편파 접근법을 제공 자신의 능력에 결함이와 포자충 돌연변이 감염된 대 식세포의 활성화를 생존. 돌연변이 다음 식세포 활성화의 표현형은 일반적으로 두 가지 범주 중 하나에 해당 : 1) 기생충은 그대로 나타나지만 PV 당 1 기생을 넘어 복제하는 데 실패; 2) 기생충이 저하 될 넓고, 비정질 PV가 될 수 있습니다. 돌연변이 활성의 부재하에 나이브 식세포에서 야생형 표현형 기생충 등을 가지고 있다는 사실은 프로토콜과 특이 식세포 활성화를 저항하는 능력을 손상되어 돌연변이를 식별 할 수 증명한다. 일차 골수 유래 대 식세포의 사용은 화면 RAW 264.7 대식 세포주 대 권장 때문에 VACU 당 기생충 및 기생충 수의 모폴로지OLE보다 쉽게​​ 골수 유래 대 식세포에서 시각화 하였다. 앞으로 유전학과 결합 된 설명 화면이 기생충 유전자와 세포 자율 면역의 특정 매개 물질에 대한 저항성에 중요한 궁극적으로 유전자 경로를 해부 할 수있는 다양한 도구를 제공합니다. 이들 전망 적 유전학 연구는 생체 외 및 발병 기전 동안 모두 특정 항균 매개체 저항에 중요한 기생충 경로를 푸는 시작하는 문자열처럼 올 수 있습니다 기생충 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 앞으로 유전 적 접근과 이전의 어려움은 각각의 돌연변이에 중단 키 유전자의 식별했다. T.에서 코스 미드 라이브러리 보완 포자충은 세포 분열 돌연변이의 기능 보완을위한 매우 효과적이었다. 그러나, 야생형 기생충의 복제는 단지 변이체보다 적은 범위에 대한 IFN-γ와 LPS에 의해 억제된다는 사실은, 기능적 보완 그쪽을 더 어렵게 만든다세포 분열 돌연변이에 대한 명. T.에서 화학에서 삽입 돌연변이 체 모두에 대한 전체 게놈 돌연변이 프로파일 포자충은 최근 생산으로 등장, 심지어 앞으로 유전학 화면 34,36,37,44에서 돌연변이의 표현형에 책임이있는 유전자를 식별하는 효과적인 수단을 요하고있다. 따라서, 차세대 시퀀싱을 이용하여 전체 게놈 돌연변이 파일링 T. 돌연변이 유발 화학 물질의 사용 가능성을 향상 시켰 앞으로 유전 연구에 포자충은 특정 기능에 중요한 유전자를 식별합니다. 현재의 프로토콜에 기술 된 바와 같은 순방향 유전학 방법은 T.의 게놈으로 가장 중요 포자충 면역 회피 중요한 기생충 후보 유전자의 동정에 도움이있는 다른 유전자 또는 기능적 도메인에는 상 동성을 갖지 않는 예측 된 유전자의 대부분이 가설 남아있다. 96 웰 플레이트의 IFA 분석은 일반적으로 만난 높은 처리량 검사로 간주되지 않습니다HOD. 한 사람이 하루에 10 96 웰 플레이트 또는 약 960 돌연변이 얼룩 및 화면에 대한 우리의 경험에서 그것은 합리적이다. Skariah 등.에 의한 논문에서는 약 8,000 돌연변이를 분석 하였다 14 독립적 인 돌연변이가 크게 활성화하지만 순진한 대 식세포 (28)의 생존 / 복제를 손상했다가 분리되었다. 돌연변이의 장애인 생존은 주로 산화 질소에 대한 감수성을 증가의 결과였다. 전체 방법의 제한은 주로 기생충의 단일 클론를 얻기보다는 96 웰 플레이트의 초기 화면이 질적, 합리적으로 빠른 같이 현미경으로 심사의 수준에있다. 96 웰 플레이트의 화면에서 확인 된 돌연변이의 표현형의 확인은 챔버 슬라이드에서 대 식세포를 사용하여 정성 및 정량 분석​​에 의한 3 단계에서 야생 타입 또는 돌연변이 기생충 같은 수를 추가하여 추적한다. 다른 분석 스크리닝 방법의 사용이러한 기생충 총인구 수준으로 형광 측정 대신 현미경에 의해 평가로서 개별 기생충 레벨보다 저하 된만큼의 기생충은 T. 대한 폴리 클로 날 항체로 염색 현재 프로토콜의 문제가있다 포자충으로 견고과 돌연변이가 fluoresence 강도의 수준에서 정량보다 질적 인 차이와 야생 형 기생충. 또한, IFN-γ 및 이후 시점에서이기는 야생형 기생충 억제 복제에 감염된 결과 대 식세포의 활성화에 저항 결손 돌연변이 체를 분리하기 위해 요구되는 LPS의 투여. 따라서, 발광 기생충의 사용을 포함하는 순방향 유전학 화면 전체 기생충 수의 측정에 문제가된다. 그러나, 화학적 또는 삽입 성 돌연변이 유발에 사용 기생충 부모 클론 구성 적 또는 유도 성 또는 형광을 발현하는 경우 루시퍼 염색 프로토콜 스크리닝 단계에서 제거 될 수있다ASE 마커. 96 웰 플레이트에서 식세포 IFA 및 현미경 검사를 사용하여 설명한 프로토콜은 활성화 된 대 식세포에서 생존 / 복제 결함이있는 돌연변이 체의 분리를 허용하지만, 또한 명확 달성 96- 웰 플레이트 포맷을 사용하여 한정된 미세한 해상도로 인해 약간의 전위 돌연변이 그리워 이 해상도에서 기생충 항원 얼룩 비정질 부어 공포는 정상 PV 내에서 건강한 복제 기생충으로 착각 할 수있다. 96 잘 커버 유리 기판 대신 광학 표면과 96 웰 플레이트의 교체는, 96 웰 플레이트에 감염된 대 식세포의 화면 동안 높은 해상도를 달성 할 가능성이있다. 기생충 내습 다음 식세포를 활성화 기재된 프로토콜에서 IFN-γ와 LPS를 사용하여 식별 돌연변이의 대부분은 산화 질소 (28)로부터 자신을 보호 할 수있는 능력에 결함이있다. 이와 관련하여, 화면이 바이어 싱되지 않은 것으로 의도되지만,활성화 조건, 종류와 대 식세포의 종과 화면을 위해 선택되어 대 식세포 활성화에 기생충 침략의 타이밍에 따라 특정 항균 매개체에 대한 감수성을 증가와 기생충 돌연변이 체의 분리를 위해 풍부하게 할 수 있습니다. 따라서 화면인가 자극 활성을 위해 선택 선천성 면역 세포가 생성 된 돌연변이 기생충 감염 될 가능성이되는 미생물의 종류 매개체 영향 중요한 파라미터이다. 기생충의 유전자형은 유형 II 및 III 유전자형이 26,45,46 더 민감하는 동안 기생충의 유전자형은 IFN-γ를 응답으로 유도 된 면역 관련 GTP 아제 (IRGs)에 상대적으로 저항하는 유형 등이 중요한 매개 변수입니다. 설명 프로토콜에서 대 식세포는 기생충 침입 한 후에 활성화됩니다. 타입 II 유전자형 있지만, 설명에 사용 된 스크린 Prugnaud 균주, 면역 관련 GTP 아제의 작용에 영향을 받기 쉽다,기생충이 대 식세포를 침공 llowing 먼저 IRGs의 전체 유도 전에 야생 형 기생충의 복제를 할 수 있습니다. 또한, IRGs들이 침윤 및 복제 개시 기생충 이후 대 식세포에서 유도하는 경우 기생충에 대해 효과적인 것이 명확하지 않다. 설명 프로토콜은-IFN-γ 의존성 세포 자율 면역, 특히 산화 질소의 매개하는 저항에 중요한 기생충 유전자를 식별하는 대 식세포를 사용합니다. 산화 질소에 표시된 감수성뿐만 아니라 산화 질소에 의존하는 미토콘드리아 분열의 공유 표현형을 공유 기생충 돌연변이의 풀 (pool)의 분리는 산화 질소와 이해 기생충 유전자와 저항에 중요한 경로를 식별하기 위해 고유 한 도구 세트를 제공합니다 T. 대해보다 광범위 산화 질소의 작용 포자충과 약간의 수정과 다른 진핵 pathogens.The 설명 프로토콜은 앞으로 유전학 STUDIE 사용할 수 있습니다의 세포 자율 면역의 다른 매개체에 대한 저항에 중요한 기생충 유전자를 식별합니다. 변형은 잠재적 침입을 기생충에 감염된 숙주 세포의 유형, 활성 자극하거나 활성화의 타이밍을 변경 포함한다. 예를 들어, 기생충 또한 전에 IFN-γ와 쥐의 대 식세포의 사전 활성화는 면역 관련 GTP 아제의 활성화 될 것입니다. T. 그러한 모델 타입 기생충 유전자를 동정하기 위해 사용될 수 유전자형 I 포자충은 면역 관련 GTP 아제 (24, 25)에 ROP18과 ROP5에 의해 매개 저항에 기여할 수. T.에 대한 세포 자율 면역의 중재자 인간의 선천성 면역 세포에서 포자충은 물론 설치류로 정의되지 않습니다. 따라서, 인간 말초 혈액 단핵 세포의 사용은 T. 화학적 돌연변이 화면까지 포자충은 선천성 면역 세포에서 인간의 감염뿐만 아니라 FO 인간의 중요한 메커니즘 중 생존을위한 중요한 모두 기생충 유전자를 식별 할 수T.에 R 항생제 내성 포자충. 반응성 질소 또는 산소 종과 같은 약리학 적 제제에 감염된 숙주 세포의 노출을 생존 할 수없는 돌연변이를 단리에 의해 식별 될 수있는 특정 항생제에 대한 내성을위한 매개체 중요한 기생충 유전자. 마찬가지로 프로토콜은 활성화 또는 47-49 식세포 퓨린 수용체 (50)의 자극을 ATP inflammasome을 증가 감수성 돌연변이 기생충을 분리하도록 변형 될 수있다. 종합적으로, 프로토콜 T. 중요한 기생충 돌연변이를 분리 순방향 유전 선천성 면역 세포를 이용한 방법을 설명 포자충 저항은 IFN-γ에 의존하는 세포 자율 면역. 중요한 것은, 접근 방식은 내다 것은 다목적 용이 숙주 세포 또는 조건이 encounte을 강조하는 저항의 특정 유형의 특정 항균 매개체, 기생충 생존을 회피 중요한 기생충 유전자를 분리하기 위해 수정 될 수 있습니다톡소 플라즈마 증 동안 빨간색. 더욱이, 많은 경우에 숙주 세포의 활성화를위한 중요한 기생 저항 유전자는 또한 생체 내에서 감염 동안 낭종 생산에 직접 또는 간접으로 역할을 할 수있다.

톡소 포자충 (T. 포자충)는 의무적 인 세포, 원 충성 병원체이다. 이 톡소 플라즈마 증의 원인균, 면역 개인의 건강 위험이 있습니다. 또한 포자충과 원 포자충 속을 포함하여 인간을 감염 다른 apicomplexan 병원균의 모델 시스템입니다. 톡소 플라즈마 증은 가장 일반적으로 기생충의 bradyzoite 또는 oocyst 단계에 오염 된 음식이나 물을 섭취을 통해 획득된다. 섭취시,이 단계는 숙주 세포 내에서 복제하고 체계적으로 유포 기생충의 tachyzoite 단계로 변환합니다. T 세포, IFN-γ와, 낮은 정도, 산화 질소 1-4, 감염의 조절에 중요하지만 tachyzoites의 비율로, 병을 제거 할 수없는 조직 포낭 내에서 보호된다 bradyzoite 스테이지로 변환 수명이 긴 만성 감염의 결과. 사실, 어떤 치료제는 만성 낭종의에 효과가없는질병의 다케. 심한 톡소 플라즈마 증은 기본 및 급성 감염의 신속 복제 tachyzoite 단계 특성으로 다시 변환 기생충의 bradyzoite 단계로 인해 지속적인 감염의 재 활성화에 가장 많다. 선천성 면역 반응의면에서 이른 생존 기생충 충분한 기생충 번호에 도달 할뿐만 아니라 만성 감염의 확립을 가능하게하기 위해, 말초 부위에 도달 할 수 있도록하는 것이 중요하다. T. 포자충 가능성 복제 및 감염의 조기 보급 할 수있는 능력에 기여하는 숙주 방어 메커니즘을 방해하는 전략을 진화했다. 첫째, T. 포자충 다른 세포 내 병원체에 비해 5-9 숙주 세포 내 이입 및 exocytic 프로세스와 크게 편석 기생충 침윤 동안 고유 PV를 형성한다. 또한, 모든 성공적인 세포 내 병원균의 T. 같은 포자충은 f를 허용 환경을 조성하기 위해 숙주 세포를 수정또는 성장. 이것은 세포 활성화 10-15 조절에 중요 포함한 숙주 세포 전사 인자를 변경하여 재 프로그래밍 숙주 세포의 유전자 발현을 포함한다. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21, 22는 모두 GRA24 T. 감염된 숙주 세포를 전사 캐스케이드 반응을 조절하고 세포 시그널링에 중요한 것으로 밝혀졌다 포자충. 별개의 표현형과 기생충 변종 사이의 유전 십자가를 사용하여 최근의 연구는 면역 관련 GTP 아제 (IRGs) 16,19,23-26의 회피를 포함하여 기생충 유전자형에 의존하는 특성을 기초 기생충 유전자를 식별하는 매우 생산되고있다. 매우 독성이 강한 유형 I 유전자형이 쥐 IRGs을 회피 메커니즘을 진화하는 동안 마우스에 면역 관련 GTP 아제 (IRGs)는 유형 II의 제어 및 기생충의 III 유전자형을 위해 중요하다. 그러나, 기생충 항균 미디어를 회피하는 메커니즘을 진화 한 것이 분명하다이러한 메커니즘의 일부 IRGs과 그 외에 TORS는 기생충 유전자형 (27, 28)에 걸쳐 보존 할 수있다. 또한, 약간은 T.에 대한 세포 자율 면역의 중요한 매개체에 대해 알려진 인간의 톡소 플라즈마 증 동안 포자충. tachyzoite 또한 호스트 면역 반응에 의해 유발 될 수있는 변환을 bradyzoite하는 동안 셀 자율 면역 매개 물질에 대한 저항성에 중요한 기생충 유전자는 생존을 위해 중요 할 수있다. 예를 들어, 높은 수준의 질소 산화물이 감염된 대 식세포 기생충 복제를 억제 할뿐만 아니라 생산 낭종 30-32 변환을 초래하는 bradyzoite tachyzoite을 자극 할 수있다. ToxoDB는 T.위한 기능 게놈 데이터베이스입니다 포자충 그 지역 사회 주석을 포함한 출판되지 않은 게놈 규모의 데이터 시퀀스 기생충 게놈에 대한 정보와 액세스를 제공하는 측면에서 필드의 중요한 자원으로 기능, 유전자 특급<html> ression 및 단백체 데이터 (33). 많은 충성 병원체와 마찬가지로, 게놈의 대부분이 잠재적 인 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 유전자 상 동성을 기반으로 사용할 수없는 정보와 가상의 유전자로 구성되어 있습니다. 따라서, 앞으로 유전자는 면역 회피, 낭종 변환 및 기생충 병인뿐만 아니라 별개의 발달 단계 사이의 변환을위한 중요한 다른 기능에 중요한 새로운 기생충 유전자를 식별 할 수있는 강력한 도구입니다. 순방향 유전학의 추가적인 장점은 면역 회피 및 포낭 형성 포함한 병인 특정 작업에 중요한 유전자로 기생충 심문 비교적 비 편향된 방식으로 사용될 수 있다는 점이다. 돌연변이 프로파일 링을위한 차세대 시퀀싱 최근 개선은 화학에서 삽입 모두 돌연변이 유발 34 ~ 37를 사용하여 앞으로 유전학 연구의 책임 기생충 유전자를 식별하기위한 선택의 방법을 만들었습니다. ntent은 &quot;&gt; 그것은 특히 또한 저항 낭종 단계에 활성화 될 수 것들.이 목표를 향해, 시험관 쥐의 기생충에 대한 세포 자율 면역 메커니즘의 효율성을 향상시키기 위해 이용 될 수있다 T. 포자충의 취약점을 파악하는 것이 중요하다 대 식세포 감염 및 활성화 모델을 구체적으로 순진한 대 식세포에 감염된 대 식세포의 활성화가 아닌 다음 T.의 포자충 체력을 손상 기생충 돌연변이를 확인하기 위해 개발되었다.이 대 식세포 화면에 순서대로 T. 포자충에서 삽입 돌연변이 체의 라이브러리를 심문하기 위해 사용되었다 궁극적으로 산화 질소 (27, 28)에 대한 내성을 위해 중요 T. 포자충 유전자를 확인한다. 감염된 대 식세포 산화 질소 특히 현저한 감도의 활성화에 장애가 저항 T. 포자충 돌연변이 패널의 분리를 식별하기 위해 화면의 유용성을 입증 저항에 대한 중요한 기생충 유전자뮤린 IRGs 28에 기재된 저항기구 이외 셀 자율 면역 매개체이다. 삽입 성 돌연변이 유발 이론 랜덤 기생충 각 클론의 돌연변이 및 돌연변이의 위치의 식별을 용이하게 제한된 수를 생성하는 관점에서 화학적 돌연변이 유발에 비해 많은 장점을 갖는다. 그러나, T.에서 플라스미드 삽입의 게놈 사이트를 식별합니다 포자충 삽입 성 변이체는, 실제로는, 많은 경우에 37 의외로 어려웠다. 유전자 내로 플라스미드의 삽입은 일반적으로 단일 염기 변화를 초래 화학적 돌연변이 대조적으로 유전자의 기능을 방해하기 쉽다. 그것은 다수의 단일 염기 다형성을 생성하지만, 화학적 돌연변이 유발 N 에틸 -N- 니트로 소 우레아 (ENU) 또는 ethylmethane 설포 네이트 (EMS) 중 하나와 (삽입 성 돌연변이 유발에 비해 기생충 게놈의 큰 부분을 분석 할 수있는 증가 된 능력을 제공 할 수있다 돌연변이 (34) 당 10 -100)로 추정38. 또한, 전체 게놈 프로파일 최근 발전은 가능한 돌연변이 기생충 34,38의 표현형에 책임 식별 가능성의 후보 유전자를 동정하는 차세대 시퀀싱을 사용하도록했다. 상관없이 돌연변이 유발 접근법 식세포 활성화에 저항 기생충 유전자의 역할을 확인 궁극적 분자 코흐의 공리를 충족 유전자 결실 및 보완이 필요하다. 기생충 및 대식구 모두의 유전자 조작에 의한 유전자의 기능을 절개하는 능력은 T. 앞으로 유전학 통해 식별 된 유전자의 많은만큼 중요 포자충,뿐만 아니라 다른 병원체는 아직 공지 기능없이 다른 단백질 서열 상 동성이 거의 가설 유전자로 특징 지어진다. 현재 용지는 돌연변이 유전자의 파괴는 공지 또는 내성에 중요한 것인지 식별​​ 할 수있는 일반적인 방법을 설명셀 자율 면역 알 수없는 중재자. 숙주 미생물 인자 초기 분석은 야생형 및 유도 성 산화 질소 합성 효소 (iNOS의) GP-91 phox (NADPH 옥시 다제)에서 특정 유전자의 결실로 그 대 야생형 마우스에서 대 식세포의 돌연변이 기생충의 생존을 평가함으로써 수행되고 특정 면역 관련 GTP 아제 (IRGs). 확인 된 기생충 유전자가 산화 질소, 활성 산소 중간체 또는 면역 관련 GTP 아제 (28)을 각각 또는 알 수없는 면역 메커니즘이 관련된 경우에 대한 저항성에 중요한 경우를 결정합니다. 현재의 프로토콜에 기재된 IFN-γ와 LPS 모두 감염된 대 식세포의 활성화는, 주로 일산화 질소 (28)의 저항에 중요한 기생충 유전자의 분리 결과. 마크로파지 활성화의 부재 하에서 산화 질소 유도되는 약물의 사용은 (산화 질소 공여체) 식별 유전자의 대부분이 재 중요한 것이 확인산화 질소보다는 대 식세포 활성화 (28)와 관련된 추가 매개과 콘서트에서 산화 질소에 sistance. 하나, 둘, 시험관에 감염된 골수 유래 대 식세포의 활성화를 다음과 피트니스 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기위한 앞으로 유전학 화면을 설명하는 단계. 하나 기생충 복제를 감소 시키지만, 완전 야생형 T.의 복제를 저해하지 않는 대 식세포 활성화를 위해 사용 된 실험적 IFN- γ와 LPS의 투여 량을 결정하기 위해 용량 적정 분석을 설명 스텝 기생충 돌연변이 라이브러리의 제작에 사용되는 모 균주 포자충. 두 번째 단계는 96 웰 플레이트에서 대 식세포의 돌연변이 클론의 앞으로 유전 화면을 설명합니다. 세 번째 단계는 각 돌연변이에 결함이 기생충의 생존에 영향을 미치는지, 복제를 평가하고 96 웰 플레이트의 화면에서 식별 된 각 돌연변이의 표현형을 확인하는 방법을 설명,대 식세포의 활성화에 응답 또는 낭종 생산. 네 단계는 돌연변이 기생충은 특히 민감되는 면역 매개체를 식별하기 위해 특정 항균 통로에 결실 된 마우스 골수 유래 대 식세포를 사용하는 방법을 설명한다. 5 단계는 감염된 쥐의 뇌에 낭종 생산에 의해 평가 등의 기생충 돌연변이는 또한 생체 기전에 대한 손상 여부를 확인하는 방법을 설명합니다.

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forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

톡소 포자충은 순진 대 식세포에서 자유롭게 복제하고 6 ~ 12 시간이 기생충의 변형에 따라 사이에 두 배의 시간이 있습니다. (1)가 활성화 된 골수 유래 대 식세포 대 순진한 대표 기생충을 보여줍니다. 그림 2 HFF에서 기생충의 일반적인 형태를 보여줍니다 2, 4, 8, 16, 32 기생충 / PV에서 숙주 세포. 현재 프로토콜에서 기생충은 순진 대 식세포 침입 감염된 대 식세포에 강력한 활성화 자극, LPS 및 IFN-γ의 전달에 앞서 초기 parasitophorous 공포 (PV)를 설립 할 수있다. 이 모델에서, 야생형 기생충의 복제가 느려지지만 기생충 복제는 여전히 식세포 기생충 복제 억제에 점진적 숙달되어이 기간 동안 약 24 시간 동안 진행된다. 화면 유력한 식세포에 필요한 시간 사이 변성 경쟁 모델로서 기능하도록 설계야생형 기생충 또는 기생충 돌연변이가 PV 내에 계속 복제 할 수있는 동안의 시간 대 ctivati​​on. 화면의 첫 번째 단계는 LPS의 투여 량을 선택하는 것 및 IFN- 감염된 대 식세포의 활성화에 사용될 γ. 투여 량은 경험적으로 LPS 농도의 범위 또는 IFN- 농도 (단계 1)의 범위의 정수 LPS 투여와 조합 된 IFN- γ의 어느 일정한 용량으로 활성화 된 대 식세포에서 기생충 복제를 평가함으로써 결정된다. 활성 자극의 투여 량은 화학적 또는 삽입 성 돌연변이 유발에 의해 돌연변이 기생충의 생성에 사용되는 부모 야생형 기생충에 대해 평가 될 필요가있다. 이상적으로는 LPS 및 IFN-γ의 투여 량은 나이브 식세포 PV 당 8-16 기생충에 비해 활성화 후 PV 24-30 2-8 시간 당 기생충의 평균 기생충 복제를 허용한다 (도 1 및도 2). LPS 및 IFN-γ의 적절한 농도 일단 ^7; 결정되고, 돌연변이 96 웰 광학 바닥 조직 배양 플레이트에서 상영된다. 전통적인 조직 배양 플레이트에 사용되는 플라스틱에 요철이 어려운 위상차 및 형광 현미경으로 기생충을 스크리닝 적절한 해상도를 실현할 수 있기 때문에, 광 플레이트 바닥 중요하다. 96 웰 플레이트의 위상 콘트라스트와 형광 현미경은 위상차 4, 긴 작동 거리를 위해 장착 된 10, 20 또는 40 배의 목적으로 역 형광 현미경이 필요합니다. 돌연변이는 쥐의 골수 유래 대 식세포를 포함 복제 판에서 상영된다. 기생충 돌연변이에 도전 한 후, 한 판의 우물에 감염된 대 식세포는 감염된 대 식세포를 포함하는 다른 판은 D10 미디어에서 배양 동안 LPS 및 IFN-γ를 활성화한다. 플레이트는 LPS 및 IFN-γ의 첨가 한 후 24 ~ 30 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양된다. 배양 후, 세포들은 인터넷 아르고정 된, 기생충 형광 염색 및 위상차 현미경을 모두 사용하여 IFA에 의해 분석 하였다. 돌연변이는 정상 기생충 숫자와 순진한 대 식세포에서 복제하지만 적은 기생충 활성화 감염된 대 식세포에서 적은 기생충 작은 액포가 그 선택됩니다. 돌연변이는 그들이 높은 배율에서 기생충 형태의 분석 (100X의 목적, 기름)를 활성화하고, 그들이 순진한 대 식세포의 일반 복제가 있는지를 확인하게 두 개의 독립적 인 실험에서 대 식세포를 순진에서 챔버 슬라이드 (3 단계)에 rescreened 및 활성화되어야 선택하면 하지만 복제 / 생존의 결함은 대 식세포 활성화를 다음과 같습니다. 감염된 대 식세포의 활성화에 저항 결함 돌연변이의 표현형은 일반적으로 두 가지 범주로 분류 형태 학적으로 그대로 나타나지만 PV 당 하나의 기생충을 넘어 복제 할 수없는 기생충; 나타 기생충 degrad합니다ED는 또한 비정질 넓은 PV를 (그림 1과 3)에서 할 수있다. 형태와 기생충의 미세 구조 및 PV 가장 100X 목적과 오일​​을 사용하여 슬라이드에 형광 분석과 결합 위상차 현미경으로 볼 수 있습니다. 리소좀 막 관련 단백질 -1 (LAMP1)에 대한 항체로 기생충 IFA 염색은 돌연변이에 결함이 리소좀과 융합을 방지하기 위해 PV의 무능력과 연관되는지 여부를 결정하는데 유용하다. 숙주 세포 (램프 1 음수)의 세포 내 이입 시스템에서 주로 분리되는 PV에있는 기생충 대 phagolysosome (램프 1 긍정적 인) 내 기생충은 그림 4에 도시되어있다. phagolysosome은 전체 기생충 주위에 긴장 램프 1의 연속 고체 림에 의해 분명하다. 대조적으로, PV 종종 근방 리소좀 소기관 있지만 원주 둘레 LAMP1 얼룩없이 연속 림을 갖는다. t 내에서 정의 구조 / 세포 소기관에 대한 항체의 사용그는 기생충 및 / 또는 PV는 감염된 대 식세포의 활성화와 관련된 각 돌연변이에 이상을 식별하기 위해 IFA 연구를 수행하는데 유용하다. 항체와 같은 심문은 돌연변이에 복제 / 생존 결함의 기초 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 예를 들어,도 5를 도시 T. 포자충 미토콘드리아는 단클론 항체 5F4 방지 F1 ATPase의 베타 아 단위 (피터 브래들리에서 일종의 선물) 야생 형 기생충이나 기생충 돌연변이에 감염된 대 식세포의 활성화 후 24 시간으로 염색. T. 포자충은 단일 클론 항 (T)와 공동으로 염색 포자충 항체. 야생형 T. 포자충은 기생충의 원주를 확장하는 하나의 미토콘드리아를 가지고있다. 감염된 대 식세포의 활성화를 다음과 같은 야생 형 기생충에 기생충의 유일한 미토콘드리아 돌연변이 기생충의 조각 미토콘드리아에 비해 그대로였다. 미토콘드리아의 분열뿐만 아니라 저하 / 비정질에 분명했다기생충 또한, 위상차 현미경에 의해 평가 정상적인 형태를 표시 기생충. 이것은 돌연변이 기생충에 결함이 대 식세포의 활성화에 의해 유도 된 세포 매개체를 호스팅 기생충 미토콘드리아의 감수성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 현재의 모델은 감염된 대 식세포를 활성화 된 IFN- γ와 LPS의 조합을 사용한다. IFN-γ는 전사 인자 STAT1을 자극한다. LPS는, TNF-α와 같은 전사 인자 NF-κB를 자극한다. T.에 대한 세포 자율 면역에 중요한 의존성 항균 매개 γ 알려진 IFN- 포자충은 다른 에이전트에 추가 IFN-γ 의존성 면역 관련 GTP 아제의 배열 (IRGs, Gbps의) 반응성 질소와 산소 종을 포함한다. 여부를 결정하기 위해 각각의 돌연변이에 결함이 구체적 -inducible 항균 매개체 공지 IFN- γ의 생산과 관련되어, 골수 유래 대 식세포 분리되어iNOS의 - / -, GP 91 phox - / - 또는 특정 IRG / GBP 유전자 삭제 마우스 및 돌연변이 기생충에 대한 활동에 대한 분석. 감염된 대 식세포를 활성화 된 IFN- γ와 LPS의 결합은 야생형 우선적 28 기생충 비해 향상된 산화 질소 감수성 돌연변이 초래한다. 감염된 대 식세포의 활성화는 tachyzoites에서 조직 낭종에 포함 된 bradyzoites에 기생충의 무대 분화를 유도 할 수 있습니다. 이러한 낭종은 만성 감염의 특징이다. 따라서, 감염된 대 식세포의 활성화를 다음 복제 / 생존을위한 결함이 기생충 돌연변이 체는 생체 내 감염 중에 낭종으로의 전환에 대한 결함이있을 수 있습니다. 만성 감염 중에 낭종 생산을 평가하기 위해, 마우스 기생충 부모 균주의 비 - 치사량이나 돌연변이 클론 복강 (IP)에 도전한다. 10 이하의 크기의 뇌 범위에서 낭종 _6;. 이상, 50 μm의 지름 m,도 6에 도시 된 바와 같이 IFA에 의해 모두 크고 작은 낭종 수를 계산하지만 기생충 변이주 총 낭종 생산 또는 그냥 설립 손상되면 카운트를 결정하기 위하여 별도로 보관 큰 낭종 및 유지 보수. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig1.jpg" /> 그림 1. 나이브 쥐의 골수 유래 대 식세포 (T)의 복제를 허용하는 경우에는 포자충하지만 IFN-γ를 가진 활성화 및 LPS는 실질적으로 복제를 억제한다. (A) 야생형 (T)의 parasitophorous 공포 (PV) 포자충 (24) 순진한 쥐의 골수 유래 대 식세포의 침공 후 시간. (B) 야생형 (T)의 PV 포자충은 감염된 대 식세포의 활성화 후 공포 24 시간 당 네 개의 기생충 구성된 기생충.(C) 하나의 기생충 / PV 감염된 대 식세포의 활성화 후 24 시간에서 여전히 복제 할 수 없습니다 및 돌연변이 기생충의 예. (D)에 감염된 대 식세포의 활성화 후 비정질 PV 24 시간 내에 분해 나타나는 돌연변이 기생충의 예 . 맨 위 행은 기생충의 위상 이미지를 보여주고 아랫 줄은 T.에 대한 클론 항 혈청을 사용하여 형광 이미지를 보여줍니다 포자충. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig2.jpg" /> 도 2 기생충 복제 PV 당 기생충의 수에 의해 평가 하였다. 이미지가 2, 4, 8, 16, HFF 세포 당 32 PV 기생충을 나타낸다. 각 그림은 병합 된 위상 이미지 일이다에 빨간색의 기생충과 파란색 (DAPI)에서 HFF 핵의 폴리 클로 날 항체 염색을 보여줍니다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig3.jpg" /> 도 3 돌연변이 감염된 대 식세포의 활성화 다음 표현형의 범위를 나타낸다. 좌측 열은 대 식세포에서 기생충의 위상 이미지를, 중간 열은 T. 대한 항체를 이용하여 형광 이미지 포자충, 오른쪽 열은 위상 및 형광 이미지의 병합이다. 기생충은 녹색과 파란색 식세포 핵에 표시됩니다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig4.jpg" /> 그림 4. 램프 1 염색 phagolysomes 함유 기생충에서 PV를 구별. 기생충 클론 항 T. 묻 단클론 항체 1D4B (녹색)와 포자충 항체 (적색)과 램프 1. 화살표는 리소좀과 융합 한 기생충 PV를 표시합니다. 화살표가없는 기생충은 리소좀과 융합되지 않은 parasitophorous 공포 (PV)에 있습니다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig5.jpg" /> 그림 5. 야생 형 기생충 mitochondri 동안 그대로 미토콘드리아를 유지감염된 대 식세포의 활성화를 다음과 기생충 돌연변이에 열화에. 세 가지 다른 돌연변이 T.에 비해 야생 형 기생충의 미토콘드리아 (녹색) (상단 패널) 포자충은 저하 (아래 세 개의 패널)의 다른 단계에 감염된 대 식세포의 활성화 후 24 시간에서 기생충. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52556/52556fig6.jpg" /> 렉틴 biflorus FITC - 복합 dolichos을 사용하여 뇌의 기생충 낭종의 그림 6. 감지. 렉틴으로 표시 낭종 벽은 녹색으로 표시됩니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig6large.jpg" target="_blank">더 큰 버전?를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 명.

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-Î³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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Nanyang Technological University

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JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K 조회수.  New York Medical College. Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion. 

비디오: Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

연구

면역학 및 감염병학

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

유전학

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have been limited compounds available so far to attenuate TLR signaling and there have been no clinically approved TLR inhibitors (except the anti-malarial drug hydroxychloroquine) in clinical use. In light of rapid advances in nanotechnology, manipulation of immune responsiveness using nano-devices may provide a new strategy to treat these diseases. Herein, we present a high throughput screening method for quickly identifying novel bioactive nanoparticles that inhibit TLR signaling in phagocytic immune cells. This screening platform is built on THP-1 cell-based reporter cells with colorimetric and luciferase assays. The reporter cells are engineered from the human THP-1 monocytic cell line by stable integration of two inducible reporter constructs. One expresses a secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) gene under the control of a promoter inducible by the transcription factors NF-&#954;B and AP-1, and the other expresses a secreted luciferase reporter gene under the control of promoters inducible by interferon regulatory factors (IRFs).Upon TLR stimulation, the reporter cells activate transcription factors and subsequently produce SEAP and/or luciferase, which can be detected using their corresponding substrate reagents. Using a library of peptide-gold nanoparticle (GNP) hybrids established in our previous studies as an example, we identified one peptide-GNP hybrid that could effectively inhibit the two arms of TLR4 signaling cascade triggered by its prototypical ligand, lipopolysaccharide (LPS). The findings were validated by standard biochemical techniques including immunoblotting. Further analysis established that this lead hybrid had a broad inhibitory spectrum, acting on multiple TLR pathways, including TLR2, 3, 4, and 5. This experimental approach allows a rapid assessment of whether a nanoparticle (or other therapeutic compounds) can modulate specific TLR signaling in phagocytic immune cells.

Toll-like receptor (TLR) signaling plays an important role in the pathophysiology of many human inflammatory diseases, and regulating TLR responses by bioactive nanoparticles is anticipated to be beneficial in many inflammatory conditions. THP-1 cell-based reporter cells provide a versatile and robust screening platform for identifying novel inhibitors of TLR signaling.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

의학

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면

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