Name: functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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우리는 Sinai 산에서의 연구 우수성의 Flow Cytometry, Microsurgery 및 Bio-repository / Pathology Centres의 기술적 인 공헌을 인정합니다. 이 연구는 COST Action BM1305의 지원을 받았다. Salli Mount Recanati / Miller Transplantation Institute 발달 기금, Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-R 및 SAF2016-80031-R에 초점을 맞추고 세포 독감 치료법 (A FACTT)을 가속화하는 활동 조

<html> 이 연구에서 쥐는 미국 농무성 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 보건 서비스 안내서의 권고에 따라 보관됩니다. 동물 실험과 관련된 모든 실험 기술은 Mount Sinai School of Medicine의 IACUC (Institutional Animal Care and Utilization Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 미디어 준비 <ol><li> 2 MM L - 글루타민, 1 MM 나트륨 피루 베이트, 0.1 MM 비 필수 아미노산, 5 MM HEPES 및 0.05 MM 2를 사용하여 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (10,000 U / ML)와 완전한 RPMI 1640 매체를 준비 - 머 캅토 에탄올. </li></ol> 2. 동종 이식 및 단일 세포 현탁액 참고 : 폐동맥과 하대 정맥 정맥의 이식 및 문합 기법은 Corry와 공동 작업자에 의해 처음 설명되었으며 Liu &amp; Kang에서 시각화 할 수 있습니다s = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( 그림 1A ). <ol><li> 유도 챔버에서 4-5 % isoflurane으로 이식 마우스를 마취. 자궁 경관 탈구로 희생하십시오. </li><li> 정형 가위로 정중선을 절개하고 대동맥을 국소화하기 위해 복부 내용물을 제거하십시오. 참고 : 이식 된 심장은 복부 대동맥의 오른쪽에 있습니다 ( 그림 1B ). </li><li> 미세한 날카로운 이빨 집게로 이식편을 부드럽게 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오. 참고 : 수술 가위를 사용하여 대동맥에서 이식편을 분리하면 이식재가 손상되고 일부 조직이 수혜자에게 달라 붙을 수 있습니다. </li><li> 모든 이식편을 수거 한 후 조직 처리를 위해 멸균 된 문화 후드로 옮깁니다. 페트리 접시에 이식을 배치하고 무균, 무딘, microsurgery 가위를 사용하여 작은 조각 (1mm)로 조직을 주사위. </li><li> 날카로운 이빨을 가진 forc로eps, collagenase A (멸균 1x PBS에 0.1 MG / ML collagenase) 5 ML와 50 ML 튜브에 조각을 전송. 37 ° C 조에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 콜라게나 제를 중화하기 위해 RPMI 배지 5 mL를 넣고 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 100 μm 스트레이너로 시료를 옮긴다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 샘플을 회전 시키십시오. </li><li> 펠릿을 ACK 용해 버퍼 1 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라. </li><li> 용해 완충액을 중화하기 위해 RPMI 배지 1 ML을 추가하고 4시 5 분 400 XG에서 샘플을 회전 ° C. </li><li> RPMI 배지 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. 참고 : 폴리 프로필렌 튜브는 접착력이 적습니다. 또한 4 ° C와 같은 저온에서 세포를 유지하면 접착력이 감소합니다. </li></ol> 3. 형광 활성화 된 세포를 이용한 이식편 - 침윤성 대 식세포의 분리보내는 <ol><li> Fc 수용체 차단 단클론 항체 (rat ant-mouse CD16 / 32)를 사용하여 골수 세포에서 원하지 않는 특이 적 결합을 차단합니다. 표면 얼룩 15 분 전에 샘플 당 1-2 μL를 추가합니다. </li><li> anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / μL), anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI 배지에서 0.6 μg / μL 최종 농도) 항 마우스 Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). 형광등 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ℃에서 냉장고에 튜브를 잠복니다. 참고 : 단일 얼룩 보정의 경우 네거티브 컨트롤 튜브 (얼룩이 없음)와 각 형광 색소가있는 라벨이 붙은 튜브가있는 튜브를 준비하십시오. 문을 세우는 것을 돕기 위해 isotype 컨트롤은 특히 Ly6C (IgG2a)와 Ly6G (IgG2b)에 사용될 수 있습니다. </li><li> RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. 트리 판 블루 (trypan blue) 및 혈구 세포 (hemocytomete)를 사용하여 세포를 센다.1x10 6 세포 당 RPMI 배지 1 ML에서 희석. 분류하기 전에 샘플을 5 mL, 70 μm 셀 여과기 튜브 캡으로 옮깁니다. 세포 생존률 마커로 DAPI (1 μg / ML)를 추가하고 정렬로 진행합니다. </li><li> 대 식세포는 민감하고 깨지기 쉬운 세포이기 때문에 정렬 조건을 20 psi로 설정하고 100 μm 노즐 크기를 사용하여 4 방향 순도 모드를 사용하여 대 식세포를 분리합니다. </li><li> 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에서 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비합니다. </li><li> 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다. </li><li> 전방 및 측면 산란이 가장 적은 부스러기와 덩어리를 제외한 모든 백혈구의 전방 (FSC) 대 측면 (side) 산란 (SSC) 및 게이트를 표시하는 도트 플롯을 설정합니다. 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다. <ol><li> 새롭게 문을 열 인구에 광고 작성CD11b 대 CD45 및 이중 양성 (CD11b + CD45 + ) 대 식세포 및 호중구의 게이트를 나타내는 플롯. </li><li> 여기에서 Ly6C 대 Ly6G를 표시하는 최종 도트 플롯을 만들고 Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - , Ly6C int Ly6G + 와 같은 바람직한 개체군을 게이트하십시오 ( 그림 2 ). </li></ol></li><li> 분류 후, 순도와 세포 생존률 (&gt; 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan 블루와 hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 완전한 RPMI 매체에서 원하는 농도 ( 예 : 1 × 10 6 macrophages / ML)에 그들을 resuspend. </li><li> 완전한 RPMI 배지 100 μL의 최종 부피가있는 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 플레이트 50 x 10 3 개의 대 식세포. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 적어도 24 시간 동안 세포를 방해하지 마십시오. </li></ol> 4. Isolatio형광 활성화 된 셀 정렬을 이용한 T 세포의 수 참고 : C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn은 Foxp3 (포크 헤드 박스 P3) 유전자를 표현하는 세포를 단량체 적색 형광 단백질 (mRFP)과 공동 표지하는 X- 연결된 표적 노크 - 인 마우스입니다. <ol><li> 전에 2.1 단계에서 설명한대로 C57BL / 6 및 C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H - 2b) 마우스를 마취하고 희생. 비장과 림프절 (LN : 사타구니, 요추, 축삭, 상완, 자궁 경부)을 분리하고 신속하게 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오. </li><li> LN을 분리하기 위해 마우스를 앙와위에 놓고 정중선 피부를 아래에서 위로 절개하고주의 깊게 복막을 잘라 부드럽게 피부를 벌리십시오. 모든 사타구니, 요추, 겨드랑, 상완, 그리고 자궁 경부 LN ( 그림 1C , 붉은 색)가 수집되면, 복막을 자르고 창자의 왼쪽 상단에서 비장을 분리. </li><li> 배치 된 100 μm 필터를 사용하여 비장 및 LN 분리50 mL 튜브 위에 올려 놓습니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 조심스럽게 누릅니다. 필요할 때까지 RPMI 배지로 필터를 깨끗이 헹굽니다. 참고 : 각 마우스의 LN과 비장은 동일한 튜브에 모아 둘 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운. </li><li> 펠릿을 ACK 용해 버퍼 2 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라. </li><li> 용해 버퍼를 중화하기 위해 2 ML RPMI 매체를 추가합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운. </li><li> RPMI 매체 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 항 마우스 CD4 APC (0.6 μg / μL) 및 / 또는 항 마우스 CD8 PeCy7 (2 μg / μL)에 대한 염색. 빛으로부터 형광 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 품어 라. 참고 : 단일 얼룩 보정의 경우, 음성 대조 튜브 (얼룩 없음)를 준비하고튜브는 형광 염료의 각각으로 단독으로 라벨이 붙어있다. </li><li> RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 참고 : CFSE 염료는 일반적으로 50 μg에서 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester powder로 제공됩니다. CFSE의 유리 병에 18 μL DMSO를 넣어 최종 보관 용액 5 mM에 저장하고 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> CFSE 라벨을 위해, 주식 솔루션에서 5 μm의 CFSE의 최종 작업 농도에서 PBS에 ML 당 10 6 세포의 농도로 resuspend CD8 염색 세포. 앞서 설명한대로 20 ° C에서 5 분간 배양하십시오. 주의 사항 : (CRITICAL STEP) 저농도 (㎖ 당 ≤10 6 ) 인 세포의 경우 CFSE의 독성 효과를 완충시키기 위해 단백질이 첨가 된 상태에서 세포를 표지해야한다. 따라서, PBS는 5 % FBS를 함유 할 수있다. 나에게dium이 사용되면 유리 아미노산은 CFSE와 경쟁하여 표지 효율을 낮출 수 있습니다. </li><li> 2 mL의 RPMI 배지로 CFSE를 중성화하십시오. 4 ° C에서 5 분간 400 xg에서 스핀. 1 x 106 CD8 T 세포 당 1 mL의 RPMI 배지를 첨가한다. </li><li> 분류하기 전에 샘플을 5 μm 튜브 캡에서 70 μm 셀 여과기로 옮깁니다. 세포 생존 마커로 1xDAPI (1 μg / ML) 50 μL를 추가하고 정렬로 진행합니다. 참고 : 1x는 다른 구성 요소에 대한 시약의 1 : 1 비율을 의미합니다. </li><li> 정렬 조건을 20 psi 및 100 μm 노즐 크기로 설정하여 이중 양성 CD8 + CFSE + T 세포를 분리합니다 ( 그림 3A ). </li><li> 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비하고 정렬로 진행합니다. </li><li> 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다. </li><li> CD4 + T 세포 분리의 경우,수지상 세포와 같은 큰 과립 세포뿐만 아니라 잔해물을 제외한 FSC 대 SSC 및 림프구 게이트를 재생합니다. <ol><li> 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다. </li><li> 새롭게 문이 열어 진 인구에서 모든 CD4 + 세포를 분리하기 위해 SSC 대 CD4를 나타내는 도트 플롯을 만듭니다 ( 그림 3B ). 대안으로, 항 -CD3 단클론 항체를 사용하여 순수한 T 세포 집단의 분리를 보장 할 수있다. 참고 : 모든 CD4 + T 세포의 작은 부분 (5-10 %)은 Foxp3 + mRFP + 이어야합니다. </li></ol></li><li> 분류 후, 순도와 세포 생존률 (&gt; 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 2x10 6 T 세포 당 1 ML의 완전한 RPMI 매체를 사용하여 Resuspend. </li><li> 이전에 정렬 된 macrophages와 T 세포를 배양하여 억제 분석을 설정합니다. 플레이트 10 x 10 4 CD4 + T 및 10 × 10 4 CD8 + CFSE + T 세포를 100 μl의 최종 RPMI 배지에 넣었다. 96 시간 동안 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 배양하십시오. 참고 : 대 식세포와 T 세포는 1 : 4 비율로 사용되었습니다. </li><li> 아 지드 함유 완충액을 제거하기 전에 T 세포 활성제 CD3 / CD28 자석 구슬을 PBS 2mL로 세척하여 T 세포 분열을 자극합니다. 우물 당 마우스 T 세포 - 활성화 CD3 / CD28 비즈 5 μL를 추가합니다. 참고 : Magnetics beads는 항원 제시 세포와 크기면에서 유사하며 T 세포의 활성화와 확장을위한 간단한 방법을 제공하는 항 -CD3 및 항 -CD28 mAb에 결합됩니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 - 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 데 중요합니다. 그러나, 상업적 농축 키트와 같은 다양한 백혈구 집단의 분리를 위해 다른 방법이 사용될 수있다. 관심있는 세포 집단과 관계없이 최적의 표면 염색 및 유동 세포 계측 결과를 얻기 위해서는 이식 조직에서 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 필요합니다. 부정확 한 조직 조작은 세포 손실을 초래할 수 있으며 따라서 골수량 하위 집합의 낮은 수율을 초래할 수 있습니다. 수율을 높이려면 샘플을 처리해야합니다.차가운 버퍼를 노래하고 낮은 세포 부착 (폴리 프로필렌 튜브)과 용기에 세포를 유지합니다. 이 프로토콜에서 우리는 C. histolyticum의 Collagenase A를 사용하여 여러 유형의 조직 ( 예 : 폐, 심장, 근육, 뼈, 지방, 간, 신장, 연골, 유선, 태반, 혈액)의 분리에 널리 사용됩니다. 혈관, 뇌, 종양). 정렬하는 동안 세포의 손실을 방지하기 위해 항체를 최적화하고 효율적인 게이팅 전략을 생성하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서 우리는 CD11b - Percp / Cy5.5, CD45 - APC / eFluor780, Ly6C / APC 및 Ly6G Pe / Cy7 형광 결합 항체 및 유동 세포 계측법을 사용하여 마우스 macrophages 특징. 에피토프 Ly6C / G는 사람에게 존재하지 않기 때문에 CD14 / CD15 / CD16의 사용은 인간 골수 세포를 분류하는데 필요합니다 15 . 다색 유문 사이토 메 트리 분석에서, 선택된 형광 크로마토 그래피의 가능한 스펙트럼 중첩이 발생할 수 있습니다. 따라서 befo다시, 단일 얼룩 보상은 겹치는 문제를 피하기 위해 매우 유용합니다. 또한, 배경 형광을 줄이고 최적의 결과를 얻으려면 항체 적정을 적극 권장합니다. 비특이적 결합을 줄이기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 생존력 염료의 사용이다. 이 프로토콜에서 DAPI는 생존 염료로 사용됩니다. DAPI (4 &#39;, 6- diamidino-2-phenylindole)는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 강력하게 결합하는 청색 형광 염료입니다. DNA에 결합 된 DAPI의 여기 최대 값은 358 nm이며 최대 방출 값은 461 nm이다. 프로토콜에 따라 사용하면 DAPI는 유동 분석에서 죽은 세포를 제외한 세포질 표지가 거의 없거나 전혀없는 상태로 핵을 특이하게 얼룩지게합니다. 그러나, 선택된 항체 패널에 따라 7-Amadactinomycin D (7-AAD) 및 propidium iodide (PI)와 같은 다른 생존 성 염료가 사용될 수 있습니다. 정확한 사체 세포 배제와 생존 세포 식별은 in vitro T 세포를 성공적으로 모니터하기위한 전제 조건입니다.세포 생존 능력과 기능에 미치는 영향을 최소화하면서 림프구 증식을 추적 할 수있는 절차를 원하고 있습니다. 위에서 언급했듯이 CFSE와 같은 세포 추적 염료를 이용한 세포 표지 및 증식 분석을위한 중요한 단계가 있습니다. 문헌에 기술 된 예로서, CFSE 16을 사용할 때 균일 한 분포와 구별 가능한 딸 첨점을 얻기 위해 죽은 / 죽어가는 세포를 배제하는 것에주의를 기울여야한다. 염색 패널에 따라 선택할 수있는 많은 상업적으로 이용 가능한 세포 추적 염료가 있습니다. 세포 추적 염료의 대안으로 thymidine titriated assay를 수행하여 암 연구 13,14 에서 림프구 및 기타 세포의 증식을 평가합니다. Thymidine incorporation 프로토콜은 방사성 표지 된 3H 또는 14C- 티미 딘의 측정에 의한 세포 분열 동안 DNA의 복제를 평가합니다. 이 방법은매우 민감하고 잘 확립 된 경우, 티미 딘 적정 기법의 주요 단점은 방사능을 포함하고 단일 세포 수준에서 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 반면에, CFSE 유동 세포 계측법 분석은 반응하는 림프구 부분 집합에 대한 명확한 정보를 제공하고 내부 및 병원 내 변동성이 적습니다.

이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다. CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE 7 와 같은 가시 단백질 염료를 인식하지 못하는 것을 피하기 위해서도 중요합니다. 방사성 표지 된 티미 딘 (TdR) 8 을 사용하는 티미 딘 도입 분석과 같은 세포 증식을 측정하는 대체 기술에 비해 형광 염료를 사용하면 많은 이점이 있습니다. 이 분석은 mitotic 세포 분열 동안 염색체 DNA의 새로운 가닥에 통합되는 삼중 티미 딘 ( 3 H-TdR)을 이용한다. 이 분석과 관련된 안전 문제는 방사성 동위 원소의 사용이다. 왜냐하면 신틸레이션 베타 계수기가 세포 분열 정도를 결정하기 위해 세포에서 회수 된 DNA의 방사능을 측정하기 때문이다. 방법 론적으로, 삼중 수소 티미 딘 엉덩이ay는 세포 수가 적고 염색 후 지연된 분석과 같은 중요한 임상 실험실 제약 조건에 맞을만큼 유연하지 않습니다. 반대로, CFSE 염색은 세포 증식을 예방하고 CD69, HLA-DR 및 CD25와 같은 중요한 활성화 마커를 방해하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 방법론의 장점과 한계를 이해하는 것은 특히 여러 염료를 사용하여 여러 세포 유형을 추적하는 다색 연구에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1,000x 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Non Esential amino acids</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sodium Pyruvate</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Collagenese A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (w/o calcium&amp;amp;magnesium)</td><td>Corning</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 well&amp;nbsp; U-bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&amp;nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity

이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 1 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 2 . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 + T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.

대표적인 결과는 위의 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 보여줍니다. 결과는 또한 이식편 - 침투 대 식세포와의 공 - 배양 후 T- 세포 증식 활성의 분석을 나타낸다. 그림 4 에서 대 식세포 하위 집합의 체외 억제 능력을 분석했습니다. 결과는 용인 된 수용자로부터 얻은 Ly6C lo Ly6G - 대 식세포가 억압 적이라는 것을 나타낸다. 결과는 또한 Ly6C int Ly6G + 세포가 완만 한 억제 능력을 나타낸다는 것을 나타낸다. Ly6C lo Ly6G - 세포 만이 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg의 확장을 촉진했다. 함께, 이식편 - 침투 CD11b + Ly6C lo Ly6G - macrophages는 단핵구 유래 억 제기 세포와 관련된 것으로보고 된 많은 특성을 가지고 있다는 결론을 뒷받침한다.CD8 T 세포 증식을 억제하고 CD4 + Foxp3 + Treg의 증식을 촉진시키는 능력을 보였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig1.jpg" /> 그림 1 : 동물 모델. ( A ) Balb / c 심혼 (H2-d)는 이전에 기술 된 것과 같이 완전히 동종이의 C57BL / 6 (H2-b)로 이식되었다. 수혈부의 대동맥과 복부 대동맥의 기증자의 폐동맥과 상행 대동맥을 각각 가진 문합이 표시됩니다. 수용체 마우스를 우리가 최근에보고 한 바와 같이, 0, 2 및 4 일째에 내성 유도를 위해 250 ㎍의 항 -CD40L 단클론 항체 (클론 MR1)로 처리 하였다. 이식 기능은 복부 촉진에 의해 격일로 모니터링되었습니다. 거부 반응은 만져진 심장 박동의 완전 중단으로 정의되었으며, 직접 시각화를 통해 확인되었다.<html> 개복술. ( B ) 대표 이미지 및 ( C ) LN과 비장 (빨간색으로 표시) 및 동종 이식 (보라색으로 표시)의 해부학 적 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig1large.jpg" target="_blank">위치를 보여주는 그림입니다.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig2.jpg" /> 그림 2 : 대 식세포 분류 전략. 왼쪽 위부터 시작하여, 백혈구는 처음에는 크기에 의해 문이 열리고, 그 다음에 단일 세포가 파편과 덩어리로부터 차별됩니다. singlets에서, 죽은 세포는 DAPI 음성 분율에 게이팅되지 않습니다. 살아있는 세포에서 CD45 + CD11b + 는 골수 양 세포를 확인하는 데 사용됩니다. Ly6C 및 Ly6G 발현에 기초하여 3 개의 골수 세포 집단이 추가로 동정된다.= &quot;_ blank&quot;&gt;이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54242/54242fig3.jpg" /> 도표 3 : 림프구 분류 전략. 림프구 정렬 전략에 대한 대표적인 유동 세포 계측 결과. 왼쪽 위부터, 전방 및 옆방 산란에 따라 림프구 집단의 문. 잔해 및 덩어리를 제외하십시오. 싱글 렛으로부터, 죽은 세포는 DAPI 음성 분율을 게이팅함으로써 배제된다. 살아있는 세포에서, ( A ) CD8 + CFSE + 이중 양성 세포와 ( B ) Foxp3 + 양성 세포의 분획을 포함하는 모든 CD4 + T 세포는 문이 열립니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src=&quot;/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg&quot;/&gt; 그림 4 : 억제 분석. ( A ) 체외 에서 각 골수 하위 집합의 억제 능력. CD8 + T 세포 증식은 골수량 하위 세트와의 공동 배양 96 시간 후 CFSE 희석에 의해 모니터링되었다. ( B ) 체외 Treg 각 골수 하위 집합의 확장. 골수량 하위 집합과 공동 배양 96 시간 후 CD4 + T 세포에서 Foxp3 발현의 유동 세포 계측법 분석. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54242/54242fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다. 

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Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

연구

암 연구학

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

면역학 및 감염병학

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

동종 유도 혈관 거부 및 이식 동맥 경화 마우스 모델

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

의학

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...