Special thanks to Dr. Peter Bradley for the antibody to detect the T. gondii mitochondria. The work was supported by National Institute of Health Grants AI072028 and AI107431 to D.G.M and a generous donation to New York Medical College for the study of tropical medicine.

The authors have no competing financial interests.

Açıklanan protokol fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve T. izole etmek için ileri genetik aktivasyonunu kullanan olmayan bir önyargılı bir yaklaşım sağlar yeteneklerini bir kusur ile gondii mutantlar enfekte makrofajlar aktivasyonunu hayatta kalmak için. mutantlar aşağıdaki makrofaj aktivasyon fenotip tipik iki geniş kategorilerden birine girer: 1) parazitler sağlam görünen, fakat PV başına 1 parazitin ötesine çoğaltmak için başarısız; 2) parazitler bozulmuş görünür ve ferah, amorf PV&#39;lerden olabilir. mutantlar aktivasyonun yokluğunda naif makrofajlar yabani tip parazitler gibi bir fenotipe sahip olması protokol spesifik olarak makrofaj aktivasyonu mukavemet etme kabiliyetleri bozulmaktadır mutantlann tespit edilmesi için de kullanılabilir göstermektedir. primer kemik iliği kaynaklı makrofajların kullanımı ekran RAW 264.7 makrofaj hücre hattına karşı önerilir, çünkü vacu başına parazit, parazit sayısı morfolojisiole daha kolay kemik iliği kökenli makrofajlar içinde görülür. ileri genetik ile birlikte açıklanan ekran parazit genleri ve hücre özerk bağışıklığın özel arabulucular direnç için önemli sonuçta genetik yollar incelemek için çok yönlü bir araç sağlar. Böyle ileri genetik çalışmalar in vitro ve patogenezi sırasında hem özel antimikrobiyal direnç arabulucular için önemli parazit yollar çözülüyor başlamak için bir dize gibi takip edilebilir parazit genleri tanımlamak için önemlidir. Ileri genetik yaklaşımlar ile önceki zorluk, her mutant bozulduğu anahtar genin tanımlanması oldu. T. kozmid kütüphanesi tamamlama gondii hücre bölünmesi mutantların fonksiyonel tamamlaması için oldukça etkili olmuştur. Bununla birlikte, yabani tip parazitler çoğaltma de sadece mutantı daha az bir ölçüde, IFN-γ ve LPS tarafından bastırılmış olduğu gerçeği, fonksiyonel tamamlama daha zor hale getirir thaHücre bölünmesi mutantlar n. T. kimyasal ve insersiyonel mutantlar hem de tüm genom mutasyon profili gondii son zamanlarda üretken olarak ortaya çıktı ve hatta ileri genetik ekranlarında 34,36,37,44 mutantların fenotipleri sorumlu genleri tanımlamak için etkili, cadde mal olmuş. Sonuç olarak, yeni nesil sıralama kullanarak tüm genom mutasyon profilleme T. kimyasal mutagenezin potansiyel kullanım artırmıştır ileri genetik çalışmalarda gondii belirli fonksiyonlar için önemli genleri tanımlamak için. Mevcut protokolde tarif edildiği gibi böyle bir ileri genetik yaklaşım T. genomunun en önemli olan gondii bağışıklık kaçırma önemli aday parazit genlerin tanımlanmasında yardımcı olabilecek diğer genler ya da işlevsel etki için bir homolojiye sahip öngörülen bir gen çoğunlukla varsayımsal kalır. 96 oyuklu plakalar IFA analizi, genel olarak bir araya bir yüksek veri akışı tarama kabul edilmezhod. Bir kişi bir günde 10 96-kuyu plakaları ya da yaklaşık 960 mutantlar leke ve ekran için bizim deneyim makul olduğunu. Skariah ve diğ., Kağıdın içinde, yaklaşık 8.000 mutant analiz edildi ve 14 bağımsız mutantlar aktif değil naif makrofajlar 28 hayatta kalma / çoğaltma için bozulmuş olduğu izole edilmiştir. mutantların engelli yaşam baskın nitrik oksit artan duyarlılık sonucu oldu. genel yöntemde sınırlama öncelikle parazit tek klonları elde ziyade 96 kuyu plakalar ilk ekran nitel ve makul hızlı olduğu gibi mikroskobu ile tarama seviyesinde olduğunu. 96 gözlü bir levhanın elemede tanımlanan mutantların fenotip teyidi oda slaytlar makrofajlar kullanılarak niceliksel ve niteliksel analizi ile Adım 3&#39;te ve vahşi tipli ya da mutant parazitlerin eşit sayıda ekleyerek takip edilir. Diğer analitik eleme yöntemlerinin kullanılmasıBu tür parazitlerin toplam nüfusu düzeyinde fluorometri olarak, yerine mikroskopi tarafından değerlendirilir bireysel parazit seviyesinden daha, bozulmuş parazitler gibi birçok T. karşı poliklonal antikor ile leke mevcut protokol sorunlu gondii kadar sağlam olarak mutant floresan yoğunluğu düzeyinde nicel daha nitel olmak fark ile yabani tip parazitler. Ayrıca, IFN-γ ve daha sonraki zaman noktalarında da olsa vahşi tip parazitler bastırılmış çoğalmasında enfekte makrofajlar sonuçlar aktivasyonuna direncinde bir bozukluğu olan mutantlar izole etmek için gerekli olan LPS&#39;nin dozu. Bu nedenle, Işıklı parazitler kullanımı da dahil olmak üzere ileri genetik ekran için toplam parazit sayısının ölçümü sorunludur. Bununla birlikte, kimyasal veya araya sokulan mutajenez için kullanılan ebeveyn parazit klonlar, bir kurucu ya da uyarılabilir floresan veya Lucifer&#39;i ifade eğer boyama protokolü eleme aşaması elimine edilebilir mümkündürase işaretleyici. 96 yuvalı plakalar içinde makrofajlar IFA ve mikroskop tarama kullanılarak açıklanan protokol aktive edilmiş makrofajlarda hayatta kalma / çoğaltma için arızalı mutantın izolasyonu sağlar ama aynı zamanda açık bir şekilde elde edilebilir, 96 oyuklu plaka formatı olarak kullanılarak sınırlı mikroskopik çözünürlük nedeniyle bazı potansiyel mutantlar kaçırır Bu çözünürlükte parazit antijen için leke amorf şişmiş vakuoller normal PV içinde sağlıklı kopyalayan parazitler için yanlış olabilir. 96 gözlü cam kapak plakaları yerine, bir optik yüzeyi ile 96 yuvalı plakalar ikamesi, 96 gözlü plakalar içinde enfekte olmuş makrofaj ekran esnasında daha büyük bir çözünürlük elde etmek olasıdır. Parazit işgali aşağıdaki makrofajlar etkinleştirmek için açıklanan protokol IFN-γ ve LPS kullanılarak belirlenen mutantların büyük çoğunluğu nitrik oksit 28 kendilerini korumak için kendi yeteneği bir kusur var. Bu bağlamda, ekran olmayan yanlı olması amaçlanmıştır, ancakaktivasyon koşulları, Çeşidi ve makrofajların türleri ve ekran için seçilen makrofaj aktivasyonu ile yakından parazit istilası nisbetle zamanına bağlı olarak spesifik bir antimikrobiyal aracıların karşı daha hassas olan bir parazit mutantların izolasyonu için zenginleştirebilir. Bu nedenle ekran ve uygulanan aktivasyon uyaranlara seçilen doğal immün hücre elde edilen asalak mutantlar duyarlı olması muhtemel olan antimikrobiyal aracıların türü etki önemli parametrelerdir. parazitin genotip ayrıca, Tip II ve III genotipleri 26,45,46 daha hassastır süre parazitin genotipleri IFN-γ yanıt olarak oluşturulan bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) nispeten dirençli olan tür olarak kritik bir parametredir. Açıklanan protokol, makrofajlar parazit istilasından sonra aktive edilir. Tip II genotipi, ancak tarif edilen ekranda kullanılan Prugnaud soyu, bağışıklıkla ilgili GTPases etkisine duyarlı olan birParazit makrofajlar istila llowing ilk IRGS tam indüksiyon öncesi vahşi tip parazit çoğaltma sağlar. Ayrıca, IRGS istilayı ve replikasyonunun başlatılmasını asalak sonraki makrofajlarda neden olup olmadığını parazite karşı etkili olduğu açık değildir. açıklanan protokol-IFN γ-bağımlı hücre özerk dokunulmazlık, özellikle nitrik oksit arabulucular direnç için önemli parazit genleri tanımlamak için makrofajlar kullanır. nitrik oksit belirgin bir duyarlılık yanı sıra nitrik oksit-bağımlı mitokondriyal parçalanma paylaşılan fenotip paylaşan parazit mutantlar bir havuz izolasyon nitrik oksit ve anlayış için parazit genleri ve direnç için önemli yolları belirlemek için eşsiz bir araçlar kümesi sağlar T. karşı daha geniş bir nitrik oksit eylem Toxoplasma gondii ve küçük değişikliklerle, başka ökaryotik pathogens.The açıklanan protokol ileri genetik STUDIE için kullanılabilirs hücre özerk bağışıklığın farklı arabulucular direnç için önemli parazit genleri tanımlamak için. Muhtemel tadilatlar işgali asalak enfekte konakçı hücre türü, aktivasyon uyaranı veya aktivasyon zamanlamasını değiştirilmesini kapsayabilecektir. Örneğin, parazitlerin ilave edilmeden önce, IFN-γ ile sıçangil makrofaj aktivasyon öncesi bağışıklık ile ilgili GTPases aktivasyonuna neden olur. T. Böyle bir model Tipi parazit genleri tanımlamak için kullanılan olabilir ben genotipleri gondii bağışıklıkla ilgili GTPases 24,25 ile ROP18 ve ROP5 aracılık ettiği dirence katkıda bulunabileceğini. T. karşı hücre özerk bağışıklığın Arabulucular İnsan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde gondii yanı kemirgenler gibi tanımlanmış değildir. Bu nedenle, insan periferal kan monositleri kullanımı T. kimyasal mutantların taranması için gondii doğuştan gelen bağışıklık hücreleri insan enfeksiyonu yanı sıra fo insanlarda önemli mekanizmalardan sırasında hayatta kalmak için önemli hem de parazit genleri tanımlamak olabilirT. r antimikrobiyal direnç gondii. Bu tür reaktif oksijen veya nitrojen türleri gibi farmakolojik maddeler için enfekte olmuş konakçı hücrelerin maruziyetini koruyamamıştır mutantların izole edilmesi suretiyle tespit edilebilir spesifik bir antimikrobiyal aracılarının direnç için önemli bir Parazit genleri bulunmaktadır. Benzer bir protokol aktivasyonunu 47-49 veya makrofaj purinerjik reseptörlerin 50 ATP uyarılması inflammasome karşı daha hassas olan bir parazit mutantların izole edilmesi için modifiye edilebilir. Birlikte ele alındığında, protokoller T. için önemli parazit mutantlar izole ileri genetik ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri kullanarak bir yaklaşım tarif gondii direnç IFN-γ-bağımlı hücre özerk bağışıklık. Önemli olarak, bu yaklaşım ortaya koymak çok yönlüdür ve hali hazırda konakçı hücreler veya durumlar encounte stres direnci, belirli tiplerinde belirli antimikrobiyal mediyatör parazit yaşam kaçma önemli parazit genleri izole etmek için değiştirilebilirtoksoplazmozis sırasında kırmızı. Bundan başka, bir çok durumda, konakçı hücre aktivasyonunu direnç göstermek için önemli parazit genler de enfeksiyon sırasında, in vivo olarak kist üretiminde doğrudan veya dolaylı olarak bir rol oynuyor olabilir.

Toxoplasma gondii (T. gondii) zorunlu hücre içi, protozoa patojendir. Bu toksoplazmozis etkeni, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde bir sağlık tehlikesi olduğunu. Ayrıca Cryptosporidium ve Cyclospora dahil insanları enfekte diğer apicomplexan patojenlerin model sistemidir. Toksoplazmozis en yaygın parazit bradyzoite veya Ookist sahne ile kontamine yiyecek veya su yenmesi yoluyla elde edilir. Yemeye bağlı olarak bu aşamalar konakçı hücreler içinde replike ve sistematik olarak yaymaktadır parazitin tachyzoite aşamasına dönüştürün. T-hücreleri, IFN-γ ve daha az bir ölçüde, nitrik oksit 1-4&#39;e, enfeksiyonun kontrol edilmesi için önemlidir, ancak takizoit bir bölümü olarak, hastalık yok etme yeteneğine sahip değildir doku kistlerinin içinde korunur bradyzoite aşamasına dönüştürmek Uzun ömürlü bir kronik enfeksiyon ile sonuçlanır. Aslında, hiçbir terapötik kronik kist s karşı etkili vardırHastalığın tage. Şiddetli toksoplazmozis birincil ve akut enfeksiyon hızla kopyalayan tachyzoite sahne özelliğine geri dönüştürme parazitin bradyzoite aşamasına nedeniyle kalıcı enfeksiyon reaktivasyonuna en sık olduğunu. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının karşısında Erken yaşam parazit yeterli parazit numaralarını ulaşmak için, yanı sıra kronik enfeksiyon kurulmasını sağlamak için, uzak sitelere ulaşmak için izin önemlidir. T. gondii olasılıkla çoğaltmak ve enfeksiyon erken yaymak için onun yeteneğine katkıda konak savunma mekanizmaları ile mücadele stratejilerini gelişti. İlk olarak, T. gondii diğer hücre içi patojenlere 5-9 kıyasla konak hücrenin endositik ve ekzositik süreçler büyük ölçüde ayrılmış olan parazit işgali sırasında benzersiz bir PV oluşturur. Ayrıca, tüm başarılı hücre içi patojenler T. gibi gondii f hoşgörülü bir ortam yaratmak için konak hücreye değiştirirya da büyüme. Bu hücre aktivasyonunu 10-15 düzenleme için önemli olanlar da dahil olmak üzere, konakçı hücre transkripsiyon faktörlerinin değiştirerek yeniden programlama konakçı hücre gen ekspresyonunu içerir. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21 ve GRA24 22 tüm T ile enfekte olmuş konakçı hücrelerin kaskadlar transkripsiyon yanıtı düzenlemek ve hücre sinyal önemli olduğu gösterilmiştir gondii. Farklı fenotip ile parazit suşları arasındaki genetik haçlar kullanarak Son çalışmalar bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) 16,19,23-26 kaçırma da dahil olmak üzere parazit genotip-bağımlı özellikleri altında yatan parazit genlerin belirlenmesi oldukça verimli olmuştur. Çok virulent Tip I genotip sıçangil IRGS kaçınmak için mekanizmalar geliştirmiştir ise farelerde, bağışıklıkla ilgili GTPazlar (IRGS) Tip II ve kontrol parazit III genotip için önemlidir. Ancak, parazit antimikrobiyal medya kaçmasına mekanizmaları gelişti olduğu da açıktırbu mekanizmaların bazıları IRGS ve buna ek olarak ları parazit genotipleri 27,28 boyunca muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, çok az T. karşı hücre otonom bağışıklık kritik aracılarının hakkında bilinen İnsan toksoplazmozis sırasında gondii. Tachyzoite konukçu bağışıklık yanıtları ile tetiklenebilir dönüşüm bradyzoite için sırasında hücre otonom bağışıklık aracılarının direnç için önemli bir Parazit genler de hayatta kalmak için önemli olabilir. Örneğin, yüksek düzeyde nitrik oksit edilen enfekte olmuş makrofaj parazit kopyalanmasını bastırdığı, ancak, aynı zamanda kist üretimi 30-32 sonuçlanan dönüşüm bradyzoite için tachyzoite uyarabilir. ToxoDB T. için fonksiyonel bir genomik veritabanı gondii o topluluk açıklamaları da dahil olmak üzere yayınlanmış ve yayınlanmamış genomik ölçekli veri dizisi parazit genomunun için bilgi ve erişim sağlanması açısından alan için kritik bir kaynak olarak işlev, gen exp<html> ression ve proteomik verileri 33. Birçok Protozoal patojenlere benzer, genomun çoğunluğu potansiyel fonksiyonları içgörü sağlamak için gen homoloji dayalı hiçbir bilgi varsayımsal genlerin oluşur. Böylece, ileri genetik bağışıklık kaçırma, kist dönüşüm ve parazit patogenezinde yanı sıra farklı gelişim evreleri arasındaki dönüşüm için kritik diğer işlevler için önemli yeni parazit genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ileri genetik ek kuvveti bağışıklık kaçırma ve kist oluşumuna sahip patojenezindeki özgül görevler için önemli olan genler için bir parazit sorgulamak için göreceli olarak önyargılı bir yaklaşım olarak kullanılabilir olmasıdır. Mutasyon profil için yeni nesil dizileme son gelişmeler kimyasal ve sokma hem mutajenezin 34-37 kullanarak ileri genetik çalışmalar sorumlu parazit genlerin belirlenmesi için seçim yöntemi yaptık. ntent &quot;&gt; Özellikle de dirençli kist aşamasında karşı aktif olabilir bu. Bu amaçla doğru, in vitro kemirgen parazite karşı hücre özerk bağışıklık mekanizmalarının etkinliğini artırmak için kullanılabilir T. gondii güvenlik açıklarını tespit etmek önemlidir makrofaj enfeksiyonu ve aktivasyon modeli, özellikle saf makrofajlarda edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu, ancak şu T. gondii, uygunluk olumsuz parazit mutasyonlara tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir. Bu makrofaj ekran için T. gondii, sokma mutantlan bir kütüphane sorgulamak için kullanılmıştır, sonuçta nitrik oksit 27,28 direnç için önemli bir T. gondii, genlerin belirlenmesi. enfekte makrofajlar, nitrik oksit, özellikle belirgin bir duyarlılık aktivasyonuna bozulmuş dirençli T. gondii, mutantlarının bir panelinin izolasyon, tespit için ekranın yardımcı oldu direnç için önemli parazit genlerkemirgen IRGS 28 için açıklanan direnç mekanizmaları dışında diğer hücre özerk bağışıklığın arabulucular için. Araya sokulan mutajenez teorik olarak rastgele her paraziti klonu mutasyonlar ve mutasyon site daha kolay tanımlama sınırlı sayıda üretilmesi açısından kimyasal mutagenez fazla avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, T plasmid ekleme genomik yerinin tanımlama gondii sokma mutantlan, uygulamada, bir çok durumda 37 şaşırtıcı bir şekilde zor olmuştur. Bir genin bir plasmid yerleştirilmesi aynı zamanda, tipik olarak, tek nükleotid değişiklikleri ile sonuçlanan kimyasal mutagenez aksine bir genin işlevini bozması muhtemeldir. Birden fazla tek nükleotid polimorfizmini oluşturur Ancak, kimyasal mutagenez, N-etil-N-nitroso üre (TRK) ya da etilmetan sülfonat (EMS) ya sahip (araya sokulan mutajenez ile karşılaştırıldığında, parazit genomunun büyük bir kısmının, daha yüksek bir yetenek sunabilir mutant 34 başına 10 -100) tahmin, 38. Ayrıca, tüm genom profili son gelişmeler mümkün mutasyona uğramış bir parazitin 34,38 tanımlanmış fenotip sorumlu en olası aday genleri tanımlamak için yeni nesil sıralama kullanmaya yaptı. Ne olursa olsun mutagenez yaklaşımı, makrofaj aktivasyonu direnç parazit geninin rolü onay sonuçta moleküler Koch önermeleri yerine getirmek için gen silme ve tamamlanmasını gerektirir. parazit ve makrofaj hem genetik manipülasyonu vasıtasıyla bir genin işlevini incelemek yeteneği T. ileri genetik ile tanımlanan genlerin çoğu önemlidir gondii, hem de diğer patojenler halen bilinen fonksiyonlar ile başka proteinler için bir dizi homolojisi için çok az varsayımsal genler olarak karakterize edilir. Bu yazı, bir mutant içinde kesintiye uğramış gen, bir bilinen ya da direnç için önemli olup olmadığını tespit etmek için kullanılabilir, genel bir yaklaşımın ana hatlarıHücre özerk dokunulmazlık bilinmeyen aracısı. Ev sahibi antimikrobik faktörler ilk analiz, vahşi tip ve uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS), gp-91 pHOx (NADPH oksidaz) özel gen silme olanlara karşı vahşi tip farelerden makrofajlar mutant parazitlerin yaşam değerlendirilerek yapılır ve Belirli bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS). Belirlenen parazit genler nitrik oksit, reaktif oksijen ara veya bağışıklıkla ilgili GTPases 28 sırasıyla veya bilinmeyen bağışıklık mekanizması dahil olup olmadığını direnç için önemli olmadığını gösterecektir. Mevcut protokolde tarif edildiği, IFN-γ ve LPS, her iki ile enfekte makrofajlar, aktivasyonu, öncelikle nitrik oksidin 28 direnç için önemli parazit genin izolasyonu ile sonuçlanır. makrofaj aktivasyonunun yokluğunda nitrik oksit neden farmakolojik ajan (nitrik oksit donörleri) tarafından tanımlanan genlerin çoğu yeniden önemli olduğunu gösterdinitrik oksit yerine makrofaj aktivasyonu 28 ile ilişkili ek arabulucular ile uyum içinde nitrik oksit direncin. Bir ve iki in vitro enfekte olmuş kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonu takiben spor defektli parazit mutantlarını izole etmek için tasarlanmış bir ön genetik ekran tarif Adım. Bir parazit, çoğaltma azaltır, ancak tam olarak vahşi tip T replikasyonunu inhibe etmez makrofaj aktivasyonu için kullanımı deneysel olarak IFN-γ ve LPS&#39;nin dozu belirlemek için bir doz titrasyon analizi tarif Adım Parazit mutantların kütüphanenin oluşturulması için kullanılan gondii ebeveyn suşu. İkinci adım 96 oyuklu plakalar içinde makrofajlar mutant klonların ileri genetik ekran tarif etmektedir. Üçüncü adım, her mutant kusur parazit yaşam etkileyip etkilemediğini, çoğaltma değerlendirmek ve 96 gözlü levhalar bir taramada tespit edilen her bir mutantın fenotipi teyit etmek için bir yaklaşım anahatlarımakrofaj aktivasyonuna karşılık olarak ya da kist üretimi. Dördüncü adım, parazit mutan özellikle hassas olan bağışıklık mediatörleri tanımlamak üzere, belirli antimikrobiyal yollarındaki delesyonu olan farelerin kemik iliği türevli makrofajlar kullanımını tarif eder. Adım beş enfekte farelerin beyinlerinde kist üretiminin tarafından değerlendirilir gibi bir parazit mutant da in vivo patogenezinde tehlikeye olup olmadığını belirlemek için bir yaklaşım özetlemektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29101&amp;amp;productId=3255471&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=11737973&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>Thermo</td><td>SH3002802&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2434305&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType&lt;br/&gt; =PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>SH3003401&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=3311957&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType&lt;br/&gt; =PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Pen strep</td><td>Thermo</td><td>SV30010&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&amp;amp;productId=1309668&lt;br/&gt; 6&amp;amp;catalogId=29104&amp;amp;matchedCat&lt;br/&gt; No=SV30010&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;&lt;br/&gt; searchKey=SV30010&amp;amp;highlightPro&lt;br/&gt; ductsItemsFlag=Y&amp;amp;endecaSearch&lt;br/&gt; Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&amp;amp;xrefPartType=From&amp;amp;savings= 0.0&amp;amp;xrefEvent=1407777949003_0&lt;br/&gt; &amp;amp;searchType=PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Thermo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=3064595&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>LPS</td><td>LIST biologicals</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&amp;amp;product_id=81&amp;amp;keywords&lt;br/&gt; =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td></tr><tr><td>IFN-&amp;#947;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail=&#039;item&#039;&amp;amp;storeId=10652&amp;amp;&lt;br/&gt; productId=2988494&amp;amp;catalogId=29&lt;br/&gt; 104&amp;amp;matchedCatNo=50813664&amp;amp;&lt;br/&gt; fromSearch=1&amp;amp;searchKey=murine+ifn+pepro+tech&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&amp;amp;xrefPartType=From&amp;amp;savings&lt;br/&gt; =0.0&amp;amp;xrefEvent=1407778210608_&lt;br/&gt; 12&amp;amp;searchType=PROD&amp;amp;hasPromo&lt;br/&gt; =0</td></tr><tr><td>Chamber slides</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2164545&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>96-well optical plates</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=3010670&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=3158736&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Tissue culture flast T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&amp;amp;productId=127039&lt;br/&gt; 67&amp;amp;catalogId=29104&amp;amp;matchedCat&lt;br/&gt; No=12565351&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;&lt;br/&gt; searchKey=156367&amp;amp;highlightProdu&lt;br/&gt; ctsItemsFlag=Y&amp;amp;endecaSearchQu&lt;br/&gt; ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&amp;amp;xrefPartType=From&amp;amp;savings&lt;br/&gt; =0.0&amp;amp;xrefEvent=1407778974800_&lt;br/&gt; 0&amp;amp;searchType=PROD&amp;amp;hasPromo&lt;br/&gt; =0</td></tr><tr><td>Ted Pella EM grade formaldehyde</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=3425922&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=1</td></tr><tr><td>Alexa 488 - protein conjugation kit</td><td>Life Technologies</td><td>A20181</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td></tr><tr><td>goat serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2133236&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;crossRefData&lt;br/&gt; =ICN19135680=2&amp;amp;searchType&lt;br/&gt; =PROD&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Vectashield mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>FITC-conjugated dolichos</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>Antibody to LAMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>C57BL6 mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td></tr><tr><td>gp91 phox knock out mice</td><td>Jackson Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>iNOS knock out mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2609</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td></tr><tr><td>sodium nitroprusside</td><td>ACROS Organics</td><td>AC21164-0250&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2627727&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;catalog&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2252389&amp;amp;dis&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; =Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; PROD&amp;amp;hasPromo=1</td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

forward genetics screens using macrophages to identify toxoplasma gondii genes important for resistance to ifn-&#947;-dependent cell autonomous immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Toxoplasma gondii naif makrofajlar serbestçe çoğaltır ve 6-12 saat parazit suşu bağlı arasında iki katına zaman vardır. 1 aktif kemik iliği kökenli makrofajlar karşı naif temsilcisi parazitleri göstermektedir. Şekil 2 HFF parazitlerin genel morfolojisi gösterir 2, 4, 8, 16 ve 32 parazitler / PV hücreler ev sahipliği. Mevcut protokolde, parazit naif makrofajlar istila ve enfekte makrofajlar için güçlü aktivasyon uyaran, LPS ve IFN-teslim öncesinde doğmakta parasitophorus çarpıtma (PV), kurmak için izin verilir. Bu modelde, vahşi tip parazitler replikasyon geciktirilir, fakat parazitin çoğaltma hala makrofajlar parazit replikasyonunun engellenmesi gittikçe daha usta ve bu süre içinde yaklaşık 24 saat süreyle devam eder. Ekran güçlü makrofaj a için gerekli zaman arasında bir modifiye rekabet modeli olarak işlev için tasarlanmıştırvahşi tip parazit veya parazit mutant kendi PV içinde çoğaltmak devam edebilirsiniz sırasında zamana karşı ctivation. Ekranın ilk adım LPS&#39;nin bir doz seçmek ve IFN-y edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu için kullanılacak γ. Doz deneysel LPS bir konsantrasyon aralığı veya IFN-y konsantrasyonu (Aşama 1) &#39;in bir dizi LPS&#39;nin sabit bir dozu ile kombinasyon halinde IFN-γ sabit bir doz ya aktive edilmiş makrofajlarda parazit çoğaltma değerlendirilmesiyle belirlenir. Aktivasyon uyaranların doz kimyasal veya araya sokulan mutajenez sayesinde parazit mutantlarının oluşturulması için kullanılan ebeveyn doğal tip parazitler için değerlendirilmesi gerekir. İdeal LPS ve IFN γ dozu saf makrofajlar PV başına 8-16 parazitler ile karşılaştırıldığında aktivasyon sonrasında PV 24-30 saat başına 2-8 parazitlerin ortalama parazit çoğaltma izin verecektir (Şekil 1 ve 2). LPS ve IFN-y ve uygun bir konsantrasyonda bir kez ^7; tespit edilir, mutantlar, 96 oyuklu bir optik tabanlı doku kültür plakaları içinde taranır. Geleneksel doku kültürü plakaları için kullanılan plastik düzensizlikler zor faz kontrast ve floresan mikroskobu ile parazitleri ekrana uygun çözünürlük elde etmek yapar çünkü plakalar optik alt önemlidir. 96 oyuklu plakalar faz kontrast ve floresan mikroskobu faz kontrast 4, uzun çalışma mesafesi için donatılmış 10, 20 ya da 40x objektif ile bir ters flüoresan mikroskop gerektirir. Mutantlar fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içeren kopya plakalarda taranır. Parazit mutantları ile meydan okuma sonra, tek bir levhanın gözleri içine enfekte makrofajlar enfekte makrofajlar içeren diğer levha yalnızca D10 ortamında kültürlenmiştir ise LPS ve IFN-γ ile aktive edilir. Plakalar, LPS ve IFN-y γ ilavesinden sonra 24-30 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 ile kuluçkalanır. İnkübasyondan sonra, hücreler, fi olarakxed, parazitler için lekeli ve floresan ve faz kontrast mikroskobu hem kullanılarak IFA tarafından analiz. Mutantlar, normal parazit numaraları ve naif makrofajlarda çoğaltma ama daha az parazit veya aktive enfekte makrofajlar daha az parazit ile küçük vakuoller var seçilir. Mutantlar daha yüksek büyütme parazit morfolojisi analizi (100X objektif ve yağ) etkinleştirmek için ve onlar naif makrofajlar normal çoğaltma olduğunu onaylamak için iki bağımsız deneylerde makrofajlar naif olarak oda slaytlar (Adım 3) içinde tekrar elenebilir ve aktif edilmelidir seçildikten sonra ancak çoğaltma / hayatta kalma bir kusur makrofaj aktivasyon takip. Enfekte makrofajların aktivasyonu direnç kusurların ile mutantlar fenotipleri genellikle iki geniş kategoriye ayrılır: morfolojik sağlam görünen, fakat PV başına tek bir parazitin ötesine çoğaltmak mümkün olan parazitler; ve görünen parazitler degrad edilecekEd ve amorf geniş PV&#39;lerinin (Şekil 1 ve 3) olabilir. morfolojisi ve parazit ince yapısı ve PV iyi bir 100X objektif ve yağ kullanarak slaytlar ve floresan analizleri ile birlikte faz kontrast mikroskobu ile görülüyor. Lızozomal bağlantılı membran proteini-1 (LAMP1) için bir antikor ile IFA için parazitlerin boyama mutant kusur lizozomlar ile füzyonu önlemek için PV bir yetersizlik ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için faydalıdır. Konak hücrenin (LAMP1 negatif) olarak endositik sisteminden büyük ölçüde ayrılmış olan bir PV olan bir parazit karşı bir phagolysosome (LAMP1 pozitif) içinde bir parazit Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. phagolysosome tüm parazit çevresinde gergin LAMP1 sürekli bir katı ağız ile belirgindir. Buna karşılık, bir PV genellikle yakın lizozom organellere ancak çevresinde LAMP1 boyama herhangi bir sürekli çevre kenarına sahip bulunmaktadır. t tanımlanan yapıları / organellere antikorların kullanımıO asalak ve / veya PV edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu ile bağlantılı her mutant anormallikleri tanımlamak için IFA çalışmaları takip yararlıdır. Antikorlar ile bu tür sorgulama bir mutant çoğaltma / hayatta kalma kusur altında yatan mekanizmaları içgörü sağlayabilir. Örneğin, Şekil 5, T. gösterir gondii mitokondri monoklonal antikor 5F4 anti-F1 ATPaz p alt-birimi (Peter Bradley bir tür hediye) vahşi tip parazit veya parazit mutantları ile enfekte olan makrofaglar ve aktive edildikten sonra, 24 saat ile boyanmıştır. T Toxoplasma gondii, bir monoklon anti-T ile birlikte lekeli gondii antikor. Yabani tip T. gondii parazitin çevresi etrafında uzanan tek bir mitokondri sahiptir. enfekte makrofajlar aktivasyonu takip vahşi tip parazitler de parazitin tek mitokondri mutant parazitler bir parçalanmış mitokondri kıyasla sağlam oldu. Mitokondri parçalanma değil, sadece bozulmuş / amorf belirgindiparazitler aynı zamanda faz kontrast mikroskobu ile değerlendirildi normal morfoloji görüntülenen parazitler. Bu parazit mutant kusur makrofaj aktivasyonu ile uyarılan hücre mediatörleri barındırmak için parazit mitokondri duyarlılığını artırmak olabileceğini düşündürmektedir. şimdiki model enfekte makrofajlar etkinleştirmek için IFN γ ve LPS bir kombinasyonunu kullanır. IFN-γ transkripsiyon faktörü STAT1 uyarır. LPS, TNF-α gibi, transkripsiyon faktörü NF-KB uyarır. T. karşı hücre özerk bağışıklığın önemli bağımlı antimikrobiyal arabulucular γ Bilinen IFN gondii diğer ajanların yanı sıra, bir IFN-γ-bağımlı bağışıklık ile ilgili GTPazlar dizisini (IRGS, Gbps) ve reaktif nitrojen ve oksijen türlerini içerir. Olmadığını belirlemek için, her mutant kusur özellikle -inducible antimikrobiyal aracıların γ bilinen IFN-y üretimi ile ilişkilidir, kemik iliği türevli makrofajlar izole edilmiştirİNOS - / -, gp 91 pHOx - / - ya da belirli bir IRG / GBP geni silinmiş fareler ve mutant parazitlere karşı aktivitesi için deneye tabi tutuldu. enfekte makrofajlar etkinleştirmek için IFN γ ve LPS kombinasyonu tercihen vahşi tip 28 parazitleri göre nitrik oksit gelişmiş duyarlılık ile mutantlar sonuçlanır. Enfekte makrofajların aktivasyonu takizoit doku kistlerinin içerdiği bradizoitlerinin ortalama ile parazitlerin sahne farklılaşmasını neden olabilir. Bu tür kistler, kronik enfeksiyon karakteristiktir. Böylece, virüslü makrofajların aktivasyonu aşağıdaki çoğaltma / hayatta kalmak için kusurlu parazit mutantlar da in vivo enfeksiyon sırasında kist dönüşüm için arızalı olabilir. Kronik enfeksiyon sırasında kist değerlendirilmesi için, fareler, ebeveyn parazit soyunun bir öldürücü olmayan dozun ya da mutant klonu ile karın içinden (ip) olarak zorlanmaktadır. Daha az 10 boyutta beyin aralığında Kistler _6;. Daha büyük 50 um m çapında Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi IFA hem büyük ve küçük kistlerin sayısını ama parazit mutant toplam kist üretimi için ya da sadece kurulması için bozulmuş ise sayıları belirlemek için ayrı tutmak Büyük kistlerin ve bakımı. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig1.jpg" /> Şekil 1. Saf fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar T. replikasyonuna izin vardır Toxoplasma gondii, ancak IFN-γ ile aktivasyonu ve LPS ile esas olarak replikasyonunu inhibe eder. (A), yabani tip T bir parasitophorous vacuole&#39;nin (PV) gondii 24 naif fare kemik iliği kökenli makrofajlar işgalinden sonra saat. (B) vahşi tip T. PV gondii enfekte makrofajların aktivasyonu sonrası vakuol 24 saat başına dört parazitlerin oluşan paraziti.(C) bir parazit / PV edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu 24 saat sonra hala replike olamıyorsa, ve bir mutant parazit örneği. (D), enfekte olmuş makrofaj aktive edildikten sonra amorf bir PV, 24 saat içinde bozulmuş görünür bir mutant parazitin örneği . Üst satır parazitlerinin faz görüntüler gösterir ve alt sıra T. karşı bir poliklonal anti-serumu kullanarak floresan görüntüleri gösterir gondii. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig2.jpg" /> Şekil 2. Parazit çoğaltma PV toplam parazit sayısı değerlendirilmiştir. Resim 2, 4, 8, 16 ve HFF hücreleri içinde PV başına 32 parazitleri göstermektedir. Her resim bir birleştirilmiş faz görüntüsü thkırmızı parazit ve mavi (DAPI) içinde HFF çekirdeğin poliklonal antikor boyama gösterir. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig3.jpg" /> Şekil 3. mutantlar edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu takiben fenotiplerin bir sırasını gösterir. Sol kolon makrofajlarda parazitin bir faz görüntüsüdür, merkez kolon T. bir antikor kullanılarak floresan görüntü gondii ve sağ sütun faz ve floresan görüntünün bir birleştirme olduğunu. Parazit, yeşil ve mavi makrofaj çekirdeğinde gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig3large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig4.jpg" /> Şekil 4. LAMP1 boyama phagolysomes içeren parazitler PV&#39;lerin ayırır. Parazitler bir poliklonal anti T. ile boyanır mAb 1D4B (yeşil) ile gondii antikoru (kırmızı) ve LAMP1. Bir ok lizozomlardan ile kaynaşmış olan bir parazit PV işaretler. ok olmadan parazit lizozomlardan ile kaynaşmış olan bir parasitophorous vacuole&#39;nin (PV) bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig5.jpg" /> Şekil 5. Yabani tip parazitler mitochondri ise sağlam bir mitokondri korumakEnfekte makrofajların aktivasyonu takip parazit mutantlar parçalanır üzerinde. Üç farklı mutant T. ile karşılaştırıldığında vahşi tip parazitler de mitokondri (yeşil) (üst panel) gondii bozulması (alt üç panel) farklı aşamalarında edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu 24 saat sonra parazitleri. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52556/52556fig6.jpg" /> Lektin biflorus FITC-konjuge Doliços kullanarak beyinde parazit kist Şekil 6. Algılama. Lektin ile etiketlenmiş kist duvarı yeşil gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52556/52556fig6large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın n.

Watch this Scientific Journal Video about Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-Î³-Dependent Cell Autonomous Immunity at JoVE

IFN-γ Bağımlı Hücre Otonom Bağışıklığına Direnç için Önemli Toxoplasma gondii Genlerini Tanımlamak İçin Makrofajları Kullanan İleri Genetik Taramalar | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

forward-genetics-screens-using-macrophages-to-identify-toxoplasma

Nanyang Technological University

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Unit 2

Population Genetics

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K Görüntüleme.  New York Medical College. Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion. 

Video: Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genetik

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have been limited compounds available so far to attenuate TLR signaling and there have been no clinically approved TLR inhibitors (except the anti-malarial drug hydroxychloroquine) in clinical use. In light of rapid advances in nanotechnology, manipulation of immune responsiveness using nano-devices may provide a new strategy to treat these diseases. Herein, we present a high throughput screening method for quickly identifying novel bioactive nanoparticles that inhibit TLR signaling in phagocytic immune cells. This screening platform is built on THP-1 cell-based reporter cells with colorimetric and luciferase assays. The reporter cells are engineered from the human THP-1 monocytic cell line by stable integration of two inducible reporter constructs. One expresses a secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) gene under the control of a promoter inducible by the transcription factors NF-&#954;B and AP-1, and the other expresses a secreted luciferase reporter gene under the control of promoters inducible by interferon regulatory factors (IRFs).Upon TLR stimulation, the reporter cells activate transcription factors and subsequently produce SEAP and/or luciferase, which can be detected using their corresponding substrate reagents. Using a library of peptide-gold nanoparticle (GNP) hybrids established in our previous studies as an example, we identified one peptide-GNP hybrid that could effectively inhibit the two arms of TLR4 signaling cascade triggered by its prototypical ligand, lipopolysaccharide (LPS). The findings were validated by standard biochemical techniques including immunoblotting. Further analysis established that this lead hybrid had a broad inhibitory spectrum, acting on multiple TLR pathways, including TLR2, 3, 4, and 5. This experimental approach allows a rapid assessment of whether a nanoparticle (or other therapeutic compounds) can modulate specific TLR signaling in phagocytic immune cells.

Toll-like receptor (TLR) signaling plays an important role in the pathophysiology of many human inflammatory diseases, and regulating TLR responses by bioactive nanoparticles is anticipated to be beneficial in many inflammatory conditions. THP-1 cell-based reporter cells provide a versatile and robust screening platform for identifying novel inhibitors of TLR signaling.

Toll benzeri Reseptör Sinyali Önleyicileri İçin Fagositik Bağışıklık Hücrelerinde Biyoaktif Nanopartiküllerin Taranması

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

Tıp

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are limited. In addition, they exhibit adverse side effects in certain groups of people. Therefore, discovery of novel therapeutics for clinical toxoplasmosis is imperative. The first step of novel antibiotic development is to identify chemical compounds showing high efficacy in inhibition of parasite growth using a high throughput screening strategy. As an obligate intracellular pathogen, Toxoplasma can only replicate within host cells, which prohibits the use of optical absorbance measurements as a quick indicator of growth. Presented here is a detailed protocol for a luciferase-based growth assay. As an example, this method is used to calculate the doubling time of wild-type Toxoplasma parasites and measure the efficacy of morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl (LHVS, a cysteine protease-targeting compound) regarding inhibition of parasite intracellular growth. Also described, is a CRISPR-Cas9-based gene deletion protocol in Toxoplasma using 50 bp homologous regions for homology-dependent recombination (HDR). By quantifying the inhibition efficacies of LHVS in wild-type and TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficient parasites, it is shown that LHVS inhibits wild-type parasite growth more efficiently than &#916;cpl growth, suggesting that TgCPL is a target that LHVS binds to in Toxoplasma. The high sensitivity and easy operation of this luciferase-based growth assay make it suitable for monitoring Toxoplasma proliferation and evaluating drug efficacy in a high throughput manner.

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Presented here is a protocol to evaluate the inhibition efficacy of chemical compounds against in vitro intracellular growth of Toxoplasma gondii using a luciferase-based growth assay. The technique is used to confirm inhibition specificity by genetic deletion of the corresponding target gene. The inhibition of LHVS against TgCPL protease is evaluated as an example.

Luciferase Tabanlı Büyüme Testini Kullanarak Hücre İçi Toksoplazma Gondii Büyümesine Karşı Kimyasal Inhibitör Verimliliğin Belirlenmesi

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler