Name: voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연​​구 개발 기금에 의해 지원되었다.

1. 솔루션 준비 <ol><li> 노르 에피네프린 (NP) 솔루션 <ol><li> . 정제 밀리-Q (MQ) 물 25 ㎖에 30 mM의 아스코르브 산 (0.1475 g의 아스코르브 산 25 ml의에 순이익 40 mg을 녹이고 노르 에피네프린 (NP)은 민감한 빛 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터 NP 용액 필터. -20 ° C에서 1 ml의 멸균 마이크로 튜브에 솔루션 및 저장 나누어지는. 냉동 후에, NP는 한 달 동안 안정하다. </li></ol></li><li> 보충 세척 및 최종 Claycomb 미디어 <ol><li> Claycomb 매체 43.5 ㎖로 시작하여 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖, 페니실린 / 스트렙토 마이신을 0.5 ㎖, NP 0.5 ㎖의 1로 보충 : 최종 보충 Claycomb 배지 50 mL로 L 글루타민 희석 100. Claycomb 매체가 빛에 민감하기 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오. </li><li> 한모금과 동일한 조리법을 사용하여 세척 Claycomb 매체를 준비제외 대상으로 실시 Claycomb 매체는 5 % FBS를 추가하고 NP 및 L 글루타민 요소를 생략. 참고 : 직사광선에 노출하지 않고 4 ℃에서 저장 될 때 보충 최종 워시 Claycomb 미디어는 2 주 동안 좋다. </li></ol></li><li> 콩 트립신 억제 솔루션 <ol><li> 칼슘 - 무료 및 마그네슘이없는 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎖ (PBS)로 대두 트립신 억제제의 25 mg을 녹인다. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터. 참고 : 4 ° C에서 저장 될 때 멸균 솔루션은 1 개월 안정적이다. </li></ol></li><li> 젤라틴 / 피브로넥틴 요리 코팅 용액 <ol><li> 0.02 % 젤라틴 있도록 MQ 물 500 ㎖ 중에 젤라틴 0.1 g을 녹이고. </li><li> 오토 클레이브 후, 0.02 % 젤라틴 199 ㎖ 중에 1 ml의 피브로넥틴을 희석하고 부드럽게 혼합한다. </li><li> 나누어지는 -20 ° C에서 젤라틴 별도의 튜브에 솔루션 및 저장의 6 ml의. </li></ol></li><li> 행크스 &#39;소금 솔루션 <ol><li> 파문을 사용하여판은, 염화나트륨 (136.9)의 KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0.4409)의 NaH 2 PO 4 (0.4000), 황산 (0.8142), D-Glc를을 MQ 물 (밀리몰 / L)에 다음과 같은 염을 용해 (5.051)의 NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), 염화칼슘 2 (1.261). </li></ol></li><li> 칼슘에 민감한 염료 (Rhod2) 솔루션 <ol><li> Rhod2는 -20 ° C에서 원액 저장을 염색 할 DMSO 20 % 플루로 닉 F-127의 400 μL에 Rhod2 건조 분말 1 mg을 희석. </li><li> 실험을 시작하기 전에 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 1000 행크스 &#39;소금 용액이 원액 1을 희석. </li></ol></li><li> 전압에 민감한 염료 (Rh237) 솔루션 <ol><li> -20 ° C에서 원액 및 저장을 할 DMSO 2 ㎖로 Rh237 5 ㎎을 희석. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 용액을 만들기 위해 1000 행크스 식염수 : 원액 1 희석. </li></ol></li></ol> &amp; #(160); 참고 : 1-4 솔루션은 약간의 수정과 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜을 기반으로합니다. 2.과 Passaging 및 배양 HL-1 심방 근육 세포 Coverslips는 상 참고 : HL-1 세포 박사 Claycomb (루이지애나 주립 대학)에서 얻을 수 있습니다. <ol><li> T25 플라스크에 HL-1 세포 성장과 매일 보충 Claycomb 중간의 5 ml로 공급. 통로는 T25에서 세포 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜 (후술) (10)에있어서 5 일마다 형틀. </li><li> 24 시간 T25 플라스크에서 세포 전에 12-well 배양 판에 장소 라운드 된 커버 (20mm 직경) 계대 배양 한 다음 37 ℃에서 하룻밤 젤라틴 / 피브로넥틴로 된 커버를 커버 할 완전히 합류와 준비가되어 있습니다. </li><li> 다음 날, 기음과 문화 판에서 젤라틴 / 피브로넥틴을 취소하고 잘 각각 보충 최종 Claycomb 매체의 1.5 ml로 교체합니다. </li><li> T25의이 배양에서 분할 세포대기음이 합류 문화를 포함하는 T25 플라스크 매체는 37 ° C에서 PBS 짧게 문화를 씻어 하루 5에서 전체 합류에 도달 한 후 전자 플라스크. </li><li> PBS 및 기음 셀과 직접 접촉을 피하기 위해 T25 플라스크의 바닥에 트립신 / EDTA를 피펫 팅하여 37 ° C에서 3 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가한다. 1 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 흡인에 의해 트립신 / EDTA를 제거하고 T25 플라스크 당 다른 트립신의 1.3 ㎖ / EDTA를 추가합니다. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 현미경으로 검사하고 세포가 여전히 플라스크에 부착하는 경우, 완전히 남아있는 세포를 이동시키다 누릅니다. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리 관으로 플라스크에서 세포와 세포를 전송에 대두 트립신 억제제의 1.3 ML을 추가합니다. 워시 Claycomb 매체의 5 mL를 빈 플라스크를 씻어. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포에 린스를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 기음과 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 다시 중단보충 최종 Claycomb 배지 6 ㎖ 중의. </li><li> 세포 계대의 세포 현탁액 0.5 ml로 12- 웰 플레이트의 각 웰을 시드. 매일 신선한 보충 최종 Claycomb 매체와 세포를 공급. 주 : 밀접 세포의 성장을 모니터링 전형적 세포 단층을 4 일째에 합류 상태에 도달하고 자발적인 활동이 계속 표시. 이후, 배양 된 단층은 하루 4-5 광학 매핑을위한 준비가 될 것입니다. </li></ol> 셀 3.로드 칼슘 및 전압에 민감한 염료 <ol><li> 광학적 맵핑 연구 부드럽게 12 웰 세포 배양 플레이트로부터 커버 슬립을 제거하고 행크스 식염수로 세정. </li><li> 칼슘 민감성 염료 Rhod2으로 세포를 염색하기 위해, 3 ㎖와 커버 슬립에서 세포 단층을 부화 산소를 30 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 Rhod2 작업 용액 (5 % CO 2 / 95 % O 2 가스로 버블 링) . </li><li> V m에 민감한 염료와 세포를 얼룩Rh237는 또 다른 15 분 동안 수조에서 37 ° C에서 산소화 Rh237 작업 용액 3 ㎖에 Rhod2로드 셀 단층 몰입. </li></ol> 4. 듀얼 채널 광학 매핑 <ol><li> 거꾸로 형광 현미경에 순환 챔버로, V의 m과 칼슘 염료로 두 번 스테인드 세포 단층을 놓습니다. 35 ± 1 ℃에서 셀 챔버의 온도를 유지하기 위해 가열 된 순환 시스템을 사용한다. 챔버에 걸쳐 조심스럽게 0.3 ° C의 구배를 방지하기 위해 상기 챔버를 통해 순환하는 흐름의 속도를 조절하여 관류 액의 온도를 제어한다. <ol><li> V의 m / CA 신호를 기록하기 전에, 이전의 염색 공정에서 잔존 염료를 제거하기 위해 약 5 분 동안 신선한 행크스 용액으로 세포 단층을 세척한다. </li></ol></li><li> 행크스 염 용액과 SILV 가득 유리 피펫으로 이루어지는 쌍극 전극을 이용하여 페이스 건강한 세포 단층어 이전으로 피펫 팁 주위 코일 와이어 12,17 설명했다. </li><li> 약 1 MV를 서성 거려 임계 값을 기대 2 밀리의 200 ~ 500 밀리 초 펄스 폭의 사이클 길이의 페이스 건강한 세포 단일 층. 주 : 단층 배양의 각 배치에 대해 적어도 2 개의 비 처리 된 단층은 셀 배치의 조건을 검사하는 데 사용되어야한다. 건강한 제어 단일 층은 200 ~ 500 밀리의주기 길이에 전기 페이싱에 의해 포착 할 수 있어야합니다. 제어 단층 전기적으로 진행되어야하지 않으면,이 셀 전체 일괄 광학적 맵핑 실험에 적합하지 않을 수 있다는 것을 시사한다. </li><li> V의 m 및 CA 민감한 염료 모두를 여기 시키는데, 여기 필터 (파장 510 ㎚ / 40) 및 다이크로 익 미러 (561 ㎚)과 결합 된 LED 광원 (520 nm 파장)를 사용한다. <ol><li> V m을 구성 요소로 다이크로 익 미러 (594 ㎚)과 칼슘 성분과 40X 목표 및 분할을 통해 세포에 의해 방출되는 형광 신호를 수집합니다.대역 통과 필터와 칼슘 채널에서 긴 통과 필터 (700 ㎚) 및 출사 광 V의 m 채널에서 방출 된 광을 필터 (40분의 585 ㎚). </li><li> 두 개의 CCD 카메라 (; RedShirt 이미지 80 X 80 픽셀, 1000 FPS)를 사용하여 필터링 된 형광 빛을 수집합니다. </li><li> 염료 광표백을 방지하기 위해, 노광 시간을 제한하기 위해 각 시야마다에 2 초 미만에 대한 기록을 만든다. 여기에, 일반적으로 이미지를 각각의 단층에 대 한 4 개의 서로 다른 영역. </li></ol></li></ol> V m 또는 칼슘 녹음 5. 데이터 처리 <ol><li> 모두 V의 m 및 CA 신호 (80 X 80 픽셀)의 경우, 배경 잡음을 줄이기 위해 다른 기록 시점에서 1 휘도 값으로 강도 스물 다섯 (5 × 5)의 값이 인접한 화소의 평균. 주 : 데이터를 평균화 한 후, 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 각 기록 시점 평균화 × 16 16 강도 값들을 평균화 포함하는 데이터 매트릭스 (수득50 ㎛의 공간 해상도와 데이터 채널). </li><li> V m의 기록 또는 CA 신호의 활성화 시간 (AT)를 정의. <ol><li> 전술 한 바와 같이 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 활성화 시간 (AT)를 정의하기 위해, V의 m 또는 주문품 MATLAB 기반 알고리즘을 사용하여 칼슘 신호의 피크 진폭의 50 %의 시간을 결정한다. (12) </li><li> 수동으로 프로그램 분석 중 발생할 수있는 오류를 제거하기 위해 분석의 AT를 교정. </li><li> 행렬에서 정의 저장소 사용되는 소프트웨어에 각각 기록 된 활동 전위 칼슘 과도의 (16 × 16 데이터 채널 평균). </li></ol></li><li> 이전에 약간의 수정과 함께 설명 된 바와 같이 12, 18, ​​20, 22 필드 벡터 분석 방법을 사용하여 AT 행렬에 활동 전위 또는 칼슘 과도 전도 속도 (CV) 벡터를 계산한다. <ol><li> (5 × 데이터를 그 지점에서 주변에 데이터 채널의 상대적인 CV 벡터를 계산; 도 5는 이웃 MATLAB 프로그램 (12, 18) 내에서 최소 제곱 알고리즘을 이용하여) 표면 AT 활성화 시간 (다항식의 매끄러운 표면을 시뮬레이션하기 위해) 데이터 채널을 평균화. </li><li> 아래의 수식을 사용하여 전도 벡터를 계산 포뮬러 1 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> 화학식 2 : θ θ를 (DY / dT를) / (DX / dT를)] 주 : Ve로는 X 축 및 Y 축에 투영 CV 벡터이고; DX / dT를는 X 축에 CV 벡터의 투영이고; DY / dT를는 Y 축에 CV 벡터의 투영이다. T는 AT면이고; X, Y 좌표의 2-D 참조; X = T ∂T / ∂x는 X에 대해 T의 편미분이고; T의 Y = ∂T / ∂y는 Y에 대하여 T의 편미분이고; CV θ는 벡터의 최종 방향이다. </li><li> 나침반에 10도 섹터를 커버 각각 36 경로,에 AT 행렬의 그룹 모든 벡터. &lt;/ 리&gt; <li> (36) 전도 경로 중 CV 벡터의 최대의 인구를 포함하는 경로를 선택합니다. 단일 층의 CV를 나타 내기 위해이 경로의 평균 CV를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 웨이브 프론트 전파 6. 시각화 <ol><li> MATLAB 소프트웨어를 사용하여 피크 값에 대해 상이한 기록 된 시점에서 각각의 활동 전위 또는 CA 과도의 신호 강도를 정규화한다. </li><li> 일시적 사용 MATLAB 소프트웨어의 16 × 16 매트릭스의 강도에 기록 된 모든 시점의 정규화 된 강도 데이터를 저장한다. </li><li> surf.m 기능을 사용하여 각 기록 시점의 저장 강도 매트릭스에서 색상 코딩 된 강도 맵을 구축합니다. 참고 : 강도지도에서 빨간색 V m 또는 칼슘 신호의 높은 강도를 나타내며, 파란색 형광 신호의 낮은 강도를 반영한다. </li><li> avifile.m 기능을 사용하여 .avi 파일을 만듭니다. </li><li> 모든 I 절감addframe.m 함수를 사용하여 활동 전위 또는 CA 과도 상이한 기록 시점에서지도 ntensity. 주 :이 시점에서, V의 m 및 CA 전파 개의 분리 AVI 파일이 생성 될 것이다. </li></ol>

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이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다. 성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균일하게 세포를 분산해야합니다. 이 가장 전기 페이싱에 응답으로 항상 완벽하게 성장하고 완전하게 융합 세포 단일 층을 매핑합니다. 이는 염료를로드하는 동안 산소 세포를 유지하는 것도 중요하지만, 산소 버블이 죽이거나 커버 슬립에서 그들을시키다 수 있으므로 셀과 직접 접촉해서는 안된다. 염료 concentrati을 증가시키면서, 염료 농도를 낮추고 신호 크기를 감소시키고 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 것이다 광 강도를 감소온 신호 크기를 증가시킬뿐만 아니라, 소음을 증가 광 강도를 강화. 이 때문에, 형광 염료의 농도 및 여기 광 강도의 균형이 최적의 기록 신호의 신호 대 잡음 비를 향상시키기 위해 결정되어야한다. 이 빛에 노출 지역에서 광역 세포 손상의 원인이 될 수 또한, 광학 매핑을 촬영하는 동안 진한 빛의 장시간 노출로 세포 단층에 노출되지 않도록해야합니다. 마지막으로 기록 된 신호의 높은 공간적 해상도를 제공 광학 매핑 시스템은 고품질의 데이터를 얻기 위해 필요하다. 그대로 하트 듀얼 채널 광 매핑 인해 동시 콜렉트 전압 및 칼슘 신호하는 능력에 심장 전기 생리학 연구를위한 큰 잠재력을 가지고 있지만, 하나의 제한은이 기술은 2-D 투사 맵으로 3-D 표면으로부터 정보를 수집하는 것이다. 3-D의 curvat의 정보를 그대로 무시 마음에서 얻어진 2-D 데이터데이터가 특히 전도 속도의 분석, 분석에 마음의 올바 오류가 발생할 수 있습니다. 배양 2-D의 HL-1 세포 모델을 사용의 이점과 함께, 우리는 (균일하거나 비를, 정규 및 비정규 리듬을 시각화 칼슘 과도 활동 전위 동력학을 평가 전도 속도를 결정하고, 캘리포니아 및 활동 전위 전파 패턴을 특성화 할 수있다 그대로 심장의 3-D 구조로부터 간섭없이 균일 전파). 따라서 성공적으로 무료 방법으로 배양 된 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 칼슘 과도 및 활동 전위를 모두 매핑 크게 심방 근육 세포의 전기 생리 특성 및 심방 arrhythmogenesis의 기본 메커니즘의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다. 배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다. 이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 dry powder</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.

영화 1에서 입증 된 바와 같이 배양 합류 단층는 일반 고유 리듬을 나타낸다. 우리는 다음 완전히 합류 HL-1 단층에서 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑을 수행 하였다. 그림 1a는 기록 하나에서 V의 m과 칼슘 신호의 예 흔적을 보여줍니다 이길. 균일하게 전파 V의 m 및 듀얼 채널 광 매핑 시스템을 이용하여 칼슘 신호의 대표적인 등시성지도는도 1b 및도 1c에 도시되어있다. 균일 활동 전위 전파 및 CA 과도의 대표적인 이미지는 연대순 동일한 HL-1 단층 배양에서 얻었다. 마지막으로, 영화 2와 3은 HL-1 융합 단층에 균일하게 전파 활동 전위 (영화 2) 칼슘 과도 (동영상 3)의 애니메이션 예를 제공합니다. -page = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52542/52542fig1highres.jpg" /> 그림 1 : (A) 500 밀리의 사이클 길이 (CL)에 전기적 속도로 비트에서 V의 m (파란색)과 칼슘 (빨간색)의 예 추적. (B) HL-1 단일 층에 대한 우리의 광학 매핑 시스템의 이미지입니다. (C) 전체 비전 분야에 걸쳐 같은 속도로 비트에서 활동 전위의 전파 등시의지도. (D) 비전 분야에 걸쳐 같은 속도로 비트에서 칼슘 과도 전파 등시의지도. 모두 등시의지도에서, 시간 경과 50 밀리 초에서 시작과 어두운 붉은 어두운 파란색으로 시작, 색상으로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/52542fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> /52542/52542fig2highres.jpg &quot;/&gt; 그림 2 : (A)의 60 V의 m 분포지도 시리즈, 80, 140, 및 기록의 시작 후 200 밀리. (B)는 60 ℃에서의 칼슘 분포지도, 80, 140, 및 기록의 시작 후 200 밀리. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/looped HL-1 7-20-14.avi">영화 1 :</a> 40X의 목적으로 광학 현미경, 문화의 날 5시에 합류 HL-1 단일 층에서 기록 된 대표적인 영화. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/vm 07_21_14 jy.avi">영화 2</a> : 500 밀리의 CL의 속도로 비트에서 전파 활동 전위의 대표 영화. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/ca 07_21_14 jy.avi">영화 3</a> : PAC에서 전파 된 칼슘 과도의 대표적인 영화ED는 500 밀리의 CL에서 이겼다.

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K 조회수.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

연구

생체공학

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

생물학

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

의학

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

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