Name: optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

동물과 관련된 모든 절차는 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 건강의 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 부착했다. 1. 준비 <ol><li> 4 ° C에서 사전 및 저장소에 수정 된 타이로드의 솔루션의 두 집중 (25X) 주식을 준비한다 : (1) 주식 I (MM에서 : 염화나트륨 3205, 염화칼슘 2 32.5, KCl을 117.5,의 NaH 2 PO 4 29.75,의 MgCl 2 26.25) 및 (2) (MM의 :의 NaHCO3 500) 주식 II. <ol><li> (DI)을 염화나트륨 128.2, CaCl2를 1.3의 KCl 4.7의 MgCl 2 1.05의 NaH 2 PO 4 1.19의 NaHCO3 (20) 및 탈 이온수 1840 ㎖에 결합하여 11.1 글루코스 : 갓 (㎜)에하기 조성의 2 L 타이로드의 용액을 제조 물 80 ml의 스톡 I, II의 스톡 80 ㎖, 및 글루코스 4g. 직접 주식 나는 그리고 스톡 II를 함께 사용하지 마십시오 추가1,840 ml의 DI에 m은 침전을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 사전에 10 mg을 무수 디 메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 / ㎖에서 여기 수축 uncoupler의 blebbistatin의 주식 솔루션을 준비하고 4 ℃에서 원액을 저장합니다. </li><li> 형광 염료의 스톡 용액을 제조한다 : (1) 전압에 민감한 염료 RH237 (DMSO에 1 ㎎ / ㎖), (2) 낮은 친 칼슘 지시등 FLUO-5N AM 제조자의 권장 사항에 따라 (DMSO 2 ㎎ / ㎖)를. 적재 능력의 후속 손실 분해를 방지하기 위해 즉시 준비를 사용합니다. </li><li> 프라임 산소화 함께 재순환 랑겐 돌프 관류 시스템 (95 % O 2, 5 % CO 2)의 타이로드 용액. 7.4 ± 0.05의 타이로드 용액의 pH를 유지하기 위해, O2 / CO (2)의 흐름을 조정한다. 지속적으로 관류를 필터링 : 인라인 나일론 짠 그물 필터 (11 μm의 기공 크기)를 사용합니다. <ol><li> 이후 loadi으로 실온에서 국무 관류 시스템,FLUO-5N 오전 NG 실온에서 수행됩니다. FLUO-5N 오전 로딩, 순환 관류의 작은 볼륨 (~ 150 ㎖)를 사용합니다. 염료로드 한 후, 관류의 더 큰 볼륨 사용 (1-2 패, 그림 1C 참조). </li></ol></li><li> 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 심전도 및 관류 압력을 지속적으로 모니터링 준비합니다. 압력 모니터링 시스템을 준비합니다 관류 라인에 압력 변환기를 연결하고 transbridge 앰프 관류 압력을 모니터링 할 수 있습니다. 심장이 관류 시스템에 연결되지 않은 경우 0 mmHg로 기준선 관류 압력을 조정합니다. </li><li> V 분 및 SR 칼슘 신호 사이의 공간 정렬을 보장하기 위해 광학 매핑 카메라를 맞 춥니 다. <ol><li> 첫째, 통치자 또는 관류 접시에 텍스트 개체를 배치하여 카메라 초점을 맞 춥니 다. 라이브 뷰 모드로 매핑 카메라를 켜고 텍스트가 선명하고 선명해질 때까지 초점을 조절합니다. 각각의 카메라로부터 하나의 프레임 화상을 취득. </li><li> 오버레이두 이미지가 볼 수 있도록 이러한 이미지 및 상단 이미지의 투명도를 조정합니다. 이미지의 텍스트가 정확히 겹쳐한다. 완벽하게 정렬되지 않은 경우 두 이미지가 정렬 될 때까지, 다이크로 익 미러 또는 각 카메라의 위치의 각도를 조정한다. </li></ol></li></ol> 토끼 심장의 2. 수확, 관류, 그리고 염료 로딩 <ol><li> 승인 된 토끼 제한 수단의 토끼를 고정합니다. 깊이 펜 토바 비탈 나트륨 (50 mg / kg) 및 헤파린 (1000 IU)의 정맥 내 주사 (귀 가장자리 정맥)을 통해 마취. <ol><li> 토끼가 표시 침해 반사 신경이 부족하면, 중간 선 피부 절개는 흉골과 갈비뼈를 노출 할 수 있습니다. 흉골에 xyphoid에서 무딘 팁 수술 가위로 흉골을 통해 잘라. 흉골을 여는 동안 심장이 손상되지 않도록주의하십시오. 마음을 노출 갈비뼈를 확산. </li><li> 빠르게 빠르게 모든 선박과 결합 조직을 절단하여 전체 심장 - 폐 블록은 절제. 최단 당일tely 얼음처럼 차가운 타이로드의 용액에 심장 - 폐 블록을 배치합니다. </li></ol></li><li> 역 행성 관류의 대동맥을 찾습니다. 대동맥 궁의 세 가지에 바로 인접 상행 대동맥을 잘라. 관류 시스템에 연결 8 G 캐 뉼러에 대동맥 Cannulate. 캐 뉼러에 대동맥을 확보하기 위해 USP 0 실크 봉합사의 조각을 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 마음에서 기관, 폐 및 심 외막 지방을 해부하다. 날카로운 집게 및 해부 가위, 승모판의 위치를​​주의 깊게 손상 또는 좌심실에서 솔루션 혼잡을 방지하기 위해 하나의 전단지를 제거합니다. </li><li> 이미징이 위를 향하도록 마음의 전방 표면과 수평으로 유리 외피 관류 실에 마음을 담근다. 매핑 (그림 1D) 동안 마음의 움직임을 방지하기 위해 접시의 실리콘 바닥에 U 자형 핀 실 가드의 조각에 캐 뉼러를 고정합니다. 원하는 경우, STA에 대한 심장의 정점에 작은 곤충 핀을 삽입bilization. </li><li> 위치 심전도 (ECG) 심장의 오른쪽과 왼쪽에 목욕 전극. 완전히 욕 전극 잠수함 그들이 리드 I 구성으로 부피가 유사한 실시 ECG 제공 심장 표면과 접촉하지 않는 보장. 보통의 리드 나는 심전도 형태를 확인합니다. 70 mmHg로 - 대동맥 압력이 60으로 유지 될 수 있도록 - (35 ml / 분 25) 흐름을 조정합니다. </li><li> 실내 조명을 끄고 0.3 추가 - 관류 (- 20 μm의 최종 농도 10)에 blebbistatin 주식 솔루션 (단계 1.2)의 0.6 ml에. <ol><li> blebbistatin의 photoinactivati​​on을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. 필요한 경우, 소형 스포트 또는 전조등은 작업 조명을 제공하기 위해 사용될 수있다. 주 :이 Blebbistatin 미오신 ATP 아제 억제제 및 여진 수축 uncoupler이다. 심장 에너지 생산이 손상 될 수있다 - FLUO-5N 로딩 확장 (60 분), RT (저체온증) 조건을 요구하기 때문에 (2.10 단계 2.8 참조). 목erefore, 관류 종래에 blebbistatin 첨가 에너지 수요 (16)을 감소시키고 후속 광학 레코딩 17 동안 모션 아티팩트를 제거 할 수있다 로딩 염료. </li></ol></li><li> 심장의 수축이 중단되면 (10 - 대동맥 압력 기록에 대한 확인 15 분), 작은 볼륨 순환 관류 시스템 (단계 1.4.1 참조)로 전환합니다. </li><li> 준비하고 FLUO-5N 오전 로딩 솔루션을로드 : 0.25 ml의 따뜻한 20 % 플루로 닉 F127에 FLUO-5N 오전 원액 (1.3 단계)의 0.25 ML을 추가합니다. 0.5 ml의 혼합물에 따뜻한 타이로드의 솔루션을 추가 잘 혼합하고, 소량 순환 관류 시스템에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 연속적으로 관류 압력 및 ECG를 모니터하고 필요하다면 흐름을 조절한다. 염료 로딩은 실온에서 약 1 시간 소요됩니다. 로딩 후 45 분, 37 ℃로 관류 시스템 및 관류를 따뜻하게 시작 순환 물 목욕을 켜 시작했다. </li><li> FLUO-5N 오전 로딩, SWI의 60 분 후큰 부피 재순환 관류 시스템에 관류 TCH (단계 1.4 참조). </li><li> 따뜻한의 타이로드 액 1ml에 전압 감응 염료 RH237 원액 (단계 1.3) 50 μL를 희석하고 캐뉼라에 주입구 근위로 (~ 5 분에 걸쳐)을 천천히 부가. </li></ol> 3. 광학 매핑 <ol><li> 염료로드의 마지막 순간 동안, 마음을 놓고 실험에 대한보기의 해당 필드를 보장하기 위해 광학 매핑 카메라 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 원하는 경우, 페이싱에 대한 마음의 심​​ 외막 표면에 양극 페이싱 전극을 배치합니다. </li><li> 인해 관류의 재순환에 존재할 수있는 액체의 표면에 동 잡음을 줄이기 위해 관류 챔버의 표면에 플라스틱이나 유리 커버 슬립을 배치했다. 주 : 커버 슬립에 대한 대안이 깨끗한 플라스틱 50mm 페트리 접시 덮개를 사용할 때. </li><li> 균일 전자와 마음의 표면을 조명 빛 가이드를 초점xcitation 빛. 495 nm의 대역 통과 필터 (도 1a) - 청색 발광 다이오드 (LED) 광원을 사용하여 상기 (475)로 광을 필터링. </li><li> macroscope 두 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS) 광학 매핑 카메라와 방출되는 형광을 수집합니다. 545 nm에서 이색 거울 방출 된 빛을 분할합니다. <ol><li> 롱 패스는 700 nm에서, V의 m 신호를 포함하는, 긴 파장 부분을 필터링. 534 나노 미터 (도 1A) - 밴드 패스 (502)에서, SR 칼슘 신호를 포함하는, 단파장 잔기 필터. 1 kHz에서 - 0.5 광 데이터 수집의 빈도를 설정합니다. </li></ol></li><li> 각각의 광 기록, 처음으로, 원하는 페이싱 프로토콜을 시작 여기 광을 켜고 1 수집 - 데이터의 4 초. 필요한 경우, 페이징 프로토콜 및 데이터 획득을 동기화. 주 : 것은 불가능 FLUO-5N AM, 따라서 신호 대 잡음비 (SNR)를 재 로딩한다 decrea자체 SR에서 누출 염료에 의한 실험을하는 동안. 높은 SNR 값을 보장하기 위해 2 시간 - 1 실험 프로토콜을 제한합니다. </li><li> 실험 후, 탈 이온수로 다시 DI 물, 70 % 알코올 시약의 순차적 관류 시스템을 씻어. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지를 이용하여 공간 가우시안 필터 (반경 3 픽셀)를 각 데이터 세트를 필터링. </li><li> 필요한 경우, 공간적으로 V의 m 및 SR 칼슘 2 + 데이터 세트를 맞 춥니 다. 단계 1.6에서와 같이, 각각의 카메라에서 이미지를 중첩되는지 확인보기 (즉, 정맥, 페이싱 전극)의 분야에서 심장의 해부학 적 구조 (즉., 관상 동맥 혈관, 심방의 가장자리 또는 심실) 또는 기타 항목을 정확하게 중복. 그렇지 않은 경우, 데이터 세트의 공간 배치가 필요하다. </li><li> 화소 번호를 기록하게 정확한 오버랩까지 X 축 및 Y 방향이 달성에 상부 투명 이미지를 이동이미지는 각 방향으로 이동해야합니다. 상부 이미지 (V m 또는 SR 칼슘 하나)에 대응하는 전체 데이터 세트는 V의 m 및 SR 칼슘 2 데이터 세트 사이의 정확한 정렬을 보장하기 위해, 각 방향의 화소 수만큼 시프트 결정되어야한다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

성공적인 FLUO-5N 염료 로딩 키 염료 대량의 로딩 시간 (1 시간)의 길이에 대한 필요없이 높은 FLUO-5N 농도 허용 소량 재순환 관류 셋업하고, 로딩을 수행 실온에서. 로딩 빠르게 생리 온도, 셀룰러 절단 효소 활성 염료 세포질에서 염료 분자를 포착하고이를 SR 세포막을 통과 할 수없는, 세포막을 통과 -AM 태그에서 수행되는 경우. RT에서, 그러나, 효소 활성은 둔화되고 -AM 태그 전에 세포막과 SR 막 모두를 교차 할 수 염료 충분량 SR에 염료를 포착, 절단된다. 심지어 최적의 하중 조건으로, 그러나, 신호 진폭이 접근 분수 형광 변화 (ΔF / F)는 높은 친 화성 염료와 V (m)의 전통적인 광학 매핑 및 세포 내 칼슘보다 낮은 것. 예를 들어, LED를 여기 광, 거시적 목적, 큰 필터와 다이크로 익 미러 (5 cm × 5 cm)에, 그리고 CMOS 카메라, 분수 형광 변화 이루어져 여기서 사용되는 광 설정으로 (ΔF / F) (1)의 순서에있는 RH237 신호 (15)에 대한 3 % - - FLUO-5N 신호와 2 2 %. 분수 형광은 물론, 특정 광학 구성, 광원, 및 특정 설치의 카메라에 달려 있지만, 심지어 최적 조건 FLUO-5N 신호는 전형적으로 세포 내 칼슘의 레코딩에 대해 관찰 된 것보다 상당히 낮다 2+ 높은 친 화성 염료. 녹색 (545 ​​㎚), 여기 광 (18)을 사용하는 경우 루비로드 -2- 30 % - 예를 들어, 같은 설정에 ΔF / F가 20 정도이다. 5 % - 그린 여기 광도 RH237의 여기 피크에 근접하므로 RH237의 ΔF / F (4) 주위에,이 경우도 크다. 따라서, 그 실험실 이미 ​​V (m)의 이중 광학 매핑을 수행 </sUB&gt;과 칼슘 2 + 세포, 치료가 최대 ΔF을 보장하기 위해 광 설치의 모든 구성 요소를 최적화하기 위해주의해야한다 / FLUO-5N 신호 F. 이 방법, 연구자들은 정확하게 SR 칼슘 역학과 기존의 접근 가능하지 않은 방법으로 V 분에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, (그림 3A에서와 같이) SR 칼슘 2 + 누출의 정량적 측정 및 SR 칼슘 2 + 복구 (SR 칼슘 2 + -ATPase [SERCA] 활동의 타우 -a 측정)의 정확한 시정을 수행 할 수 있습니다. 높은 친 화성 염료 2+ 세포 내 칼슘의 광학 매핑에 대한 기존의 접근 방식을 사용하여, 이러한 측정은 (횡단 칼슘 이온 플럭스 &#39;오염&#39;할 수있다 즉., L 형의 기여 칼슘 채널과 나 + -ca 2 + 기). 또한, 높은 친화력 칼슘 2 + 지표는 본질적으로 느린 K가낮은 친화도 지표 (5)보다 inetics은, 따라서 FLUO-5N 신호는 높은 충실도와 실제 칼슘의 변화와 형광에 해당하는 변화 사이 본질적으로 시간 지연없이 정확한 SR 칼슘의 움직임을보고 할 것으로 예상된다. SR 칼슘 재 흡수 및 방출은 부정맥 현상에 기여하는 구체적인 메커니즘을 조사하는 기능이 방법의 또 다른 장점이다. 예를 들어,이 방법을 사용하여, 우리는 최근 SR 칼슘 2 + 릴리스의 내화도는 칼슘 alternans의 발병에 기여하고는 심실 세동 동안, SR 칼슘 방출이 거의 지속적으로 내화 (15) 남아있는 보도했다. 이 세동 동안 SR 칼슘 역학의 첫 번째 보고서이고 그대로 마음에 SR 칼슘 이미징의 주요 장점을 강조 : 이러한 공간적 불일치 alternans와 f와 같은 공간적으로 독특하고 복잡한 현상을ibrillation은 공부하실 수 있습니다. 불행히도, 이러한 유형의 정보 세동이 불가능하거나 단지 심장 손상 12 번의 위치에서 기록 방법에서 분리 된 세포로부터 수집 될 수 없다. 또한, V m을하고 그대로 마음에 무료 SR 칼슘의 동시 광학 매핑은 비정상적인 칼슘을 평가하는 2 + 심부전을 포함한 병리학 적 조건에서 처리하기위한 새로운 도구를 제공 할 수있다. SR 칼슘 2 + 릴리스, 이완기 SR 칼슘 2 + 누출,과 칼슘 SR 2+ 흡수의 활성화 및 종료를 포함하여 SR 칼슘 조절에 이상 - CA의 모든 주요 단계 2+ 자전거 잠재적으로 심장 마비에 변경된 모든 - 직접 공부하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 또한 안정화 RyR 19 SERCA 변조 20 소설 치료 개입의 영향을 평가하기위한 유용한 도구가 될 수있다. 2+] SR하는 정확한 농도를 형광 값을 보정하는 무능력을 포함하지만, 한계가없는 것은 아니다. 불행히도 의한 실험의 과정을 통해 SR로부터 심장, 및 포토 블리 칭과 염료 누출 곡면 염료 로딩 불균일 여기 및 발광 빛의 가변성은 극히 어렵다에 FLUO-5N 신호를 보정 할 수 있도록 그대로 마음에 정확한 [칼슘] SR. 생리적 완충 용액에 이전 체외 연구와 투과성이 고립 된 근육 세포는 교정을보고하고 FLUO-5N 형광의 변화의 변화에 비례하는 것을 나타낼 [칼슘 2 +] SR과 형광이 생리 학적으로 포화 않을 것으로 예상된다 칼슘 +] SR 수준 (11). 따라서, 연구자들은 칼슘 엄마의 방법을 선택해야합니다특정 실험 목적과 생리 학적 연구를 기반으로 pping (낮은 또는 높은 친 화성 염료).

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>For oxygenation and pH of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Excitation-contraction uncoupler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Low-affinity Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>For Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator loading; Warm until the solution is clear before use</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>For dissolving blebbistatin and dyes</td></tr><tr><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &amp;#956;m in-line filter</td></tr><tr><td>Pressure Transducer</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>For measuring perfusion pressure</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>For continuous recording of pressure and ECG signals</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optical mapping cameras</td></tr><tr><td>Precision LED Spot Light</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED light source</td></tr></tbody></table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

도 1a는 이중 V의 m 및 SR 칼슘 매핑 광학 구성의 개략도를 나타낸다. 이 설정으로, V의 m 및 SR 칼슘 신호 (그림 1B)의 전체 스펙트럼 분리가있다. FLUO-5N 염료 로딩에 사용되는 이중 루프 관류 시스템의 도면은도 1c에 도시된다.도 1d는 관류 접시 심장의 가로 방향을 나타낸다. 대표적인 V의 M과 심장의 심 외막 표면에 다른 위치에서 지속적으로 조율 중에 SR 칼슘 2 + 광학 추적은 그림 2A에 표시됩니다. 이 설정으로 뷰의 광 필드는 X 31mm 및 시야 내의 중심부의 방향이도 2b에 도시되어 31mm이다. 활성화 맵은 또한도 2b에 도시되어 있으며, 각 픽셀 (P)의 활성화 시간을 선택함으로써 구성된다등시의지도에이 값을 분양 (- V의 m 및 SR 칼슘 활성화지도 사이에 10 밀리 초 ~ 8의 전형적인 지연에주의). 중요한 것은, 이러한 AP 상승 시간 등의 주요 활동 전위 (AP) 특성이 80 % 재분극 APD (80)에서, 그리고 AP 기간 (진폭 [따른 Trise]의 10 % ~ 90 %에서), RH237로드 마음 사이에 통계적으로 차이가 있습니다 14.9 밀리 ± 1.9 밀리 초 대 14.2 밀리 ± 1.2 밀리 초와 APD 80 : FLUO-5N과에 대한 155.3 밀리 초 ± 5.8 밀리 초 대 156.9 밀리 ± 5.7 밀리 초 및 FLUO-5N은 RH237와 루비로드-2 (따른 Trise로드와 비교 루비로드-2, 각각; P 모두&gt; 0.05;. N = 8 / 그룹), 최소 FLUO-5N의 효과 나 AP 그림 2C에로드 염색을 나타내는 관찰하고 이완기 SR 칼슘의 상대적인 변화를 정량화 할 수있는 능력을 보여줍니다 2+ 부하와 수축기 SR 칼슘 2 + 릴리스는 다양한 페이싱주기 길이에 진폭이. 이러한 매개 변수 만 상대적으로 변화가 숨어 될 수있다그대로 마음에 신호의 정량화, 절대 교정 ([칼슘 2 +] SR)은 할 수 없습니다. 그림 3에 도시 된 바와 같이이 방법은, 특성화 및 병리학 SR 칼슘 처리를 정량화에 특히 유용하다. 관찰 SR에서 β 아드레날린 수용체 작용제 이소 (100 ㎚), 명확한 이완기 칼슘 누수의 응용 프로그램 (다음 빨간색 화살표, 그림 3A). 누수가 충분히 큰 경우, 칼슘은 트리거 활동 (그림 3B)를 발생할 수 있습니다 - 중재. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig1.jpg" /> 듀얼 V (m)의 매핑 및 SR 칼슘 2 +. 필요한 필터와 적절한 스펙트럼 분리 다이크로 익 미러를 포함하는 광 설치,의 (A)도. (그림 1. 시스템 설치하나 FLUO-5N 전용 (I) 또는 RH237로드 마음의 B) 영상 만 (II) V (m)의 전체 스펙트럼 분리 및 SR 칼슘 2 + 형광 신호를 나타냅니다. 예 : 여기, 엠 :. 정상 관류 및 FLUO-5N 염료 로딩을위한 이중 루프 관류 시스템의 방출 (C)도 (D) 관류 접시에 유관 심장 및 심전도 전극의 이미지.. 패널 A와 B는 왕 등. (15)의 허가를 재현. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig2.jpg" /> 그림 2. V의 m 및 SR 칼슘 연속 및 비 연속 페이싱 동안 2 + 광학 추적합니다. (A) 대표 V 분 및 SR 칼슘하기 OpticaL은 300 밀리의주기 길이의 연속 페이싱 동안 추적합니다. 신호 (B)에 나타낸 각각의 위치에서 도시된다. 일반 여기 수축 커플 링에 대한 전형적인으로 V의 m 및 SR 칼슘 활성화 시간 사이에 10 밀리 초 - ~ 8의 지연을합니다. (B)보기의 매핑 필드 내 마음의 이미지 V 분 및 SR 칼슘 2 +. (C) 이완기 SR 칼슘 부하의 변화를 보여주는 SR 칼슘 광 흔적 및 활성화지도 (흰색 화살표는 전극을 페이싱 표시) 및 SR 칼슘 2 + 릴리스의 진폭은 속도를 페이싱에 급격한 변화를 다음과 같습니다. 모든 흔적은 CL = 300 밀리 초에서 서성로 시작합니다. 레이트 페이싱하는 것은 다음 급격 CL = 500 밀리 초 (I), CL로 변화 = 400 밀리 초 (II), 또는 CL = 250 밀리 초 (III). 이상 CL에서이 시작되면 (난 - II), 큰 SR 칼슘 2 + 릴리스는, 제 1 및 이완기 SR 칼슘 (인해 더 이상 이완기 간격과 RyRs의 회복) 발생2 + 부하가 약간 새로운 정상 상태 (수평 점선)로 감소. 짧은 CL가 시작되면, 그러나, 작은 SR 칼슘 방출 진폭 새로운 정상 상태 (가로 점선)과 이완기 SR 칼슘 부하 증가 (인해 RyRs 짧은 이완기 간격 불완전한 복구에) 발생 . SR 칼슘 방출 진폭의 교대는 CL = 250 밀리 초에서 발생한다. S : 작은 방출 진폭, L : 큰 릴리스 진폭. (CL : 사이클 길이) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig3.jpg" /> 베이스 라인 (왼쪽)와 다음 중 그림 3. 이완기 SR 칼슘 2 + 누출 및 후속 트리거 된 활동. (A) 심전도, V의 M 및 SR 칼슘 흔적100 나노 미터 이소 (ISO, 오른쪽)와 치료. 이소로, 상당한 이완기 SR 칼슘 누수가 (빨간색 화살표)이 관찰된다. SR 칼슘 신호 진폭 전 및 ISO 후 정상화되었다. 중국 - 심방 노드는 두 경우 모두 CL = 300 밀리 초를 서성 수 있도록 절제되었다. (B) SR 칼슘 누수가 충분히 크다면, 그것은 초점 활동 (조기 심실 단지, PVC를)를 실행할 수 있습니다. 이 예에서, PVC를 정상 동 율동을 중단한다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.2K 조회수.  University of California Davis.  이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

연구

생체공학

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

의학

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

생물학

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑

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